Name: genome-wide mapping of drug-dna interactions in cells with cosmic (crosslinking of small molecules to isolate chromatin)
Uploaded: 2016-01-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin at JoVE.com

We thank members of the Ansari lab and Prof. Parameswaran Ramanathan for helpful discussions. This work was supported by NIH grants CA133508 and HL099773, the H.&#8197;I. Romnes faculty fellowship, and the W.&#8197;M. Keck Medical Research Award to A.Z.A. G.S.E. was supported by a Peterson Fellowship from the Department of Biochemistry and Molecular Biosciences Training Grant NIH T32 GM07215. A.E. was supported by the Morgridge Graduate Fellowship and the Stem Cell and Regenerative Medicine Center Fellowship, and D.B. was supported by the NSEC grant from NSF.

1. Tværbinding i levende celler <ol><li> Begynd med ~ 2.5x10 7 H1 celler eller andre dyrkede celler. BEMÆRK: Denne række H1 celler svarer til fem 10-cm retter (ca. 40% konfluens). </li><li> Grow celler i E8 medier på retter overtrukket på en overflade, der understøtter pluripotente stamceller (se Materialer List) og inkubere dem ved 37 ° C i fugtig atmosfære af 5% CO2. Harvest celler enzymatisk (se Materialer List). Bemærk: Lad ikke H1 celler at overstige 90% konfluens; konfluens ...

One of the primary challenges with conventional ChIP is the identification of suitable antibodies. ChIP depends heavily upon the quality of the antibody, and most commercial antibodies are unacceptable for ChIP. In fact, the Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) consortium found only 20% of commercial antibodies to be suitable for ChIP assays.50 With COSMIC, antibodies are replaced by streptavidin. Because polyamides are functionalized with biotin, streptavidin is used in place of an antibody to capture polyam...

De oplysninger, der gør hver celle i den menneskelige krop er indkodet i DNA. Den selektive brug af denne information styrer skæbne af en celle. Transkriptionsfaktorer (TFS) er proteiner, der binder til specifikke DNA-sekvenser til at udtrykke en bestemt delmængde af gener i genomet, og fejlfunktion af TF&#39;er er knyttet til indtræden af ​​en bred vifte af sygdomme, herunder udviklingsmæssige defekter, cancer og diabetes . 1,2 Vi har været interesseret i at udvikle molekyler, der selektivt kan binde til genomet og modulerer gen regulatoriske netværk. Polyamider sammensat af N -methylpyrrole og N methylimidazol er rationelt designet molekyler, der kan målrette DNA med særlige og affiniteter, som konkurrerende naturlige transskriptionsfaktorer. 3-6 Disse molekyler binder til specifikke sekvenser i minor groove i DNA. 4,5,7 -11 Polyamider er blevet anvendt til både at undertrykke og aktivere ekspression af specifikke gEnes. 4,12-19 De har også interessante antivirale 20-24 og anticancer 12,13,25-30 egenskaber. Et attraktivt element i polyamider er deres evne til at få adgang DNA-sekvenser, der er methylerede 31,32 og viklet rundt histon proteiner 9,10,33. Til måling af omfattende bindingsspecificiteter DNA-bindende molekyler, vores laboratorium skabte beslægtede sted identifikator (CSI) metode. 34-39 Den forudsagte forekomst af bindingssteder baseret på in vitro særegenheder (genomescapes) kan vises på genomet, fordi In vitro-binding intensiteter er direkte proportional med associationskonstanter (K a). 34,35,37 Disse genomescapes give indsigt i polyamid belægning på tværs af genomet, men måling af polyamid bindende i levende celler har været en udfordring. DNA er tæt pakket i kernen, hvilket kunne påvirke tilgængeligheden af ​​bindingssteder. A&#39;etccessibility af disse chromatinized DNA-sekvenser til polyamider forbliver et mysterium. For nylig, at mange metoder studere samspillet mellem små molekyler og nukleinsyrer er opstået. 40-48 Den affinitet opsamling og massivt-parallel DNA-sekventering (Chem-seq) er en sådan teknik. Chem-seq bruger formaldehyd til tværbinding små molekyler til et genomisk mål af interesse og et biotinyleret derivat af et lille molekyle af interesse til at fange den ligand-target interaktion. 48,49 Formaldehyd tværbinding fører til indirekte vekselvirkninger, der kan producere falske positiver. 50 Vi har udviklet en ny metode, tværbindingen af små molekyler til at isolere kromatin (COSMIC), 51 med en fototværbindende at fjerne disse såkaldte &quot;phantom&quot; toppe. 50 Til at begynde, vi designet og syntetiseret trifunktionelle derivater af polyamider. Disse molekyler indeholdt en DNA-bindende polyamide, en fototværbindende (psoralen), og en affinitet håndtaget (biotin, figur 1). Med trifunktionelle polyamider, kan vi kovalent fange polyamid-DNA interaktioner med 365 nm UV-bestråling, en bølgelængde, der ikke beskadiger DNA eller inducerer ikke-psoralen-baseret tværbinding. 51 Dernæst vi fragmentere genom og oprense det indfangede DNA under stringente, semi -denaturing betingelser for at mindske DNA, som er ikke-kovalent bundet. Således har vi vist COSMIC som en metode relateret til Chem-seq, men med en mere direkte udlæsning af DNA målretning. Vigtigere er det, svag (K 10 3 -10 4 M -1) affiniteten af psoralen til DNA ikke påviseligt indvirkning polyamid specificitet. 51,52 Den berigede DNA-fragmenter kan analyseres ved enten kvantitativ polymerase kædereaktion 51 (COSMIC-qPCR) eller ved næste generation sekventering 53 (COSMIC-seq). Disse data gør det muligt en fordomsfri, genom-styrede udformning af ligander, interhandle med deres ønskede genomiske loci og minimere ikke-tilsigtede virkninger. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/53510/53510fig1.jpg"/> Figur 1. Bioaktive polyamider og COSMIC ordning. (A) Hairpin polyamider 1 - 2 ud target DNA-sekvensen 5&#39;-WACGTW-3 &#39;. Lineære polyamider 3-4 mål 5&#39;-AAGAAGAAG-3 &#39;. Ringe af N-methylimidazol er fed skrift for klarhed. Åbne og udfyldte cirkler repræsenterer N -methylpyrrole og N methylimidazol, henholdsvis. Square repræsenterer 3-chlorthiophen og diamanter repræsenterer β-alanin. Psoralen og biotin er betegnet med P og B, hhv. (B) COSMIC ordning. Cellerne behandles med trifunktionelle derivater af polyamider. Efter tværbinding med 365 nm UV-bestråling, celler er lysed og genomisk DNA forskydes. Streptavidin-coatede magnetiske perler tilsættes til at indfange polyamid-DNA-addukter. DNA er frigivet og kan analyseres ved kvantitativ PCR (qPCR) eller ved næste generation sekventering (NGS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53510/53510fig1highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="727">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td style="width:180px;">any source</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:75px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Benzamidine</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pepstatin</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Proteinase K</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Other sources can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">StemPro&#174; Accutase&#174; Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>We have tried other manufacturers of DNA columns with success.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TruSeq ChIP Sample Prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>IP-202-1012</td>
			<td>This Kit can be used to prepare COSMIC DNA for next-generation sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td>Used to coat plates in order to grow H1 ESCs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH paper</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">amber microcentrifuge tubes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">microcentrifuge tubes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pyrex filter</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td>Pyrex baking dishes are suitable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">qPCR master mix</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HCl (6 N)</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10-cm tissue culture dishes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Serological pipettes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pasteur pipettes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette tips</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">15-mL conical tubes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">centrifuge</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">microcentrifuge</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">nutator</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnetic separation rack</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UV source</td>
			<td>CalSun</td>
			<td>B001BH0A1A</td>
			<td>Other UV sources can be used, but crosslinking time must be optimized empirically</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Misonix Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>S4000 with 431C1 cup horn</td>
			<td>Other sonicators can be used, but sonication conditions must be optimized empirically</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Humidified CO2 incubator</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biological safety cabinet with vacuum outlet</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide mapping of drug-dna interactions in cells with cosmic (crosslinking of small molecules to isolate chromatin)

