Name: imaging subcellular structures in the living zebrafish embryo
Uploaded: 2016-04-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo at JoVE.com

P.E. is supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Research Training Group 1373 and the Graduate School of the Technische Universit&#228;t M&#252;nchen (TUM-GS). G.P. was supported by TUM-GS. L.T. is supported by an EMBO fellowship (EMBO ALTF 108-2013). D.P.'s work on zebrafish was supported by the DFG through the Sonderforschungsbereich "Molecular Mechanisms of Neurodegeneration" (SFB 596); the Center for Integrated Protein Sciences (Munich) and the European Community's Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013) under Grant agreement no. 200611 (MEMOSAD). He is currently a New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller Fellow and was supported by a fellowship from the German Academy of Sciences Leopoldina. L.G. is supported by funding from the DFG through SFB 870 "Assembly and Function of Neuronal Circuits", Project A11. 
We are grateful to Kristina Wullimann for maintaining our fish facility, Yvonne Hufnagel for technical support and Thomas Misgeld for comments on the manuscript. We are grateful to R. K&#246;ster (Technische Universit&#228;t Braunschweig) for providing the M1 Medusa vector (pSKmemmRFP:5xUAS:H2B-CFP:5xUAS:Centrin2-YFP) from which we cloned out Centrin-YFP and S.C. Suzuki and T. Yoshimatsu (University of Washington) for providing the 14xUAS:MA-cerulean cassette which we used to generate the reporter construct to make CentrinFish. We further thank S.C. Suzuki and T. Yoshimatsu (University of Washington) for the Otx2:Gal4 transgenic line, A. Sagasti for the Sensory:Gal4-VP16 construct (UCLA) and M. Nonet (Washington University in St. Louis) for the pCold Heart Tol2 vector. We acknowledge Bettina Schmid, Alexander Hruscha and Christian Haass (German Center for Neurodegenerative Diseases Munich - DZNE) for contributing to the development of MitoFish.

Alla djurförsök utfördes i enlighet med lokala föreskrifter av regeringen i Oberbayern (München, Tyskland). 1. Märkning organeller och andra subcellulära strukturer OBS: Här genetisk reporter konstruktioner som fluorescerande tag centrosom, mitokondrier och cellmembran beskrivs. <ol><li> Använd konventionella kloningsmetoder 29 för att generera fusionsproteiner som fluorescerande märka centrosom och mitokondrier. Klona den...

Här visar vi mångsidigheten av Gal4-UAS expressionssystem för att fluorescent märka mitokondrierna, centrosom och de cellulära membranen i specifika celltyper in vivo i zebrafiskembryon. Många fluorescerande fusionsproteiner som märka andra organeller eller subcellulära strukturer kan hittas i den publicerade litteraturen och kan fås från respektive laboratorium, kommersiella källor eller icke-kommersiella plasmid förvarings (t.ex. Addgene). Att utforma en ny fluorescerande fusionsprotein, ...

