Name: transformation of probiotic yeast and their recovery from gastrointestinal immune tissues following oral gavage in mice
Uploaded: 2016-02-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice at JoVE.com

Författarna erkänner finansiering genom Barnens Centrum för immunologi och vacciner och en NIH New Innovator Award (1DP2AI112242-01) tilldelas Tracey J. Lamb. Författarna tackar också Natalya P. Degtyareva för generöst bidrag av rad1 S. cerevisiae.

1. UV-mutagenes för att generera auxotrof jäststammar <ol><li> Generera överlevnadskurvor för att bestämma korrekt dos av UV-bestrålning <ol><li> Förbered YPD (jästextrakt pepton dextros) media och andra reagens som anges i tabell 1 enligt standardprocedurer 26 och ympa enskilda kolonier i 5-10 ml YPD medium. Inkubera kulturer på en rulltrumma vid 30 ° CO / N till mättnad under minst åtta timmar. </li><li> Bestämma cellkoncentration av O / N odlingar med använ...

<ol>
	<li>Edwards-Ingram, L., Gitsham, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+and+physiological+characterization+of+Saccharomyces+boulardii,+the+probiotic+strain+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Genotypic and physiological characterization of Saccharomyces boulardii, the probiotic strain of Saccharomyces cerevisiae.</a> Applied and environmental microbiology. 73 (8), 2458-2467 (2007).</li><li>Hudson, L. E., Fasken, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Heterologous+Protein+Expression+by+Genetically+Engineered+Probiotic+Yeast+Saccharomyces+boulardii.">Functional Heterologous Protein Expression by Genetically Engineered Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii.</a> PloS one. 9 (11), 1-12 (2014).</li><li>Guthrie, C., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology, Volume 149: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. , (1991).</li><li>DiCarlo, J. E., Norville, J. E., Mali, P., Rios, X., Aach, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+CRISPR-Cas+systems.">Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.</a> Nucleic acids research. 41 (7), 4336-4343 (2013).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nature biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Lorenz, M. C., Muir, R. S., Lim, E., McElver, J., Weber, S. C., Heitman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+disruption+with+PCR+products+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Gene disruption with PCR products in Saccharomyces cerevisiae.</a> Gene. 158, 113-117 (1995).</li><li>Hamedi, H., Misaghi, A., Modarressi, M. H., Salehi, T. Z., Khorasanizadeh, D., Khalaj, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+Uracil+Auxotroph+Strain+of+the+Probiotic+Yeast+Saccharomyces+boulardii+as+a+Host+for+the+Recombinant+Protein+Production.">Generation of a Uracil Auxotroph Strain of the Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii as a Host for the Recombinant Protein Production.</a> Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5 (1), 29-34 (2013).</li><li>Hinnen, A., Hicks, J. B., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast.">Transformation of yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (4), 1929-1933 (1978).</li><li>Hashimoto, H., Morikawa, H., Yamada, K., Kimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+transformation+of+intact+yeast+cells+by+electroinjection+of+plasmid+DNA.">A novel method for transformation of intact yeast cells by electroinjection of plasmid DNA.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 21, 336-339 (1985).</li><li>Becker, D., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transformation+of+yeast+by+electroporation.">High-efficiency transformation of yeast by electroporation.</a> Methods in Enzymology, Volume 149: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. , 182-187 (1991).</li><li>Benatuil, L., Perez, J. M., Belk, J., Hsieh, C. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+yeast+transformation+method+for+the+generation+of+very+large+human+antibody+libraries.">An improved yeast transformation method for the generation of very large human antibody libraries.</a> Protein engineering, design &amp; selection : PEDS. 23 (4), 155-159 (2010).</li><li>Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+intact+yeast+cells+treated+with+alkali+cations.">Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations.</a> Journal of Bacteriology. 153 (1), 166-168 (1983).</li><li>Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Saccharomyces+cerevisiae+and+other+fungi:+methods+and+possible+underlying+mechanism.">Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi: methods and possible underlying mechanism.</a> Bioengineered bugs. 1 (6), 395-403 (2010).</li><li>Zheng, H. Z., Liu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+transformation+process+studied+by+fluorescence+labeling+technique.">Yeast transformation process studied by fluorescence labeling technique.</a> Bioconjugate Chemistry. 16, 250-254 (2005).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+yeast.">Genetic transformation of yeast.</a> BioTechniques. 30 (4), 816-831 (2001).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ELISA+Method.+.">The ELISA Method. .</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2015).</li><li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblot+analysis.">Immunoblot analysis.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (16), (2008).</li><li>Horn, C. C., Kimball, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+Can't+Rodents+Vomit?+A+Comparative+Behavioral,+Anatomical,+and+Physiological+Study.">Why Can't Rodents Vomit? A Comparative Behavioral, Anatomical, and Physiological Study.</a> PLoS ONE. 8 (4), (2013).</li><li>Hoggatt, A. F., Hoggatt, J., Honerlaw, M., Pelus, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spoonful+of+sugar+helps+the+medicine+go+down:+a+novel+technique+to+improve+oral+gavage+in+mice.">A spoonful of sugar helps the medicine go down: a novel technique to improve oral gavage in mice.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 49 (3), 329-334 (2010).</li><li>Johnson, M., Shayne, C. G., Kemper, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rat.">The rat.