Name: genome-wide mapping of drug-dna interactions in cells with cosmic (crosslinking of small molecules to isolate chromatin)
Uploaded: 2016-01-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin at JoVE.com

We thank members of the Ansari lab and Prof. Parameswaran Ramanathan for helpful discussions. This work was supported by NIH grants CA133508 and HL099773, the H.&#8197;I. Romnes faculty fellowship, and the W.&#8197;M. Keck Medical Research Award to A.Z.A. G.S.E. was supported by a Peterson Fellowship from the Department of Biochemistry and Molecular Biosciences Training Grant NIH T32 GM07215. A.E. was supported by the Morgridge Graduate Fellowship and the Stem Cell and Regenerative Medicine Center Fellowship, and D.B. was supported by the NSEC grant from NSF.

1. Crosslinking in levende cellen <ol><li> Te beginnen met ~ 2,5x10 7 H1 cellen, of andere gekweekte cellen. OPMERKING: Dit nummer van H1 cellen komt overeen met vijf 10-cm schalen (ongeveer 40% confluentie). </li><li> Groeien cellen in E8 media op schotels op een oppervlak dat pluripotente stamcellen ondersteunt bekleed (zie Materials List) en incubeer ze op 37 ° C in bevochtigde atmosfeer van 5% CO2. Oogst cellen enzymatisch (zie Materials List). Opmerking: Sta niet toe dat H1 cellen to...

One of the primary challenges with conventional ChIP is the identification of suitable antibodies. ChIP depends heavily upon the quality of the antibody, and most commercial antibodies are unacceptable for ChIP. In fact, the Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) consortium found only 20% of commercial antibodies to be suitable for ChIP assays.50 With COSMIC, antibodies are replaced by streptavidin. Because polyamides are functionalized with biotin, streptavidin is used in place of an antibody to capture polyam...