In vivo imaging ger direkt visualisering av cellulära beteenden på det mest fysiologiskt sammanhang. Öppenheten i zebrafisk embryon, deras snabba och extern utveckling och ett rikt utbud av genetiska verktyg som tillåter fluorescensmärkning har alla bidragit till den ökande användningen av in vivo mikroskopi för att belysa dynamiken i viktiga utvecklings händelser. Imaging studier av nervsystemets utveckling i zebrafisk har exempelvis kraftigt utökat vår kunskap om beteendet hos neurala stamceller och öde deras avkomma inklusive deras efterföljande migration, differentiering och krets integration 1-8. Scenen är nu inställd på att undersöka subcellulära dynamik som ligger bakom dessa cellulära beteenden. Faktum är zebrafisk redan utnyttjas som verktyg för in vivo cellbiologi. Det är nu möjligt att visualisera mitokondrier 9-11, centrosom 2,8,12-14, Golgi 15, Mikrotubuli 4 och aktin 16 cytoskelettet, endosomer 17 och komponenterna i det apikala membranet komplexa 1,18, bland andra subcellulära strukturer i zebrafisk embryon in vivo. Hittills har mycket av vad som är känt om funktionen av dessa organeller kommer från att studera deras beteende i odlade celler. In vitro-studier har gett medan enorm inblick i cellbiologi, gör celler i odling är helt representativ för komplicerade situationen in vivo och därför inte nödvändigtvis återspeglar den funktion och dynamik subcellulära organeller in vivo. Zebrafisk embryon har en livskraftig in vivo alternativ till undersöker subcellulära dynamik. Som ryggradsdjur, zebrafisk har många organsystem (t.ex. neurala näthinnan) som är homologa med de som återfinns i däggdjursarter. Dessutom är zebrafisk embryon alltmer för att modellera mänskliga sjukdomar 19,20 </supp&gt;, inklusive de som rör centrosomal funktion (t.ex. mikrocefali 21 och Lebers kongenitala amauros 22) och mitokondriefunktion (t.ex. Parkinsons sjukdom 23, tauopatier 10,24 och Barth syndrom 25). In vivo imaging på cellulär och subcellulär nivå i dessa fall kommer att möjliggöra en bättre förståelse av cellbiologi bakom dessa patologiska tillstånd. Det övergripande målet för de metoder som beskrivs här är att ge en heltäckande guide för att undersöka organeller och andra subcellulära strukturer i zebrafisk embryon genom att använda in vivo ljusmikroskop. Hela arbetsflödet involverade i att visualisera och spåra subcellulära strukturer in vivo beskrivs - från genetiska märkningsmetoder, för att generera transient uttrycka och stabil transgen fisk, och slutligen till avbildning med brett fält och konfokalmikroskopi. Även om var och en av dessa procedures används av många zebrafisk laboratorier är protokollen optimerade och strömlinjeformad för att undersöka dynamiken i subcellulära strukturer. Två särskilda aspekter av det arbete som beskrivs här garanterar nämna: För det första, användningen av Gal4-UAS expressionssystem i flera konfigurationer för genetiskt etikettorgan i specifika celltyper. För det andra, en direkt jämförelse av brett fält och konfokalmikroskopi till bild subcellulära strukturer in vivo. Nuvarande strategier för att genetiskt etikettorganeller och andra subcellulära strukturer i zebrafisk antingen utnyttja utjämnade mRNA 1,4,8 eller DNA-baserade konstruktioner där promotorelement direkt driva uttryck av fusionsproteiner 9,14,15. In vitro transkriberade utjämnade RNA resulterar i snabb och bred uttryck, som inte är vävnadsspecifik dock. Dessutom, uttrycksnivåer minska med tiden som det utjämnade RNA späds eller försämras. Således användningen av RNA baseradkonstruktioner att undersöka organell dynamiken i ett senare skede i utvecklingen är begränsad (vanligtvis upp till tre dagar efter befruktningen). Dessa begränsningar kan övervinnas genom användning av DNA-konstruktioner, där rumsliga och tidsmässiga kontroll av uttryckning bestäms av specifika promotorelement. När DNA-baserade konstruktioner används i samband med de Gal4-UAS systemet betydande förbättringar av transgena expressionsnivåer iakttas 26,27. I detta tvåparts expressionssystem, cell typspecifika promotorelement driva expressionen av en transkriptionell aktivator Gal4, medan reportergener klonas nedströms om Gal4-bindande uppströmsaktiverande sekvensen (UAS). Genom att kombinera UAS reportrar med lämpliga Gal4 förare, kan uttryck begränsas till specifika celltyper, kringgår behovet att klona reportergener bakom olika promotorer varje gång ett specifikt uttryck mönster önskas. Vidare kan uttrycket av multipla UAS reportergener varadriven av en enda Gal4 aktivator. Gal4-UAS systemet ger således en mångsidig och flexibel genetiska tillvägagångssätt för subcellulär märkning. Brett fält och konfokala mikroskop är arbetshästar i de flesta laboratorier. Wide-fält system använder typiskt en båglampa som ljuskälla och detektera det emitterade ljuset med en känslig kamera som är placerad vid änden av ljusvägen. Denna avbildning modalitet vanligtvis begränsad till tunna prover utanför fokus ljus döljer fokus information tjockare prover. Konfokala mikroskop skiljer sig från brett fält system genom att de är byggda för att gynna signaler som kommer från fokalplanet över dem som har sitt ursprung ur fokus (dvs &quot;optisk sektionering&quot;) 28. För att uppnå optisk sektione ett nålhål placeras i banan emission i ett konjugat läge till punkten ljuskälla. Lasrar används som ljuskällor och signaler detekteras med fotomultiplikatorrör (PMT). Praktiskt, en lasertrålen dras över provet punkt-för-punkt och fluorescensemissionen vid varje fläck (pixel) detekteras av PMT. Här har vi bild precis samma subcellulära strukturer i levande zebrafisk embryon med både brett fält och konfokalmikroskopi för att ge en direkt jämförelse mellan de båda mikroskopi formerna. Den underliggande syfte att ge sådana jämförelser är att erbjuda riktlinjer för att välja den mest lämpliga mikroskopi teknik för den specifika frågan till hands. Med hjälp av metoder som beskrivs här visar vi Gal4-UAS baserad genetisk märkning av mitokondrier och centrosom. Dessa organeller är avbildade i olika celltyper i nervsystemet och i muskelcellerna med användning av brett fält och konfokalmikroskopi för att demonstrera lämpligheten hos varje avbildningsmodalitet. De metoder som beskrivs här kan lätt anpassas för att undersöka andra organeller och subcellulära strukturer i levande zebrafisk embryo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose (2-hydroxyethylagarose)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4018-10G</td>
			<td>Low-gelling temperature Type VII</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Block heater</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Thermomixer compact</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca(NO3)2 Calcium nitrate hydrate, 99.996%&#160;</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>202967-50g</td>
			<td>To prepare 30x Danieau&#39;s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>Retiga Exi Fast 1394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Coated Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Dumont - Fine Science Tools</td>
			<td>11252-50</td>