</a> Animal Models in Toxicology. , 50-193 (2006).</li><li>Brown, A. P., Dinger, N., Levine, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+produced+by+gavage+administration+in+the+rat.">Stress produced by gavage administration in the rat.</a> Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 39, 17-21 (2000).</li><li>Jacoby, R., Fox, J., Davisson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+diseases+of+mice.">Biology and diseases of mice.</a> Laboratory animal medicine. , 35-133 (2002).</li><li>Schulz, O., Pabst, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+sampling+in+the+small+intestine.">Antigen sampling in the small intestine.</a> Trends in immunology. 34 (4), 155-161 (2013).</li><li>McDole, J. R., Wheeler, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Goblet+cells+deliver+luminal+antigen+to+CD103++dendritic+cells+in+the+small+intestine.">Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine.</a> Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).</li><li>Farache, J., Koren, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminal+bacteria+recruit+CD103++dendritic+cells+into+the+intestinal+epithelium+to+sample+bacterial+antigens+for+presentation.">Luminal bacteria recruit CD103+ dendritic cells into the intestinal epithelium to sample bacterial antigens for presentation.</a> Immunity. 38 (3), 581-595 (2013).</li><li>Burke, D., Dawson, D., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. , (2000).</li><li>Boeke, J. D., LaCroute, F., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+positive+selection+for+mutants+lacking+orotidine-5'-phosphate+decarboxylase+activity+in+yeast:+5-fluoro-orotic+acid+resistance.">A positive selection for mutants lacking orotidine-5'-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance.</a> Molecular &amp; general genetics : MGG. 197 (2), 345-346 (1984).</li><li>Chattoo, B. B., Sherman, F., Azubalis, D. A., Fjellstedt, T. A., Mehnert, D., Ogur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+lys2+mutants+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+by+the+utilization+of+alpha-aminoadipate.">Selection of lys2 mutants of the yeast Saccharomyces cerevisiae by the utilization of alpha-aminoadipate.</a> Genetics. 93, 51-65 (1979).</li><li>Toyn, J. H., Gunyuzlu, P. L., White, W. H., La Thompson, ., Hollis, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+counterselection+for+the+tryptophan+pathway+in+yeast:+5-fluoroanthranilic+acid+resistance.">A counterselection for the tryptophan pathway in yeast: 5-fluoroanthranilic acid resistance.</a> Yeast. 16 (6), 553-560 (2000).</li><li>Singh, A., Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+physiological+characterization+of+met15+mutants+of+Saccharomyces+cerevisiae:+a+selective+system+for+forward+and+reverse+mutations.">Genetic and physiological characterization of met15 mutants of Saccharomyces cerevisiae: a selective system for forward and reverse mutations.</a> Genetics. 81, 75-97 (1975).</li><li>Singh, A., Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+relationships+of+mercury+resistant+mutants+and+methionine+auxotrophs+of+yeast.">Characteristics and relationships of mercury resistant mutants and methionine auxotrophs of yeast.</a> Journal of Bacteriology. 118 (3), 911-918 (1974).</li><li>McCoy, S. L., Hausman, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+DNA+binding+to+cell-surfaces+by+flow+cytometry.">Quantification of DNA binding to cell-surfaces by flow cytometry.</a> Journal of Immunological Methods. 241, 141-146 (2000).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+transformation+of+intact+yeast+cells+by+the+LiAc/SS-DNA/PEG+procedure.">Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure.</a> Yeast. 11, 355-360 (1995).</li><li>Zhang, Z., Chisti, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid+stability+in+recombinant+saccharomyces+cerevisiae.">Plasmid stability in recombinant saccharomyces cerevisiae.</a> Science. 14 (4), 401-435 (1996).</li><li>Lorang, J. M., Tuori, R. P., Martinez, J. P., Sawyer, T. L., Redman, R. S., Rollins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+Fluorescent+Protein+Is+Lighting+Up+Fungal+Biology.">Green Fluorescent Protein Is Lighting Up Fungal Biology.</a> Applied and Environmental Microbiology. 67 (5), 1987-1994 (2001).</li><li>Thompson, J. R., Register, E., Curotto, J., Kurtz, M., Kelly, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+the+preparation+of+yeast+cells+for+transformation+by+electroporation.">An improved protocol for the preparation of yeast cells for transformation by electroporation.</a> Yeast. 14, 565-571 (1998).</li><li>Damsch, S., Eichenbaum, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gavage-related+reflux+in+rats:+identification,+pathogenesis,+and+toxicological+implications+(review).">Gavage-related reflux in rats: identification, pathogenesis, and toxicological implications (review).</a> Toxicologic pathology. 39, 348-360 (2011).</li><li>Desai, M., Labhasetwar, V., Amidon, G., Levy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+uptake+of+biodegradable+nanoparticles:+effect+of+particle+size.">Gastrointestinal uptake of biodegradable nanoparticles: effect of particle size.</a> Pharma. 13 (12), (1994).</li><li>Shakweh, M., Ponchel, G., Fattal, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+uptake+by+Peyer's+patches:+a+pathway+for+drug+and+vaccine+delivery.">Particle uptake by Peyer's patches: a pathway for drug and vaccine delivery.</a> Expert opinion on drug delivery. 1 (1), (2004).</li><li>Szymanski, E. P., Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+yeast+protein+extraction+and+purification+for+the+study+of+function,+interactions,+and+post-translational+modifications.">Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (80), e50921 (2013).</li><li>Hashimoto, S., Ogura, M., Aritomi, K., Hoshida, H., Nishizawa, Y., Akada, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Auxotrophic+Mutants+of+Diploid+Industrial+Yeast+Strains+after+UV+Mutagenesis.">Isolation of Auxotrophic Mutants of Diploid Industrial Yeast Strains after UV Mutagenesis.</a> Applied and environmental microbiology. 71 (1), 312-319 (2005).</li></ol>