De informatie om elke cel in het lichaam wordt gecodeerd in DNA. Het selectief gebruik van deze informatie bepaalt het lot van een cel. Transcriptiefactoren (TFs) zijn eiwitten die binden aan specifieke DNA-sequenties van een bepaalde subset van de genen in het genoom expressie en de storing van TF is in verband met het ontstaan ​​van een breed scala aan ziekten, waaronder ontwikkelingsstoornissen, kanker en diabetes . 1,2 We hebben interesse in het ontwikkelen moleculen die selectief kan binden aan het genoom moduleren gen-regulerende netwerken zijn. Polyamiden samengesteld uit N -methylpyrrole en N -methylimidazole zijn rationeel ontworpen moleculen die DNA met specificiteiten en affiniteiten die rivaliserende natuurlijke transcriptiefactoren. 3-6 Deze moleculen binden aan specifieke sequenties in de kleine groef van DNA kunnen richten. 4,5,7 -11 Polyamiden zijn gebruikt om zowel Repress en activeren van de expressie van specifieke genes. 4,12-19 Ze hebben ook interessante antivirale 20-24 en antikanker 12,13,25-30 eigenschappen. Een aantrekkelijke eigenschap van polyamiden is hun vermogen om DNA-sequenties die zijn gemethyleerd 31,32 en rond histoneiwitten 9,10,33. Om de doorlopende bindingsspecificiteiten van DNA-bindende moleculen te meten, ons lab gemaakt de verwante plaats identifier (CSI) methode. 34-39 De voorspelde optreden van bindingsplaatsen op basis van in vitro specificiteiten (genomescapes) kan op het genoom worden weergegeven, omdat de in vitro binding intensiteiten zijn recht evenredig met associatie constanten (K a). 34,35,37 Deze genomescapes geven inzicht in polyamide bezettingsgraad over het genoom, maar het meten van polyamide verbindend in levende cellen is een uitdaging. DNA stevig verpakt in de kern, die de toegankelijkheid van bindingsplaatsen kunnen beïnvloeden. De eenccessibility van deze chromatinized DNA sequenties polyamiden blijft een mysterie. Onlangs zijn veel methoden om wisselwerkingen tussen kleine moleculen en nucleïnezuren ontstaan ​​bestuderen. 40-48 De chemische affiniteitsinvangmiddel en massaal parallelle DNA-sequencing (chem-seq) is een dergelijke techniek. Chem-seq gebruikt formaldehyde tot kleine moleculen verknopen een genomische doelwit van belang en een gebiotinyleerd derivaat van een klein molecuul van belang zijn voor de ligand-target interactie vangen. 48,49 Formaldehyde verknoping leidt tot indirect interacties die valse positieven produceren. 50 We ontwikkelden een nieuwe methode, de verknoping van kleine moleculen aan chromatine (COSMIC), 51 isoleren met een fotocrosslinker aan deze zogenaamde &quot;fantoom&quot; pieken elimineren. 50 te beginnen, We ontworpen en gesynthetiseerd trifunctionele derivaten van polyamiden. Deze moleculen bevatten een DNA-bindend polyamide een fotocrosslinker (psoraleen) en affiniteit handvat (biotine, figuur 1). Met trifunctionele polyamiden, kunnen we covalent vastleggen polyamide-DNA interacties met 365 nm UV-straling een golflengte die geen DNA wordt beschadigd of induceert zonder psoraleen-gebaseerde verknoping. 51 Vervolgens fragmenteren we het genoom en zuivert de gevangen DNA onder stringente, semi -denaturing voorwaarden DNA dat niet-covalent gebonden verlagen. Zo zien we COSMIC als een methode soortgelijk aan chem-seq, maar met een meer directe uitlezing van DNA richten. Belangrijk is dat de zwakke (Ka -10 10 3 4 M -1) affiniteit van psoraleen voor DNA niet detecteerbaar effect polyamide specificiteit. 51,52 de verrijkte DNA-fragmenten kan worden geanalyseerd met ofwel een kwantitatieve polymerasekettingreactie 51 (COSMIC-qPCR) of door het next-generation sequencing 53 (COSMIC-volgende). Deze gegevens maken een onpartijdige, genoom-geleide ontwerp van liganden die interhandelen met hun gewenste genomische loci en off-target effecten te minimaliseren. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53510/53510fig1.jpg"/> Figuur 1. Bioactieve polyamiden en kosmische plan. (A) Hairpin polyamiden 1-2 doelwit van de DNA-sequentie 5&#39;-WACGTW-3 &#39;. Lineaire polyamiden 3 - 4 doel 5&#39;-AAGAAGAAG-3 &#39;. Ringen van N-methylimidazool worden vet weergegeven voor de duidelijkheid. Open en gevulde cirkels vertegenwoordigen -methylpyrrole N en N -methylimidazole resp. Rechthoek stelt 3-chloorthiofeen en ruiten staan ​​β-alanine. Psoralen en biotine worden aangeduid met P en B, respectievelijk. (B) kosmische plan. Cellen worden behandeld met trifunctionele afgeleiden van polyamiden. Na verknoping met 365 nm UV- bestraling cellen lysed en genomische DNA wordt geschoren. Met streptavidine beklede magnetische parels worden toegevoegd aan polyamide-DNA adducten vangen. Het DNA wordt vrijgegeven en kan worden geanalyseerd door kwantitatieve PCR (qPCR) of next-generation sequencing (NGS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53510/53510fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="727">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td style="width:180px;">any source</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:75px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Benzamidine</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pepstatin</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Proteinase K</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Other sources can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">StemPro&#174; Accutase&#174; Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>We have tried other manufacturers of DNA columns with success.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TruSeq ChIP Sample Prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>IP-202-1012</td>
			<td>This Kit can be used to prepare COSMIC DNA for next-generation sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td>Used to coat plates in order to grow H1 ESCs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH paper</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">amber microcentrifuge tubes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">microcentrifuge tubes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pyrex filter</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td>Pyrex baking dishes are suitable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">qPCR master mix</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HCl (6 N)</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10-cm tissue culture dishes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Serological pipettes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pasteur pipettes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette tips</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">15-mL conical tubes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">centrifuge</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">microcentrifuge</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">nutator</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnetic separation rack</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UV source</td>
			<td>CalSun</td>
			<td>B001BH0A1A</td>
			<td>Other UV sources can be used, but crosslinking time must be optimized empirically</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Misonix Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>S4000 with 431C1 cup horn</td>
			<td>Other sonicators can be used, but sonication conditions must be optimized empirically</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Humidified CO2 incubator</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biological safety cabinet with vacuum outlet</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide mapping of drug-dna interactions in cells with cosmic (crosslinking of small molecules to isolate chromatin)

