Name: genome-wide mapping of drug-dna interactions in cells with cosmic (crosslinking of small molecules to isolate chromatin)
Uploaded: 2016-01-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin at JoVE.com

We thank members of the Ansari lab and Prof. Parameswaran Ramanathan for helpful discussions. This work was supported by NIH grants CA133508 and HL099773, the H.&#8197;I. Romnes faculty fellowship, and the W.&#8197;M. Keck Medical Research Award to A.Z.A. G.S.E. was supported by a Peterson Fellowship from the Department of Biochemistry and Molecular Biosciences Training Grant NIH T32 GM07215. A.E. was supported by the Morgridge Graduate Fellowship and the Stem Cell and Regenerative Medicine Center Fellowship, and D.B. was supported by the NSEC grant from NSF.

1. Crosslinking בתאים חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תתחיל עם 2.5x10 ~ 7 תאי H1, או תאים בתרבית אחרים. הערה: מספר זה של תאי H1 מתאים לחמש מנות של 10 סנטימטר (confluency כ -40%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים בתקשורת E8 על מנות מצופים על משטח שתומך בתאי ג?...

One of the primary challenges with conventional ChIP is the identification of suitable antibodies. ChIP depends heavily upon the quality of the antibody, and most commercial antibodies are unacceptable for ChIP. In fact, the Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) consortium found only 20% of commercial antibodies to be suitable for ChIP assays.50 With COSMIC, antibodies are replaced by streptavidin. Because polyamides are functionalized with biotin, streptavidin is used in place of an antibody to capture polyam...