Tillsammans protokollen häri beskriver de väsentliga åtgärder som är nödvändiga för utveckling och testning av auxotrofa probiotiska jäststammar för leverans av heterologt terapeutiskt protein till tarmen. Denna manipulation och testning av rekombinant probiotiska jästen kräver metoder och resurser som ett enskilt laboratorium för närvarande inte kan vara bekant. Sålunda, även om ett stort antal tidigare studier har beskrivit de ovanstående protokoll för multipla jäst och musstammar, dessa metoder har...

Probiotiska mikroorganismer är en spännande potentiella medel för effektivt och ekonomiskt att leverera heterologa proteiner till mag-tarmkanalen. Dessa organismer är kapabla att överleva passagen genom mag-tarmkanalen ännu inte kolonisera det en som möjliggör kontrollerad dosering och begränsa exponering för läkemedlet uttryckt. Dessutom möjlighet att enkelt konstruera dessa organismer för att producera heterologt protein i stor skala gör dem ett ekonomiskt alternativ till syntetiska leveranspartiklar. Men utvecklingen av en sådan strategi, som nyligen visat med hjälp av en auxotrof stam av probiotiska jästen Saccharomyces boulardii 2, kräver kunskap om laboratorietekniker inte traditionellt kombineras inom en given studie, från jäst och molekylärbiologi till djurhantering tekniker och immunologiska metoder. Således även om de enskilda förfaranden som beskrivs häri är inte i sig romanlaboratorieprotokoll, är målet för detta manuskript att presentera en enhetlig introduktion till tekniker som behövs för experimentell testning av probiotiska jäst som läkemedelsleveransfordon till den murina mag-tarmkanalen. Förutsatt är en sammanställning av viktiga protokoll för: 1) generering av auxotrofa mutantjäststammar som lätt kan genmanipulerade; 2) transformation av jästkulturer för att uttrycka heterologt protein; 3) administrering av rekombinant jäst till tarmen via oral sondmatning; och 4) återvinning av livskraftiga rekombinant probiotiska jäst från mus tarm och bedömning av deras heterologt proteinuttryck. Först, även om många positiva och negativa urvalsmetoder finns för manipulering av jästarter, ökar negativ selektering, såsom genom användning av auxotrofa markörer både effektivitet och lätthet med vilken jäst kan transformeras och väljas. Positiv selektering av transformanter med användning av antibiotika, i samarbetentrast, signifikant ökar kostnaden för jäst manipulation. Dessutom kan valet av jäst på antibiotikainnehållande fasta medier möjliggör ökad tillväxt av otransformerade bakgrundskolonier i förhållande till val av auxotrof jäst på syntetiskt avhoppen fasta medier (opublicerade observationer). Auxotrofa jäst är stammar som saknar enzymer kritiska för syntes av essentiella aminosyror eller uracil. En sådan jäst kan växa endast om kompletteras med den saknade metabolit eller metabolisk gen, så att negativa val när jäst ströks ut på syntetisk hoppar media som saknar den väsentliga metaboliten. Många vanliga Saccharomyces cerevisiae laboratoriestammar är i själva verket redan auxotrofa mutanter 3. Industrial, klinisk och probiotiska jäststammar är emellertid typiskt prot med förmågan att syntetisera alla nödvändiga näringsämnen. För att möjliggöra en effektivare genetisk manipulation av sådan jäst kan auxotrofa gener selektivt riktadeatt generera stammar som kan väljas utan antibiotika. Särskild inriktning på auxotrofa markörgener kan uppnås genom PCR-medierad gen störningar förlitar sig på homolog rekombination eller mer nyligen genom crispr / Cas9 inriktning 4-6. Alternativt kan UV-mutagenes snabbt generera auxotrofa mutanter även i jäststammar som transformation med flera plasmider är tekniskt svårt 7. Medan PCR inriktning och crispr / Cas9 har beskrivits utförligt på annat håll, som presenteras i del ett av detta manuskript är ett detaljerat protokoll som beskriver en UV-mutagenes strategi för att skapa auxotrofa stammar som gör det möjligt för negativt urval snarare än positiv antibiotikaselektion av jästtransformanter. Nästa nödvändigt steg vid användningen av sådana auxotrofa stammar för oral tillförsel av heterologt protein är jäst transformation med plasmid-DNA. Sedan den första framgångsrika omvandlingen av yeast sfäroplaster rapporterats för Saccharomyces cerevisiae 1978 8, har ett flertal modifieringar präglats för att öka effektiviteten och lätthet med vilken jästarter kan vara genetiskt modifierade. Användning av elektroporering för en framgångsrik omvandling av DNA i S. cerevisiae beskrevs första gången 1985 9 och har sedan dess förbättrats genom tillsats av 1 M sorbitol inkubation till osmotiskt stödceller 10. Elektroporering effektivitet har dessutom visat sig bero på jäst art och stam, antalet