Name: genome-wide mapping of drug-dna interactions in cells with cosmic (crosslinking of small molecules to isolate chromatin)
Uploaded: 2016-01-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin at JoVE.com

We thank members of the Ansari lab and Prof. Parameswaran Ramanathan for helpful discussions. This work was supported by NIH grants CA133508 and HL099773, the H.&#8197;I. Romnes faculty fellowship, and the W.&#8197;M. Keck Medical Research Award to A.Z.A. G.S.E. was supported by a Peterson Fellowship from the Department of Biochemistry and Molecular Biosciences Training Grant NIH T32 GM07215. A.E. was supported by the Morgridge Graduate Fellowship and the Stem Cell and Regenerative Medicine Center Fellowship, and D.B. was supported by the NSEC grant from NSF.

1. Fornetting i levende celler <ol><li> Begynn med ~ 2.5x10 7 H1 celler, eller andre dyrkede celler. MERK: Dette nummeret av H1 celler tilsvarer fem 10-cm retter (ca. 40% konfluens). </li><li> Grow celler i E8 media på retter belagt på en overflate som støtter pluripotente stamceller (se Materials List), og inkuber dem ved 37 ° C i fuktig atmosfære med 5% CO 2. Høste celler enzymatisk (se Materials List). Merk: Ikke la H1 celler til å overstige 90% confluency; confluency induserer s...

One of the primary challenges with conventional ChIP is the identification of suitable antibodies. ChIP depends heavily upon the quality of the antibody, and most commercial antibodies are unacceptable for ChIP. In fact, the Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) consortium found only 20% of commercial antibodies to be suitable for ChIP assays.50 With COSMIC, antibodies are replaced by streptavidin. Because polyamides are functionalized with biotin, streptavidin is used in place of an antibody to capture polyam...

Den informasjon for å gjøre hver celle i kroppen er kodet i DNA. Den selektive bruk av denne informasjonen styrer skjebnen til en celle. Transkripsjonsfaktorer (TFS) er proteiner som binder seg til spesifikke DNA-sekvenser for å uttrykke en bestemt undergruppe av gener i genomet, og funksjonsfeil i TFS er knyttet til starten av en lang rekke sykdommer, inkludert utviklingsdefekter, kreft og diabetes . 1,2 Vi har vært interessert i å utvikle molekyler som selektivt kan binde til genomet og modulerer gen regulatoriske nettverk. Polyamider består av N -methylpyrrole og N metylimidazol er rasjonelt utformet molekyler som kan målrette DNA med særegenheter og slektskap som rivaliserende naturtranskripsjonsfaktorer. 3-6 Disse molekylene binder seg til spesifikke sekvenser i mindre sporet av DNA. 4,5,7 -11 Polyamider har vært ansatt både undertrykke og aktivere uttrykk for spesifikke gEnes. 4,12-19 De har også interessante antivirale 20-24 og kreft 12,13,25-30 egenskaper. En attraktiv funksjon av polyamider er deres evne til å få tilgang til DNA-sekvenser som er metylert 31,32 og pakket rundt histonproteiner 9,10,33. For å måle de omfattende bindingsspesifisiteter av DNA-bindende molekyler, vårt laboratorium opprettet beslektet område identifikator (CSI) -metoden. 34-39 Den antatte forekomsten av bindingsseter basert på in vitro-spesifisiteter (genomescapes) kan vises på genomet, fordi in vitro bindende intensiteter er direkte proporsjonal med foreningen konstanter (K a). 34,35,37 Disse genomescapes gi innsikt i polyamid belegg over genomet, men måle polyamid bindende i levende celler har vært en utfordring. DNA er tett pakket i kjernen, noe som kan påvirke tilgjengeligheten av bindingssteder. Accessibility av disse chromatinized DNA-sekvenser til polyamider forblir et mysterium. Nylig, til mange metoder studere samspillet mellom små molekyler og nukleinsyrer har dukket opp. 40-48 Den affinitet fangst og massivt-parallell DNA-sekvensering (chem-seq) er en slik teknikk. Chem-seq bruker formaldehyd for å kryssbinde små molekyler til et genomisk mål av interesse og et biotinylert derivat av et lite molekyl av interesse å fange ligand-target-interaksjon. 48,49 Formaldehyd kryssbinding fører til indirekte vekselvirkninger som kan produsere falske positiver. 50 Vi har utviklet en ny metode, kryssbindingen av små molekyler å isolere kromatin (COSMIC), 51 med en photocrosslinker å eliminere disse såkalte &quot;fantom&quot; topper. 50 til å begynne, vi designet og syntetisert trifunksjonelle derivater av polyamider. Disse molekylene inneholdt et DNA-bindende polyamide, en photocrosslinker (psoralen), og en tilhørighet håndtaket (biotin, figur 1). Med trifunksjonelle polyamider, kan vi kovalent fange polyamid-DNA-interaksjoner med 365 nm UV-bestråling, en bølgelengde som ikke skader DNA eller indusere ikke-psoralen-baserte tverrbinding. 51 Deretter vi fragmentere genomet og rense det oppfangede DNA under strenge, semi -denaturing betingelser for å redusere DNA som er ikke-kovalent bundet. Således ser vi på kosmiske som en metode relatert til chem-seq, men med en mer direkte avlesning av DNA målretting. Viktigere, svak (K 10 3 -10 4 M -1) psoralen affinitet for DNA ikke påviselig effekt polyamid spesifisitet. 51,52 anriket DNA-fragmenter kan analyseres enten ved kvantitativ polymerasekjedereaksjon 51 (kosmiske-qPCR) eller ved neste generasjons sekvense 53 (COSMIC-seq). Disse data aktivere en objektiv, genom styrt design av ligander som interopptre med sine ønskede genomisk loci og minimere off-target effekter. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/53510/53510fig1.jpg"/> Figur 1. Bioaktive polyamider og COSMIC ordningen. (A) hårnål polyamider 1 - 2 målet DNA-sekvensen 5&#39;-WACGTW-3 &#39;. Lineære polyamider med 3 - 4 mål 5&#39;-AAGAAGAAG-3 &#39;. Ringer av N-methylimidazole er uthevet for klarhet. Åpne og fylte sirklene representerer N -methylpyrrole og N metylimidazol hhv. Square representerer tre-klortiofen og diamanter representerer β-alanin. Psoralen og biotin er betegnet med P og B, respektivt. (B) COSMIC ordningen. Celler behandles med trifunksjonelle derivater av polyamider. Etter kryssbinding med 365 nm UV-bestråling, cellene er lysed og genomisk DNA er skåret. Streptavidin-belagte magnetiske kuler blir tilsatt for å fange opp polyamid-DNA-addukter. DNA frigjøres og kan analyseres ved kvantitativ PCR (qPCR) eller ved neste generasjons sekvensering (NGS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53510/53510fig1highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="727">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td style="width:180px;">any source</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:75px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Benzamidine</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pepstatin</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Proteinase K</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Other sources can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">StemPro&#174; Accutase&#174; Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>We have tried other manufacturers of DNA columns with success.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TruSeq ChIP Sample Prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>IP-202-1012</td>
			<td>This Kit can be used to prepare COSMIC DNA for next-generation sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td>Used to coat plates in order to grow H1 ESCs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH paper</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">amber microcentrifuge tubes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">microcentrifuge tubes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pyrex filter</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td>Pyrex baking dishes are suitable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">qPCR master mix</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HCl (6 N)</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10-cm tissue culture dishes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Serological pipettes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pasteur pipettes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette tips</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">15-mL conical tubes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">centrifuge</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">microcentrifuge</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">nutator</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnetic separation rack</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UV source</td>
			<td>CalSun</td>
			<td>B001BH0A1A</td>
			<td>Other UV sources can be used, but crosslinking time must be optimized empirically</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Misonix Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>S4000 with 431C1 cup horn</td>
			<td>Other sonicators can be used, but sonication conditions must be optimized empirically</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Humidified CO2 incubator</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biological safety cabinet with vacuum outlet</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide mapping of drug-dna interactions in cells with cosmic (crosslinking of small molecules to isolate chromatin)