המידע להפוך כל תא בגוף האדם מקודד בדנ&quot;א. השימוש סלקטיבי במידע שמסדיר את גורלו של תא. גורמי שעתוק (TFS) הם חלבונים שנקשרים לרצפי DNA ספציפיים להביע משנה מסוים של גנים בגנום, והתקלה של TFS צמודה לתחילתה של מגוון רחב של מחלות, כולל פגמים התפתחותיים, סרטן, סוכרת ו . 1,2 אנחנו כבר מתעניינים בפיתוח מולקולות שיכולות באופן סלקטיבי להיקשר לגנום ולווסת רשתות רגולציה גן. Polyamides מורכבת מ-methylpyrrole N ו- N -methylimidazole הם מעוצבים באופן רציונלי מולקולות שיכולים למקד את ה- DNA עם ספציפיות וזיקות שגורמים יריבים טבעיים שעתוק. 3-6 מולקולות אלה נקשרים לרצפים ספציפיים בחריץ הקטן של ה- DNA. 4,5,7 -11 Polyamides להיות מועסק לשני להדחיק ולהפעיל את הביטוי של ז הספציפיEnes. 4,12-19 יש להם גם תכונות אנטי 12,13,25-30 20-24 ואנטי סרטניות מעניינות. תכונה מושכת אחד מפוליאמידים היא היכולת שלהם כדי לגשת לרצפי DNA המפוגלים 31,32 ועוטפים את חלבוני היסטון 9,10,33. כדי למדוד את ספציפיות מחייבות המקיפה של מולקולות ה- DNA מחייבת, המעבדה שלנו יצרה מזהה אתרו מקור השיטה (CSI). 34-39 ההתרחשות הצפויה של אתרי קישור המבוסס על במבחנה ספציפיות (genomescapes) יכול להיות מוצג בגנום, כי במבחנה עוצמות מחייבות הן ביחס ישר לקבועי עמותה (K). 34,35,37 genomescapes אלה מספק תובנה תפוסת פוליאמיד פני הגנום, אבל פוליאמיד מדידה מחייב בתאים חיים כבר אתגר. ה- DNA ארוז היטב בגרעין, שעלול להשפיע על הנגישות של אתרי קישור.ccessibility של רצפי DNA chromatinized אלה למפוליאמידים נשאר בגדר תעלומה. לאחרונה, שיטות רבות ללמוד אינטראקציות בין מולקולות קטנות וחומצות גרעין צמחו. 40-48 הלכידה הכימית הזיקה ורצפי DNA מקבילים מסיבי (Chem-seq) הוא טכניקה אחת כזו. Chem-seq משתמש פורמלדהיד לcrosslink מולקולות קטנות ליעד הגנומי של ריבית ונגזרת biotinylated של מולקולה קטנה של עניין כדי ללכוד את האינטראקציה יגנד-היעד. 48,49 crosslinking פורמלדהיד מוביל לאינטראקציות עקיפות שיכול לייצר תוצאות חיוביות שגויות. 50 פיתחנו שיטה חדשה, crosslinking של מולקולות קטנות לבודד את הכרומטין (קוסמי), 51 עם photocrosslinker לחסל פסגות אלה מה שנקרא &quot;פנטום&quot;. 50 כדי להתחיל, עיצבנו ומסונתז נגזרי trifunctional של מפוליאמידים. מולקולות אלה הכילו Pol ה- DNA מחייבתyamide, photocrosslinker (psoralen), וידית זיקה (ביוטין, איור 1). עם מפוליאמידים trifunctional, אנחנו יכולים קוולנטית ללכוד אינטראקציות פוליאמיד-DNA עם קרינת UV 365 ננומטר, אורך גל שאינו לגרום נזק לדנ&quot;א או לגרום crosslinking-לא-psoralen מבוססת. 51 הבא, אנו מפצלים את הגנום ולטהר את ה- DNA שנתפס תחת מחמיר, חצי תנאי -denaturing להקטין DNA שהוא אינן מחויב קוולנטית. לפיכך, אנו רואים COSMIC כשיטה הקשורים לכימיה-seq, אבל עם קריאת נתונים ישירים יותר של ה- DNA מיקוד. חשוב לציין, החלש (K 10 3 -10 4 M -1) זיקה של psoralen לDNA לא במובחן, פוליאמיד השפעה סגוליות. 51,52 ניתן לנתח קטעי DNA המועשר או על ידי תגובת השרשרת של פולימראז כמותיים 51 (קוסמי qPCR) או על ידי רצף 53 (COSMIC-seq) של הדור הבא. נתונים אלה מאפשרים עיצוב של ligands משוחד, מודרך הגנום שביןלפעול עם הלוקוסים הגנומי הרצויים שלהם ולמזער את ההשפעות חוץ-היעד. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53510/53510fig1.jpg"/> איור 1. מפוליאמידים ביו ותכנית קוסמית. () מפוליאמידים מכבנה 1 - 2 יעד רצף ה- DNA 5&#39;-WACGTW-3 &quot;. מפוליאמידים יניארי 3 - 4 יעד 5&#39;-AAGAAGAAG-3 &quot;. טבעות של N-methylimidazole מודגשות לבהירות. חוגים פתוחים ומילאו לייצג -methylpyrrole N ו-methylimidazole N, בהתאמה. הכיכר מייצגת 3-chlorothiophene, ויהלומים מייצגים β-אלאנין. Psoralen וביוטין מסומנים על ידי P ו- B, בהתאמה. תכנית קוסמית (B). תאי מטופלים עם נגזרי trifunctional של מפוליאמידים. לאחר crosslinking עם קרינת UV 365 ננומטר, תאים LDNA ysed והגנומי הוא טעון. חרוזים מגנטיים streptavidin המצופה מתווספים ללכוד adducts פוליאמיד-DNA. ה- DNA משתחרר ויכול להיות מנותחת על ידי PCR כמותית (QPCR) או על ידי רצף של הדור הבא (NGS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53510/53510fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="727">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td style="width:180px;">any source</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:75px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Benzamidine</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pepstatin</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Proteinase K</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Other sources can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">StemPro&#174; Accutase&#174; Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>We have tried other manufacturers of DNA columns with success.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TruSeq ChIP Sample Prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>IP-202-1012</td>
			<td>This Kit can be used to prepare COSMIC DNA for next-generation sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td>Used to coat plates in order to grow H1 ESCs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH paper</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">amber microcentrifuge tubes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">microcentrifuge tubes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pyrex filter</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td>Pyrex baking dishes are suitable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">qPCR master mix</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HCl (6 N)</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10-cm tissue culture dishes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Serological pipettes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pasteur pipettes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette tips</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">15-mL conical tubes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">centrifuge</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">microcentrifuge</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">nutator</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnetic separation rack</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UV source</td>
			<td>CalSun</td>
			<td>B001BH0A1A</td>
			<td>Other UV sources can be used, but crosslinking time must be optimized empirically</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Misonix Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>S4000 with 431C1 cup horn</td>
			<td>Other sonicators can be used, but sonication conditions must be optimized empirically</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Humidified CO2 incubator</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biological safety cabinet with vacuum outlet</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide mapping of drug-dna interactions in cells with cosmic (crosslinking of small molecules to isolate chromatin)