			<td>#5 Forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser-scanning microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000 Fluoview</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish heater</td>
			<td>Warner Instrument Corporation</td>
			<td>DH-35</td>
			<td>Heating ring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfate salt</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>A5040-100G</td>
			<td>Tricaine (anesthetic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M205 FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneClean kit</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>111001200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Culture Dishes</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-0-14-C</td>
			<td>35mm petri dish, 14mm microwell, No. 0 coverglass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass needles</td>
			<td>World Precision Instruments Inc.&#160;</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td>For microinjections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-250g</td>
			<td>To prepare 30x Danieau&#39;s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vacuum grease</td>
			<td>Dow Corning&#160;</td>
			<td>DCC000001242 150g</td>
			<td>Silicon dioxide grease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>To maintain zebrafish embryos at 28.5&#8304; C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7643-5kg</td>
			<td>To prepare 30x Danieau&#39;s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4.7H2O &#160;&#160;Magnesium sulfate heptahydrate 98+% A.C.S reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230291-500g</td>
			<td>To prepare 30x Danieau&#39;s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>FemtoJet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td>0.5-20uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Maerzhaeuser Wetzlar</td>
			<td>MM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette holder</td>
			<td>Intracel</td>
			<td>P/N 50-00XX-130-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1340</td>
			<td>To transcribe PCS-Transposase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl BioXtra &#62;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541-1kg</td>
			<td>To prepare 30x Danieau&#39;s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To measure DNA/RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>Flaming/Brown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIR Apo 40x/0.80W&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Water-dipping-cone objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea Grade I, approx. 98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7629-10G</td>
			<td>PTU (prevents pigmentation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Sarstedt AG&#160;</td>
			<td>821472</td>
			<td>92 x 16mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic molds&#160;</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td>For microinjections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglas cover-with a hole</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
			<td>The hole in the Plexiglas cover should be 3 mm larger than the diameter of the water-dipping-cone objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tea-strainer (Plastic)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To collect zebrafish eggs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Warner Instrument Corporation</td>
			<td>TC-344B</td>
			<td>Dual Automatic Temperature Controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Sarstedt AG&#160;</td>
			<td>86.1171</td>
			<td>3.5mL plastic transfer pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMPlanFI 100x/1.00W</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Water-dipping-cone objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMPlanFLN 20x/0.50W&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Water-dipping-cone objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTU (50x Stock)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 76 mg PTU in 50 ml distilled water 
			Stir vigorously at room temperature&#160; 
			Store at -20 oC in 1 ml aliquots 
			Use at 1x working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (20x Stock)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 200 mg Tricaine in 48 ml distilled water 
			Add 2 ml 1M Tris base (pH9) 
			Adjust to pH 7&#160; 
			Store at -20 oC in 1 ml aliquots 
			Use at 1x working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Danieau&#39;s Solution (30x Stock)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1740 mM&#160; NaCl&#160; 
			&#60;21 mM&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; KCl&#160; 
			12 mM&#160; &#160;&#160;&#160;&#160;MgSO4.7H2O&#160; 
			18 mM&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Ca (NO3)2 
			150 mM&#160;&#160;&#160; HEPES buffer&#160; 
			Distilled water upto 1 L&#160; 
			Store at 4 oC&#160; 
			Use at 0.3x working solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging subcellular structures in the living zebrafish embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Här användningen av brett fält och konfokalmikroskopi till bild mitokondrier och centrosom i levande zebrafisk embryon är direkt jämförs och kontrasteras. Beroende på placeringen av cellerna i vilka organell dynamiken skall undersökas och den inneboende frekvensen av de specifika subcellulära händelser, i allmänhet antingen brett fält eller konfokalmikroskopi är ett bättre val. Vi avbildade organ i RB neuron belägna på ytan av embryot och i näthinnans celler ligger djupa...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo at JoVE.com

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imaging subcellulära strukturer i vardagsZebraFish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Mätning Protein Stabilitet i Living Zebrafish embryon Använda Fluorescens Decay Efter Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Microbead Implantation i zebrafisk embryot

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Spåra celler i GFP-transgen zebrafisk Använda Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Observation Mitotisk Division och dynamik i en Live Zebrafisk Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Induktion av hypoxi i levande groda och zebrafiskembryon

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Användning av Immunolabeling att analysera stabil, dynamisk och begynnande mikrotubuli i zebrafiskar embryot

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM och Microrheology i cellen zebrafiskar Embryo äggula

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Single-cell Photoconversion i levande intakt zebrafiskar

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Följande endokardiella vävnad rörelser via Cell Photoconversion i zebrafiskar embryot

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Minimalinvasiv embryoöverföring och embryo-förglasning vid det optimala embryonala steget i Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...