Name: genome-wide mapping of drug-dna interactions in cells with cosmic (crosslinking of small molecules to isolate chromatin)
Uploaded: 2016-01-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin at JoVE.com

We thank members of the Ansari lab and Prof. Parameswaran Ramanathan for helpful discussions. This work was supported by NIH grants CA133508 and HL099773, the H.&#8197;I. Romnes faculty fellowship, and the W.&#8197;M. Keck Medical Research Award to A.Z.A. G.S.E. was supported by a Peterson Fellowship from the Department of Biochemistry and Molecular Biosciences Training Grant NIH T32 GM07215. A.E. was supported by the Morgridge Graduate Fellowship and the Stem Cell and Regenerative Medicine Center Fellowship, and D.B. was supported by the NSEC grant from NSF.

生きた細胞内の1架橋<ol><li> 〜2.5×10の7 H1細胞、または他の培養細胞で始まります。 注：H1細胞のこの数は、5〜10 cmのディッシュ（約40％の集密度）に相当します。 </li><li>多能性幹細胞をサポートする表面上にコーティングされた皿上E8培地中で細胞を成長させる（材料リストを参照）、および5％CO 2の加湿雰囲気中、37℃でそれらをインキュベートします。収穫細胞は酵?...

One of the primary challenges with conventional ChIP is the identification of suitable antibodies. ChIP depends heavily upon the quality of the antibody, and most commercial antibodies are unacceptable for ChIP. In fact, the Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) consortium found only 20% of commercial antibodies to be suitable for ChIP assays.50 With COSMIC, antibodies are replaced by streptavidin. Because polyamides are functionalized with biotin, streptavidin is used in place of an antibody to capture polyam...

人体内の各セルを作るための情報は、DNAにコードされています。その情報を選択的に使用することは、細胞の運命を支配します。転写因子（TFS）は、ゲノム中の遺伝子の特定のサブセットを表現するために、特定のDNA配列に結合するタンパク質であり、TFの誤動作を発達障害、癌、および糖尿病を含む、疾患の広い配列の発現に連結されています。1,2私たちは、選択的ゲノムに結合し、遺伝子調節ネットワークを調節することができる分子の開発に興味を持っていました。 ポリアミドは、N個の -methylpyrroleで構成され、Nライバル天然の転写因子。3-6これらの分子は、DNAの副溝内の特定の配列に結合特異性および親和性を有するDNAを標的とすることができる分子を-methylimidazole合理的に設計されています。4,5,7 -11ポリアミドは、両方の抑制に用いられ、特定のグラムの発現を活性化されていますエン。4,12-19また興味深い20-24抗ウイルス及び抗がん12,13,25-30特性を有しています。ポリアミドの1つの魅力的な特徴は、31,32メチル化とヒストンタンパク質9,10,33に巻き付けているDNA配列にアクセスする能力です。 DNA結合分子の総合的な結合特異性を測定するために、私たちの研究室では、同族のサイト識別子（CSI）メソッドを作成しました。34-39ためのin vitro特異性（genomescapes）に基づいて結合部位の予測発生は、ゲノム上に表示することができますin vitroでの結合強度が会合定数に正比例する（K A）。34,35,37これらgenomescapesは、ゲノム全体のポリアミド占有への洞察を提供しますが、生細胞内で結合を測定するポリアミドが課題でした。 DNAはしっかりと結合サイトのアクセシビリティに影響を与える可能性が核にパッケージされています。 Aポリアミドにこれらのchromatinized DNA配列のccessibilityは謎のまま。 最近では、小分子および核酸の間の相互作用を研究する多くの方法が出現している。40-48化学的親和性のキャプチャと超並列DNAシーケンシング（CHEM-SEQ）は、このような技術の一つです。 CHEM-配列は、リガンド-標的相互作用を捕捉するために、関心のゲノム標的と関心の小分子のビオチン化誘導体に小分子を架橋させるために、ホルムアルデヒドを使用しています。48,49 ホルムアルデヒドは、偽陽性を生成することができます間接的な相互作用にリードを架橋する。50私たちはこれらのいわゆる「ファントム」のピークを排除するために光架橋剤とクロマチン（COSMIC）、51を分離するための新しい方法、小分子の架橋を開発した。50開始するには、我々は、設計およびポリアミドの三官能性誘導体が合成されました。これらの分子は、DNA結合POLを含まyamide、光架橋（ソラレン）、および親和性ハンドル（ビオチン、 図1）。三官能性ポリアミドと、我々は共有結合365 nmの紫外線照射、DNAに損傷を与えたり、非ソラレン系架橋を誘導しない波長のポリアミド-DNA相互作用をキャプチャすることができます。51次に、我々はゲノムを断片化し、厳しい、セミ下で撮影DNAを精製非共有結合しているDNAを減少させるための条件を-denaturing。そこで、CHEM-配列に関連する方法として、宇宙観が、DNAのより直接的な読み出しをターゲットに。重要なことには、弱い（K 10 3〜10 4 M -1）DNA用ソラレンの親和性はしない検出衝撃ポリアミド特異。51,52富化DNAフラグメントは、定量的ポリメラーゼ連鎖反応51のいずれかにより分析することができる（COSMIC、定量PCR）または、次世代シーケンシング53（COSMIC-SEQ）によります。これらのデータは、インターリガンドの公平な、ゲノム誘導設計を可能にそれらの所望のゲノム遺伝子座を持って行動し、オフターゲット効果を最小化します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53510/53510fig1.jpg"/> 図1.生理活性ポリアミドおよびCOSMIC方式 。 （A）ヘアピンポリアミド1 - 2の標的DNA配列5&#39;-WACGTW-3 &#39;。リニアポリアミド3から4ターゲット5&#39;-AAGAAGAAG-3 &#39;。 N-メチルイミダゾールのリングは、明確にするために太字されています。オープンと黒丸はそれぞれ、N個の -methylpyrrole と N -methylimidazoleを表します。広場は3クロロチオフェンを表し、ダイヤモンドは、βアラニンを表します。ソラレンおよびビオチンは、それぞれ、P及びBで示されています。 （B）COSMIC方式。細胞は、ポリアミドの三官能性誘導体を用いて処理されます。 365 nmのUV照射で架橋した後、細胞を、LでありますysedゲノムDNAを剪断します。ストレプトアビジン被覆磁気ビーズは、ポリアミド-DNA付加体を捕捉するために添加されます。 DNAが放出され、定量PCR（定量PCR）によって、あるいは、次世代シーケンシング（NGS）によって分析することができる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53510/53510fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="727">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td style="width:180px;">any source</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:75px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Benzamidine</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pepstatin</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Proteinase K</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Other sources can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">StemPro&#174; Accutase&#174; Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>We have tried other manufacturers of DNA columns with success.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TruSeq ChIP Sample Prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>IP-202-1012</td>
			<td>This Kit can be used to prepare COSMIC DNA for next-generation sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td>Used to coat plates in order to grow H1 ESCs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH paper</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">amber microcentrifuge tubes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">microcentrifuge tubes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pyrex filter</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td>Pyrex baking dishes are suitable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">qPCR master mix</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HCl (6 N)</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10-cm tissue culture dishes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Serological pipettes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pasteur pipettes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette tips</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">15-mL conical tubes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">centrifuge</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">microcentrifuge</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">nutator</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnetic separation rack</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UV source</td>
			<td>CalSun</td>
			<td>B001BH0A1A</td>
			<td>Other UV sources can be used, but crosslinking time must be optimized empirically</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Misonix Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>S4000 with 431C1 cup horn</td>
			<td>Other sonicators can be used, but sonication conditions must be optimized empirically</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Humidified CO2 incubator</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biological safety cabinet with vacuum outlet</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide mapping of drug-dna interactions in cells with cosmic (crosslinking of small molecules to isolate chromatin)