Het genoom is het doelwit van een aantal van de meest effectieve chemotherapeutica, maar de meeste van deze geneesmiddelen missen DNA-sequentie specificiteit, wat leidt tot dosisbeperkende toxiciteit en vele bijwerkingen. Gericht op het genoom met sequentie-specifieke kleine moleculen kan moleculen met verhoogde therapeutische index en minder off-target effecten mogelijk. -methylpyrrole N / N -methylimidazole polyamiden moleculen die rationeel kunnen worden ontworpen om specifieke DNA-sequenties met uitstekende precisie richten. En in tegenstelling tot de meeste natuurlijke transcriptiefactoren, kunnen polyamiden binden aan gemethyleerd en chromatinized DNA zonder een verlies in affiniteit. De sequentie specificiteit van polyamiden is uitgebreid bestudeerd in vitro cognate locatie identificatie (CSI) en traditionele biochemische en biofysische benaderingen, maar de studie van polyamide binden aan genomisch doelen in cellen blijft ongrijpbaar. Hier beschrijven we een werkwijze het verknopen van kleine moleculen Isolate chromatine (COSMIC), dat identificeert polyamide bindende locaties in het genoom. COSMIC is vergelijkbaar met chromatine immunoprecipitatie (ChIP), maar verschilt op twee belangrijke manieren: (1) een fotocrosslinker wordt toegepast om selectief, temporeel-gestuurde opname van polyamide bindingsgebeurtenissen, en (2) het biotine affiniteit handvat wordt gebruikt om polyamide te zuiveren inschakelen -DNA conjugaten onder semi-denaturerende omstandigheden aan DNA dat niet-covalent gebonden verlagen. COSMIC is een algemene strategie die kan worden gebruikt om genoom-brede bindingsgebeurtenissen polyamiden en andere genoom-gerichte chemotherapeutische middelen te onthullen.

Ter compensatie van niet-uniforme genoom fragmentatie en andere variabelen, moet het gezuiverde DNA altijd genormaliseerd tegen een referentie van input-DNA. Primers specifiek voor een locus van belang kunnen worden gebruikt. Het is nuttig om ook te analyseren een locus waarbij het molecuul niet verwacht binden, als negatieve controle. We zien een&gt; 100-voudige toename van polyamide bezettingsgraad bij bestraling met 365-nm licht (Figuur 2). Verrijkte DNA kan ook worden ge...

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin at JoVE.com

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Genoombrede kartering van Drug-DNA interacties in cellen met kosmische (Crosslinking van kleine moleculen te isoleren chromatine)

Het identificeren van de directe doelstellingen van genoom-gerichte moleculen blijft een grote uitdaging. Om te begrijpen hoe DNA-bindende moleculen die aangrijpen op de genoom, ontwikkelden we een methode die is gebaseerd op de verknoping van kleine moleculen aan chromatine isoleren (COSMIC).

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

Genoom-brede analyse van aminoacylatie (Charging) niveaus van tRNA Met behulp van Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Genoom-brede analyse met behulp van chip Isoform-specifieke Gene targets te identificeren

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

iClip - Transcriptome-breed in kaart brengen van eiwit-RNA Interacties met Individual Nucleotide resolutie

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatine Interactie Analyse met gepaarde-End Tag Sequencing (Chia-PET) voor het in kaart brengen van chromatine Interacties en begrijpen Transcriptie Verordening

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genoom-brede gendeleties in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Door High Throughput PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Een In vivo Crosslinking Aanpak eiwitcomplexen te isoleren van Drosophila Embryo&#39;s

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Genoom-brede Eiwit-eiwit Interactie Screening door Eiwit-fragment Complementatie Assay (PCA) in levende cellen

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

Isolatie van specifieke genomische regio en identificatie van geassocieerde moleculen door enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

Damid-seq: Genoom-brede kaart brengen van eiwit-DNA-interacties door High Throughput Sequencing van adenine gemethyleerd DNA-fragmenten

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Versterking, next-generation sequencing en Genomic DNA in kaart brengen van retrovirale integratie Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...