celler och tillväxtfas, elektroporering volym, fältstyrka, och specifika buffertar 11. Litiumacetat (LiOAc) transformation, ursprungligen beskrevs av et al. Ito 12, är bland de mest använda transformationsprotokoll eftersom det kräver ingen speciell utrustning. Ytterligare analyser visade att effektiviteten hos LiOAc jästtransformation ökar i hög grad när cellerna samlas i mitten av log-fasenav tillväxt och är värmechock i närvaro av polyetylenglykol (PEG) och DNA vid 42 ° C 12. Inkubation av hela intakt jäst med PEG är väsentlig för effektiv omvandling, eventuellt genom att förbättra fastsättning av DNA till cellmembranet samt via andra effekter på membranet 13. Litium självt ökar också permeabiliteten för intakta celler 14. Även om de flesta laboratorium S. cerevisiae stammar kan lätt omvandlas med hjälp av LiOAc transformation 3, kan andra jästarter vara mer effektivt transformeras med användning av alternativa protokoll. Pichia pastoris, till exempel, är mest effektivt omvandlas via elektroporering snarare än LiOAc omvandling 13. Det är viktigt, därför att testa flera metoder för omvandling och att optimera inkubationsperioder och reagenskoncentrationer vid försök att genetiskt modifiera en karaktäriserad jäststam. Detta manuskript beskriver således både LiOAc transformation och elektroporering som teknik för omvandling av auxotrof mutant och vild typ S. boulardii. Intresserade läsare är inriktade på senaste recensioner för noggranna beskrivningar av utvecklingen av jäst omvandling, alternativa protokoll, och ytterligare diskussioner om möjliga verkningsmekanismer 13,15. Transformation av jäst med plasmid som kodar för ett lätt detekterbart protein är dessutom en förutsättning för efterföljande tester för att säkerställa korrekt uttryck och funktion av heterologt protein. Otaliga olika proteiner kan väljas beroende på det yttersta syftet med den terapeutiska studien och antikropparna som proteindetektion av immunoblotting, ELISA, och andra tekniker. Protokoll för dessa tekniker har grundligt beskrivits på annat ställe 16,17, och kan användas för att bestämma nivåer av heterolog proteinproduktion från transformerad jäst genom jämförelse med standardkurvor. För syftena med demonstration och att visaframgångsrik produktion av ett mycket vanligt förekommande protein i jäst biologi, presenterar detta manuskript transformation med plasmid kodande grönt fluorescerande protein (GFP), som gör det möjligt för efterföljande detektion med användning av fluorescensmikroskopi. Lika viktigt för produktion av probiotiska organismer som uttrycker heterologt protein är det en god förvaltning och detektering av dessa mikroorganismer inom gastrointestinala vävnader, som beskrivs i delar tre och fyra. Administrering av rekombinant jäst via oral sondmatning möjliggör avgivning av kontrollerade kvantiteter av jäst direkt in i magen, från vilket C57BL / 6-möss är naturligt oförmögna att kräkningar 18. Däremot kan felaktig djurhantering och sondmatning leda till matstrupen skada och perforering, gastrisk perforering, luftrör administration, och aspirationspneumoni 19,20. Dålig teknik och bristande erfarenhet kan vidare öka variabiliteten i murina immunsvar och experimentell Results, som har tillskrivits djur stressen vid oral sondmatning 21,22. Praxis i korrekt teknik kan således inte endast dämpa djuret obehag, men kan också öka precisionen av experimentella resultat. Detta manuskript beskriver och visar förvaltning av kontrollerade doser av rekombinant jäst djurhantering och oral sondmatning. Slutligen är det viktigt att bekräfta framgångsrik leverans av rekombinant jäst genom att analysera lymfoidvävnader avseende på närvaro av jäst och heterologa proteinet. Mag immun vävnader som undersökts kan enklast och förutsägbart vara med avseende på förekomst av jäst är de Peyerska placken. Peyers plack är sekundära lymfoida organ längs tunntarmen som är viktiga områden av mukosal immunsvarsinduktion 23. Antigener från lumen överförs transcellularly genom microfold (M) celler i epitelet och frigörs i de Peyerska placken och exponerar därmed omslutad antigenpresenterande celler till tarm luminala innehåll. Även om partikelupptag över tarmepitelet också kan uppnås genom bägarceller, har dessa celler visats endast tar upp partiklar mindre än 0,02 pm i diameter 24. Transepitelialt dendriter sträckte sig från CD103 + dendritiska celler (DC) också tar upp små partiklar från tarmlumen 25; men det finns för närvarande inga rapporter som visar att CD103 + DCs ta upp partiklar som är större än bakterier. Således intakt probiotiska jäst, av medelstorlek mellan 3-6 mikrometer i diameter, är mest sannolikt att tas upp av M-celler och överfördes