Name: genome-wide mapping of drug-dna interactions in cells with cosmic (crosslinking of small molecules to isolate chromatin)
Uploaded: 2016-01-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin at JoVE.com

We thank members of the Ansari lab and Prof. Parameswaran Ramanathan for helpful discussions. This work was supported by NIH grants CA133508 and HL099773, the H.&#8197;I. Romnes faculty fellowship, and the W.&#8197;M. Keck Medical Research Award to A.Z.A. G.S.E. was supported by a Peterson Fellowship from the Department of Biochemistry and Molecular Biosciences Training Grant NIH T32 GM07215. A.E. was supported by the Morgridge Graduate Fellowship and the Stem Cell and Regenerative Medicine Center Fellowship, and D.B. was supported by the NSEC grant from NSF.

1. يشابك في الخلايا الحية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بادئ ذي بدء ~ 2.5x10 7 خلايا H1، أو الخلايا المستزرعة الأخرى. ملاحظة: هذا العدد من الخلايا H1 يتوافق مع خمسة أطباق 10 سم (حوالي 40٪ confluency). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخلايا في E8 وسائل الإ...

One of the primary challenges with conventional ChIP is the identification of suitable antibodies. ChIP depends heavily upon the quality of the antibody, and most commercial antibodies are unacceptable for ChIP. In fact, the Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) consortium found only 20% of commercial antibodies to be suitable for ChIP assays.50 With COSMIC, antibodies are replaced by streptavidin. Because polyamides are functionalized with biotin, streptavidin is used in place of an antibody to capture polyam...