Genomet er målet for noen av de mest effektive kjemoterapeutiske midler, men de fleste av disse stoffene mangler DNA-sekvens spesifisitet, noe som fører til dosebegrensende toksisitet, og mange uønskede bivirkninger. Målretting genomet med sekvensspesifikke små molekyler kan gjøre det mulig molekyler med økt terapeutisk indeks og færre off-target effekter. N -methylpyrrole / N metylimidazol polyamider er molekyler som kan rasjonelt utformet for å målrette spesifikke DNA-sekvenser med utsøkt presisjon. Og i motsetning til de fleste naturlige transkripsjonsfaktorer, kan polyamider binde til metylert og chromatinized DNA uten tap i affinitet. Sekvensen spesifisiteten av polyamider er blitt grundig undersøkt in vitro med beslektet område identifikasjon (CSI) og med tradisjonelle biokjemiske og biofysiske nærmer seg, men studiet av polyamid binding til genomiske mål i cellene fortsatt ukjent. Her kan vi rapportere en fremgangsmåte til tverrbinding av små molekyler isolate kromatin (COSMIC), som identifiserer polyamid bindingssteder over hele genomet. COSMIC er lik kromatin immunoutfelling (chip), men skiller seg i to viktige måter: (1) en photocrosslinker anvendes for å muliggjøre selektiv, midlertidig styrt innfanging av polyamid bindende hendelser, og (2) biotin affinitet håndtaket benyttes til å rense polyamid -DNA-konjugater i henhold til semi-denaturerende betingelser for å redusere DNA som er ikke-kovalent bundet. COSMIC er en generell strategi som kan brukes for å avsløre genombindingsbegivenheter av polyamider og andre genom-målretting kjemoterapeutiske midler.

Å ta hensyn til ikke-uniform genom fragmentering og andre variabler, bør den rensede DNA alltid være normalisert mot en referanse av Input DNA. Primere som er spesifikke for et locus av interesse kan benyttes. Det er også nyttig å analysere et locus hvor molekylet ikke forventes å binde, som en negativ kontroll. Vi ser en&gt; 100 ganger økning i polyamid belegg ved bestråling med 365-nm lys (figur 2). Anriket DNA kan også analyseres ved neste generasjons sekvenserin...

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin at JoVE.com

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Genome-wide Kartlegging av narkotika DNA Interactions i Cells med COSMIC (Fornetting av små molekyler å isolere Chromatin)

Identifisere de direkte målene for genom målretting molekyler er fortsatt en stor utfordring. For å forstå hvordan DNA-bindende molekyler engasjere genomet, har vi utviklet en metode som er avhengig av kryssbinding av små molekyler å isolere kromatin (COSMIC).

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

En In vivo Crosslinking Approach å isolere protein komplekser Fra Drosophila Embryo

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaksjon Screening av Protein-fragment Komplemente analyse (PCA) i levende celler

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

Isolering av Spesifikke Genomiske Regioner og Identifisering av Associated Molekyler av enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

DamID-seq: Genome-wide Kartlegging av Protein-DNA Interaksjoner med høy gjennomstrømning Sekvensering av adenin-metylert DNA-fragmenter

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Forsterkning, Neste generasjons sekvensering, og Genomisk DNA Kartlegging av Retrovirale Integrasjons nettsteder

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...