till de Peyerska placken. Som beskrivs här är ett protokoll för insamling och screening av Peyers plack för livsduglig rekombinant jäst, även om detta förfarande också lätt kan anpassas för att utvärdera upptag av probiotiska bakterier. Sammanfattningsvis bedömer rekombinant probiotiska jäst för leverans avrapeutic proteiner till tarmen kräver kunskaper i laboratorietekniker som spänner över molekylärbiologi till djurhantering och immunologi. Presenteras här är protokoll för en) generering och screening av auxotrofa jäststammar som kan lätt negativt väljas utan antibiotika, 2) alternativa protokoll för att transformera jäst och möjliggöra expression av heterologt protein, 3) demonstrationer av lämpliga djurhantering teknik och oral sondmatning för intragastrisk tillförsel av rekombinant jäst, och 4) protokoll för Peyers plack dissektion och screening för livsduglig rekombinant jäst och funktionellt heterologt protein. Tillsammans kommer dessa protokoll möjliggör generering och provning av en probiotisk jäststam som kan leverera heterologa terapeutiskt protein till mag-tarmkanalen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="704">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SmartSpec 3000 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:107px;">BioRad</td>
			<td style="width:107px;">170-2501</td>
			<td style="width:275px;">Example of spectrophotometer for determining cell concentration and OD600 of yeast cultures</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">New Brunswick Roller Drum</td>
			<td style="width:107px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;">M1053-4004</td>
			<td style="width:275px;">Example of roller drum for yeast culture incubation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UV Stratalinker 2400</td>
			<td style="width:107px;">Stratagene</td>
			<td style="width:107px;">400075-03</td>
			<td style="width:275px;">Example stratalinker</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Stuart Colony Counter SC6PLUS</td>
			<td style="width:107px;">11983044</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:275px;">Plate stand with magnification records colony count upon sensing pressure from pen</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Scienceware Colony Counter&#160;</td>
			<td style="width:107px;">F378620002</td>
			<td style="width:107px;">Bel-Art Scienceware</td>
			<td style="width:275px;">Hand held colony counter pen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Replica plating device</td>
			<td style="width:107px;">Fisherbrand</td>
			<td>09-718-1</td>
			<td rowspan="2" style="width:275px;">Example of replica plating stand and pads&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Velveteen squares</td>
			<td style="width:107px;">Fisherbrand</td>
			<td>09-718-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;L shaped sterile cell spreaders&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:107px;">14665230</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Deoxyribonucleic acid, single stranded from salmon testes</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">D7656-1ML</td>
			<td style="width:275px;">Example carrier DNA for yeast LiOAc transformation</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Gavage needles</td>
			<td style="width:107px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:107px;">N-PK&#160;002</td>
			<td style="width:275px;">For mice 15-20 g, the suggested needle is a 22 gauge (1.25 mm ball), 1 in long, straight reusable gavage needle. For mice weighing greater than 20 g, 20 gauge or larger straight or curved gavage needles may be used</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1mL sterile slip-tip disposable tuberculin syringe&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:107px;">BD 309659</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Blunt forceps such as Electron Microscopy Sciences 7&#34; (178 mm) serrated tip, broad grip forceps</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:107px;">77937-28</td>
			<td style="width:275px;">Example of blunt forceps needed for dissection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Straight and curved dissection scissors&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:107px;">72966-02 and 72966-03</td>
			<td style="width:275px;">Examples of scissors needed for dissection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">IMDM</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:107px;">12440053</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transformation of probiotic yeast and their recovery from gastrointestinal immune tissues following oral gavage in mice