المعلومات لجعل يتم ترميز كل خلية في جسم الإنسان في الحمض النووي. الاستخدام الانتقائي لتلك المعلومات يحكم مصير خلية. عوامل النسخ (TFS) هي البروتينات التي تربط لتسلسل الحمض النووي محددة للتعبير عن مجموعة فرعية معينة من الجينات في الجينوم، وترتبط خلل في TFS إلى ظهور مجموعة واسعة من الأمراض، بما في ذلك العيوب التنموية، والسرطان، ومرض السكري 1،2 لقد كنا مهتمة بتطوير الجزيئات التي يمكن أن تربط بشكل انتقائي على الجينوم وتعدل شبكات تنظيم الجينات. البلاستيك تتكون من N -methylpyrrole وN -methylimidazole والجزيئات التي يمكن أن تستهدف DNA مع الخصوصيات والانتماءات التي ينافس عوامل النسخ الطبيعية. 3-6 هذه الجزيئات تربط لتسلسل محددة في أخدود صغير من الحمض النووي بعقلانية مصممة. 4،5،7 وقد استخدمت -11 البلاستيك على حد سواء قمع وتفعيل التعبير عن ز محددأنيس. 4،12-19 لديهم أيضا مثيرة للاهتمام المضادة للفيروسات 20-24 والمضادة للسرطان 12،13،25-30 خصائص. ميزة واحدة جذابة من البلاستيك هي قدرتها على الوصول إلى تسلسل الحمض النووي التي تم ميثليته 31،32 وملفوفة حول البروتينات هيستون 9،10،33. لقياس الخصائص ملزمة شاملة من جزيئات الحمض النووي ملزم، خلقت مختبرنا معرف الموقع وما شابه ذلك (CSI) الأسلوب. 34-39 وقوع توقع من مواقع الربط على أساس خصوصيات في المختبر (genomescapes) يمكن عرضها على الجينوم، لأن في المختبر شدة ملزمة ويتناسب طرديا مع الثوابت جمعية (K أ). 34،35،37 هذه genomescapes توفير نظرة ثاقبة الإشغال مادة البولي أميد عبر الجينوم، إلا أن قياس مادة البولي أميد ملزمة في الخلايا الحية يشكل تحديا. يتم حزم DNA بإحكام في النواة، والتي يمكن أن تؤثر على إمكانية الوصول إلى مواقع الربط. وعلىccessibility هذه تسلسل الحمض النووي لchromatinized البلاستيك لا يزال لغزا. في الآونة الأخيرة، العديد من الأساليب لدراسة التفاعلات بين الجزيئات الصغيرة والأحماض النووية ظهرت. 40-48 القبض تقارب الكيميائية واسع مواز تسلسل الحمض النووي (الكيميائي وما يليها) هي واحدة من هذه التقنية. يستخدم علم وما يليها الفورمالديهايد لتشعبي جزيئات صغيرة إلى هدف الجيني من الفائدة ومشتقات المعقدة البيروكسيديز من جزيء صغير من الفائدة للقبض على التفاعل يجند المستهدفة. 48،49 الفورمالديهايد يشابك يؤدي إلى تفاعلات غير المباشرة التي يمكن أن تنتج ايجابيات كاذبة. 50 طورنا طريقة جديدة، ويشابك من جزيئات صغيرة لعزل لونين (الكونية)، 51 مع photocrosslinker للقضاء على ما يسمى قمم &quot;الوهمية&quot;. 50 لتبدأ، قمنا بتصميم وتوليفها المشتقات trifunctional من البلاستيك. تحتوي هذه الجزيئات لبول ملزم DNAyamide، وهو photocrosslinker (السورالين)، والتعامل مع تقارب (البيوتين، الشكل 1). مع البلاستيك trifunctional، يمكننا التقاط تساهميا التفاعلات DNA مادة البولي أميد مع 365 نانومتر الأشعة فوق البنفسجية، والطول الموجي التي لا تضر DNA أو حث غير السورالين على أساس يشابك 51 المقبل، ونحن تفتيت الجينوم وتنقية DNA أسر تحت صرامة ونصف شروط -denaturing لتقليل الحمض النووي التي هي غير ملزمة تساهميا. وهكذا، نرى الكونية كوسيلة المتعلقة كيم وما يليها، ولكن مع قراءات أكثر مباشرة من DNA الاستهداف. الأهم من ذلك، ضعف (K 10 3 -10 4 M -1) تقارب من السورالين لDNA لا detectably تأثير مادة البولي أميد خصوصية. 51،52 يمكن تحليل شظايا الحمض النووي المخصب إما عن طريق البلمرة الكمي سلسلة من ردود الفعل 51 (COSMIC-QPCR) أو عن طريق الجيل التالي من التسلسل 53 (الكونية وما يليها). وتمكن هذه البيانات غير منحازة، موجهة الجينوم تصميم بروابط أن بينالتصرف المطلوب مواضع بهم الجيني وتقليل بعيدا عن الهدف الآثار. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53510/53510fig1.jpg"/> الشكل 1. البلاستيك الحيويه والمخطط الكوني. (A) البلاستيك دبوس 1-2 الهدف تسلسل الحمض النووي 5&#39;-WACGTW-3 &quot;. البلاستيك الخطية 3-4 الهدف 5&#39;-AAGAAGAAG-3 &quot;. والغامق حلقات من N-methylimidazole لوضوح. دوائر مفتوحة ومليئة تمثل N -methylpyrrole وN -methylimidazole، على التوالي. ساحة يمثل 3-chlorothiophene، والماس تمثل بيتا ألانين. يتم الرمز السورالين والبيوتين التي كتبها P و B على التوالي. (B) المخطط الكوني. يتم التعامل مع الخلايا المشتقات trifunctional من البلاستيك. بعد يشابك مع 365 نانومتر الأشعة فوق البنفسجية، والخلايا هي لوالمنفصمة DNA ysed والجيني. تضاف حبات streptavidin المغلفة المغناطيسي لالتقاط adducts-DNA مادة البولي أميد. يتم تحرير DNA ويمكن تحليلها بواسطة PCR الكمي (QPCR) أو عن طريق الجيل التالي من التسلسل (خ ع). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53510/53510fig1highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="727">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td style="width:180px;">any source</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:75px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Benzamidine</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pepstatin</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Proteinase K</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Other sources can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">StemPro&#174; Accutase&#174; Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>We have tried other manufacturers of DNA columns with success.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TruSeq ChIP Sample Prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>IP-202-1012</td>
			<td>This Kit can be used to prepare COSMIC DNA for next-generation sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td>Used to coat plates in order to grow H1 ESCs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH paper</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">amber microcentrifuge tubes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">microcentrifuge tubes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pyrex filter</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td>Pyrex baking dishes are suitable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">qPCR master mix</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HCl (6 N)</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10-cm tissue culture dishes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Serological pipettes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pasteur pipettes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette tips</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">15-mL conical tubes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">centrifuge</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">microcentrifuge</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">nutator</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnetic separation rack</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UV source</td>
			<td>CalSun</td>
			<td>B001BH0A1A</td>
			<td>Other UV sources can be used, but crosslinking time must be optimized empirically</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Misonix Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>S4000 with 431C1 cup horn</td>
			<td>Other sonicators can be used, but sonication conditions must be optimized empirically</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Humidified CO2 incubator</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biological safety cabinet with vacuum outlet</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide mapping of drug-dna interactions in cells with cosmic (crosslinking of small molecules to isolate chromatin)