הגנום הוא היעד של חלק מchemotherapeutics היעיל ביותר, אבל רוב התרופות האלה חסרות ייחוד רצף ה- DNA, מה שמוביל לרעילות ורבות תופעות לוואי שליליות הגבלת מינון. מיקוד הגנום עם מולקולות קטנות רצף ספציפי עשויה לאפשר מולקולות עם מדד טיפולי מוגבר ופחות השפעות חוץ-היעד. -methylpyrrole N / מפוליאמידים -methylimidazole N הם מולקולות שיכולים להיות מתוכנן בצורה רציונלית למקד רצפי DNA ספציפיים בדייקנות מופלאה. ושלא כמו גורמי שעתוק הטבעיים ביותר, מפוליאמידים יכולים להיקשר ל- DNA מפוגל וchromatinized ללא הפסד בזיקה. הסגוליות הרצף של מפוליאמידים נחקר בהרחבה במבחנה עם זיהוי אתרו מקור (CSI) ועם גישות ביוכימיות וbiophysical מסורתיות, אבל המחקר של פוליאמיד מחייב מטרות הגנומי בתאים נותר חמקמק. כאן אנו מדווחים על שיטה, crosslinking של מולקולות קטנות לאיזולההכרומטין te (קוסמי), המזהה אתרי פוליאמיד מחייב על פני הגנום. COSMIC דומה לimmunoprecipitation הכרומטין (שבב), אך שונה בשתי דרכים חשובות: (1) photocrosslinker מועסק כדי לאפשר לכידה סלקטיבית, באופן זמני בשליטה של ​​אירועים מחייבים פוליאמיד, ו- (2) ידית זיקת ביוטין משמשת כדי לטהר פוליאמיד conjugates -DNA בתנאי denaturing-למחצה כדי להקטין את ה- DNA שהוא אינן מחויב קוולנטית. קוסמי הוא אסטרטגיה כללית שניתן להשתמש בי כדי לחשוף את האירועים מחייבים הגנום של מפוליאמידים ותרופות כימותרפיות מיקוד הגנום אחרים.

כדי להסביר את פיצול הגנום לא אחיד ומשתנים אחרים, את ה- DNA המטוהר תמיד צריך להיות מנורמל נגד התייחסות של ה- DNA קלט. ניתן להשתמש בפריימרים ספציפיים למוקד של עניין. זה מועיל גם לנתח מוקד שבו המולקולה אינה צפויה לאגד, כביקורת שלילית. אנו רואים עלייה&gt; פי 100 בתפוסת פוליאמיד על...

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin at JoVE.com

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

מיפוי הגנום של תרופות-DNA בתאי אינטראקציות עם COSMIC (Crosslinking של מולקולות קטנות לבודד הכרומטין)

זיהוי המטרות הישירות של מולקולות מיקוד הגנום עדיין מהווה אתגר גדול. כדי להבין כיצד מולקולות ה- DNA מחייבת לעסוק הגנום, פיתחנו שיטה המסתמכת על crosslinking של מולקולות קטנות לבודד את הכרומטין (קוסמי).

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

הגנום כולו ניתוח (טעינה) רמות Aminoacylation של tRNA שימוש microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

הגנום כולו ניתוח באמצעות שבב זיהוי איזופורם ספציפי מטרות ג&#39;ין

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

iCLIP - Transcriptome רחב מיפוי של חלבון-RNA אינטראקציות עם רזולוציה נוקלאוטיד יחיד

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

הכרומטין ניתוח אינטראקציה עם מנבא סוף תג הרצף (Chia-PET) עבור מיפוי אינטראקציות הכרומטין הבנת תקנה תמלול

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

מחיקות Gene הגנום ב<em&gt; סטרפטוקוקוס sanguinis</em&gt; על ידי תפוקה הגבוהה PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

In vivo גישת Crosslinking לבודד חלבון מן מכלולים דרוזופילה עוברים

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

הקרנת הגנום כל חלבונים אינטראקציה ידי חלבון-בר השלמה Assay (PCA) בתאים חיים

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

בידוד של אזורים הגנומי ספציפיים וזיהוי של Associated מולקולות על ידי enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

DamID-seq: מיפוי הגנום של אינטראקציות החלבון-DNA על ידי תפוקה גבוהה רצף של קטעי DNA-מפוגל אדנין

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...