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Generering av en överlevnadskurva efter UV-bestrålning kräver plätering av utspädda jästceller så att olika kolonibildande enheter (CFU) kan bilda. Varje prov 500 | il samlas upp såsom beskrivits ovan innehåller cirka 5 x 10 6 celler; Men större än 100 kolonier per platta är svårt att exakt urskilja. Bordläggningen outspätt prov samt serie 1:10 utspädningar av bestrålade celler garanterar därmed att CFU kan räknas upp vid varje UV-dos, som visas</str...

Watch this Scientific Journal Video about Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice at JoVE.com

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Som presenteras här är en enhetlig beskrivning av tekniker som kan användas för att utveckla, omvandla, administrera, och testa heterologt protein uttryck av de probiotiska jästen Saccharomyces boulardii.

Omvandling av probiotiska Jäst och deras återhämtning från Gastrointestinal Immune Vävnader Efter oral sondmatning hos möss

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

Sju steg till stellate celler

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

Muntlig överföring av<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; I möss via Intag av förorenad mat

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induktion av murina tarminflammation med adoptiv överföring av Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hög</sup&gt; T-celler i möss med immunbrist

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

In Situ Upptäckt av bakterier inom paraffininbäddade vävnader med hjälp av en Digoxin-märkt DNA-sond Inriktning 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Isolering, karakterisering och funktionella Undersökning av tandkötts Immune Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Induktion av experimentell autoimmun encefalomyelit hos möss och utvärdering av sjukdomen beroende Distribution av immunceller i olika vävnader

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

Skyddande effekt och Pulmonary immunsvar efter subkutan och intranasal BCG Administration hos möss

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

Probiotic Studies in Neonatal Mice Using Gavage

Probiotiska studier på neonatala möss använder sondmatning

Adult mouse models have been widely used to understand the mechanism behind disease progression in humans. The applicability of studies done in adult ...