Genomet er målet for nogle af de mest effektive kemoterapeutiske midler, men de fleste af disse lægemidler mangler DNA-sekvens specificitet, hvilket fører til dosisbegrænsende toksicitet og mange uønskede bivirkninger. Målretning genomet med sekvens-specifikke små molekyler kan gøre det muligt molekyler med øget terapeutisk indeks og færre off-target effekter. N -methylpyrrole / N -methylimidazol polyamider er molekyler, der kan rationelt designet til at målrette specifikke DNA-sekvenser med udsøgt præcision. Og i modsætning til de fleste naturlige transkriptionsfaktorer, kan polyamider binde sig til methylerede og chromatinized DNA uden tab i affinitet. Sekvensen specificitet polyamider er blevet grundigt undersøgt in vitro med beslægtede sted identifikation (CSI) og med traditionelle biokemiske og biofysiske metoder, men studiet af polyamid binding til genomiske mål i celler stadig vanskeligt at definere. Her rapporterer vi en fremgangsmåde til tværbinding af små molekyler isolate kromatin (COSMIC), der identificerer polyamid bindende websteder på tværs af genomet. COSMIC ligner chromatin immunoprecipitation (chip), men adskiller sig ved to vigtige måder: (1) en fototværbindende anvendes til at aktivere selektiv, tidsmæssigt styret indfangning af polyamid bindende begivenheder og (2) biotin affinitetshåndtag anvendes til at oprense polyamid -DNA-konjugater under semi-denaturerende betingelser for at mindske DNA, som er ikke-kovalent bundet. COSMIC er en generel strategi, som kan anvendes til at afsløre de genom-dækkende bindende begivenheder af polyamider og andre genom-targeting kemoterapeutiske midler.

For at tage højde for uensartet genom fragmentering og andre variabler, skal det oprensede DNA altid normaliseres mod en reference Input DNA. Primere specifikke for et locus af interesse, kan anvendes. Det er nyttigt at også analysere et locus hvor molekylet ikke forventes at binde, som en negativ kontrol. Vi ser en&gt; 100-fold stigning i polyamid belægning ved bestråling med 365-nm lys (figur 2). Beriget DNA kan også analyseres ved næste generation sekventering. DNA ...

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin at JoVE.com

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Genom-dækkende Kortlægning af lægemiddel-DNA interaktioner i celler med COSMIC (Tværbinding af små molekyler til at isolere Chromatin)

Identificere de direkte mål for genom-targeting molekyler stadig en stor udfordring. For at forstå hvordan DNA-bindende molekyler engagere genomet, vi udviklet en metode, der bygger på krydsbinding af små molekyler til at isolere kromatin (COSMIC).

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

En In vivo Crosslinking tilgang til Isoler proteinkomplekser Fra Drosophila Embryoner

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Genom-dækkende protein-protein-interaktion Screening af protein-fragmentet Komplementering Assay (PCA) i levende celler

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

Isolering af specifikke genomiske regioner og Identifikation af associerede molekyler ved enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

DamID-seq: Genome-wide Kortlægning af protein-DNA interaktioner af High Throughput sekventering af adenin-methylerede DNA fragmenter

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Forstærkning, Næste generations sekventering, og Genomisk DNA Kortlægning af retroviral integration steder

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...