ゲノムは、最も効果的な化学療法剤のいくつかの標的であるが、これらの薬剤の多くは、用量を制限する毒性および多くの有害な副作用をもたらすDNA配列特異性を欠いています。配列特異的な小分子でゲノムをターゲットに増加し、治療指数、より少ないオフターゲット効果を有する分子を可能にすることができる。N -methylpyrrole / N -methylimidazoleポリアミドは合理的に絶妙な精度で特定のDNA配列を標的とするように設計することができる分子です。そして、最も自然な転写因子とは異なり、ポリアミドは、親和性の損失なしにメチル化及びchromatinized DNAに結合することができます。ポリアミドの配列特異性が広く、同族サイトの識別（CSI）で、伝統的な生化学的および生物物理学的ア ​​プローチを用いてインビトロで研究されているが、細胞内のゲノム標的に結合するポリアミドの研究では、とらえどころのないまま。ここでは、方法、イゾラへの小分子の架橋を報告テクロマチン（COSMIC）が、それは、ゲノム全体のポリアミド結合部位を特定します。 COSMICは、クロマチン免疫沈降（チップ）と同様であるが、2つの重要な点で異なる：（1）光架橋剤は、結合事象ポリアミドの選択的、時間的に制御された取り込みを可能にするために用いられ、（2）ビオチン親和性ハンドルがポリアミドを精製するために使用され非共有結合しているDNAを減少させる半変性条件下-DNA複合体。 COSMICは、ポリアミドおよび他のゲノム標的の化学療法薬のゲノムワイドな結合事象を明らかにするために使用することができる一般的な戦略です。

不均一なゲノム断片化と他の変数を説明するために、精製されたDNAは常にインプットDNAの基準に対して正規化する必要があります。関心対象の遺伝子座に特異的なプライマーを使用することができます。また、陰性対照として、分子が結合すると予想されていない遺伝子座を分析するために有用です。我々は、365 nmの光（ 図2）の照射によりポリアミド占有で&gt; 100倍の増加を参?...

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Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

COSMICと細胞の薬剤-DNA相互作用のゲノムワイドなマッピング（小分子の架橋は、クロマチンを分離するために）

ゲノム標的分子の直接の標的を同定することは、主要な課題です。 DNA結合分子はゲノムを従事する方法を理解するために、我々は、クロマチン（COSMIC）を単離するための小分子の架橋に依存する方法を開発しました。

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

マイクロアレイを用いたtRNAのアミノアシル化（充電）レベルのゲノムワイド解析

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

アイソフォーム特異的遺伝子標的を同定するためのチップを使用してゲノムワイド解析

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

iCLIP - トランスクリプトーム全体の個々のヌクレオチド分解能タンパク質- RNA相互作用のマッピング

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

クロマチンの相互作用のマッピングと転写調節を理解するためのペアエンドタグシーケンシング（CHIA-PET）によるクロマチンの相互作用の解析

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

ゲノムワイドな遺伝子欠失で<em&gt;ストレプトコッカス血統</em&gt;ハイスループットPCRによる

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

アン in vivoで</emからのタンパク質複合体を分離するために>架橋アプローチショウジョウバエ胚

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

生細胞内のタンパク質断片相補アッセイ（PCA）によるゲノムワイドなタンパク質間相互作用のスクリーニング

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

enChIPによって特定のゲノム領域と関連する分子の同定の単離

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

DamID-配列：アデニンメチル化DNA断片のハイスループットシークエンシングによるタンパク質-DNA相互作用のゲノムワイドなマッピング

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

レトロウイルス統合サイトの増幅、次世代シーケンシング、およびゲノムDNAのマッピング

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...