الجينوم هو الهدف من بعض مبحث المعالجة الكيميائية الأكثر فعالية، ولكن معظم هذه الأدوية تفتقر إلى الدقة تسلسل الحمض النووي، الأمر الذي يؤدي سمية والعديد من الآثار الجانبية السلبية للحد الجرعة. تستهدف الجينوم مع تسلسل محدد جزيئات صغيرة قد تمكن الجزيئات مع زيادة مؤشر العلاجي وعدد أقل من خارج الهدف آثار. N -methylpyrrole / N البلاستيك -methylimidazole هي الجزيئات التي يمكن أن تكون مصممة بشكل عقلاني لاستهداف تسلسل الحمض النووي محددة بدقة رائعة. وخلافا لمعظم عوامل النسخ الطبيعية، ويمكن البلاستيك ربط الحمض النووي الميثيلي وchromatinized دون خسارة في التقارب. خصوصية سلسلة من البلاستيك وقد درس على نطاق واسع في المختبر مع تحديد المواقع وما شابه ذلك (CSI) ومع النهج البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية التقليدية، ولكن لا يزال دراسة مادة البولي أميد ملزمة لأهداف الجينومية في الخلايا بعيد المنال. نحن هنا الإبلاغ عن الأسلوب، يشابك من الجزيئات الصغيرة إلى ايزولاالشركة المصرية للاتصالات لونين (الكونية)، أن يحدد مادة البولي أميد ملزمة المواقع في جميع أنحاء الجينوم. COSMIC يشبه مناعي لونين (رقاقة)، ​​ولكنه يختلف في ناحيتين هامتين: (1) يعمل على photocrosslinker لتمكين انتقائي، والتقاط تسيطر عليها مؤقتا من مادة البولي أميد الأحداث ملزمة، و (2) يستخدم مؤشر تقارب البيوتين لتنقية مادة البولي أميد تقارن -DNA في ظل ظروف تغيير طبيعة شبه لتقليل الحمض النووي التي هي غير ملزمة تساهميا. COSMIC هو الاستراتيجية العامة التي يمكن استخدامها للكشف عن أحداث الجينوم على نطاق ملزمة من البلاستيك وغيرها من عوامل العلاج الكيميائي تستهدف الجينوم.

لحساب غير موحدة تجزئة الجينوم وغيرها من المتغيرات، وينبغي دائما أن تطبيع DNA النقي ضد إشارة من الحمض النووي الإدخال. الاشعال محددة إلى موضع الاهتمام يمكن استخدامها. ومن المفيد أن نحلل أيضا مكان حيث لا يتوقع أن جزيء لربط، كوسيلة لمراقبة سلبية. ونحن نرى زيادة&gt; 100 أضعاف ?...

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin at JoVE.com

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

على صعيد رسم الخرائط الجينوم من المخدرات-DNA التفاعلات في الخلايا مع COSMIC (يشابك من الجزيئات الصغيرة لعزل لونين)

تحديد الأهداف المباشرة للجزيئات التي تستهدف الجينوم لا يزال يشكل تحديا كبيرا. لفهم كيفية تفاعل جزيئات الحمض النووي ملزم الجينوم، وضعنا الطريقة التي تعتمد على يشابك من الجزيئات الصغيرة إلى عزل لونين (COSMIC).

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

الجينوم على نطاق تحليل المستويات (شحن) من الحمض الريبي النووي النقال باستخدام Aminoacylation ميكروأرس]

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

الجينوم على نطاق التحليل باستخدام رقاقة لتحديد أهداف محددة الجينات شكل الإسوي

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

iCLIP -- Transcriptome على صعيد رسم الخرائط من البروتين RNA التفاعلات مع القرار الفردي النكليوتيد

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

الكروماتين تحليل التفاعل مع تسلسل العلامات المقترنة النهائي (شيا-PET) لرسم خرائط التفاعلات الكروماتين وفهم تنظيم النسخ

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

حذوفات الجينات في الجينوم على نطاق<em&gt; العقدية الدم</em&gt; من جانب PCR إنتاجية عالية

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

و في الجسم الحي يشابك النهج لعزل البروتين المجمعات من ذبابة الفاكهة الأجنة

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

الجينوم على نطاق فحص التفاعلات بين البروتينات التي كتبها البروتين جزء التكملة الفحص (PCA) في الخلايا الحية

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

عزل المناطق الجينوم محددة وتحديد أسوشيتد الجزيئات التي enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

DamID وما يليها: رسم خرائط الجينوم على نطاق التفاعلات البروتين DNA بواسطة إنتاجية عالية تسلسل شظايا الحمض النووي ميثليته الأدينين

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

التضخيم، الجيل التالي من التسلسل، والحمض النووي الجينوم رسم خرائط مواقع التكامل فيروسات الرجعية

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...