Name: genome-wide mapping of drug-dna interactions in cells with cosmic (crosslinking of small molecules to isolate chromatin)
Uploaded: 2016-01-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin at JoVE.com

We thank members of the Ansari lab and Prof. Parameswaran Ramanathan for helpful discussions. This work was supported by NIH grants CA133508 and HL099773, the H.&#8197;I. Romnes faculty fellowship, and the W.&#8197;M. Keck Medical Research Award to A.Z.A. G.S.E. was supported by a Peterson Fellowship from the Department of Biochemistry and Molecular Biosciences Training Grant NIH T32 GM07215. A.E. was supported by the Morgridge Graduate Fellowship and the Stem Cell and Regenerative Medicine Center Fellowship, and D.B. was supported by the NSEC grant from NSF.

1. Сшивание в живых клетках <ol><li> Начните с ~ 2.5x10 7 H1 клеток, или других культивируемых клеток. Примечание: Этот номер H1 клеток соответствует пяти 10-см чашки (приблизительно 40% слияния). </li><li> Рост клеток в средах E8 на чашках, покрытых на поверхности, поддерживающей плюрипотентных ...

One of the primary challenges with conventional ChIP is the identification of suitable antibodies. ChIP depends heavily upon the quality of the antibody, and most commercial antibodies are unacceptable for ChIP. In fact, the Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) consortium found only 20% of commercial antibodies to be suitable for ChIP assays.50 With COSMIC, antibodies are replaced by streptavidin. Because polyamides are functionalized with biotin, streptavidin is used in place of an antibody to capture polyam...

Информация, чтобы каждая ячейка в человеческом теле закодирована в ДНК. Избирательное использование этой информации определяет судьбу клетки. Транскрипционных факторов (ТФ) являются белки, которые связываются со специфическими последовательностями ДНК, чтобы выразить определенный набор генов в геноме, и неисправность ТФ связано с наступлением широкий спектр заболеваний, в том числе дефектов развития, рак и диабет . 1,2 Мы были заинтересованы в развитии молекулы, которые могут избирательно связываться с геном и модулируют генных регуляторных сетей. Полиамиды состоит из N -methylpyrrole и N метилимидазол рационально продуманная молекулы, которые могут ориентироваться ДНК с особенностей и сходства, что соперник природные факторы транскрипции. 3-6 Эти молекулы связываются со специфическими последовательностями в малой бороздке ДНК. 4,5,7 -11 Полиамиды были использованы для обоих подавить и активировать экспрессию специфического гены. 4,12-19 Они также имеют интересные противовирусные 20-24 и противораковые свойства 12,13,25-30. Один привлекательной особенностью полиамидов является их способность получить доступ к последовательности ДНК, которые метилированные 31,32 и обернутые вокруг белков гистонов 9,10,33. Для измерения комплексные специфичностью связывания молекул ДНК-связывающий нашей лаборатории создан способ родственные идентификатор сайта (CSI). 34-39 Прогнозируемое вхождение сайты связывания на основании в пробирке специфичности (genomescapes) могут быть отображены на геном, поскольку в пробирке связывания интенсивности прямо пропорционально констант ассоциации (К а). 34,35,37 Эти genomescapes обеспечить понимание размещение полиамида в геноме, но измерения полиамид связывания в живых клетках было проблемой. ДНК плотно упакованы в ядре, которые могли бы повлиять на доступность сайтов связывания. The Accessibility этих chromatinized последовательностей ДНК в полиамидов, остается загадкой. В последнее время многие методы исследования взаимодействия между малыми молекулами нуклеиновых кислот и возникли. 40-48 Химический захвата близость и массово-параллельной последовательности ДНК (чем-след) является одним из таких методов. Хим-след использует формальдегид для сшивания небольших молекул для геномной цели интереса и биотинилированного производного небольшой интерес молекулы захватить лиганд-мишень взаимодействия. 48,49 Формальдегид сшивания приводит к косвенным взаимодействий, которые могут производить ложных срабатываний. 50 Мы разработали новый метод сшивания малых молекул, чтобы изолировать хроматина (космические), 51 с photocrosslinker, чтобы устранить эти так называемые &quot;фантомные&quot; пики. 50 Для начала, мы разработали и синтезировали Трифункциональные производные полиамидов. Эти молекулы содержали ДНК-связывающий Polyamide, А photocrosslinker (псорален), и близость ручка (биотин, Рисунок 1). С трифункциональных полиамидов, мы можем ковалентно захватить взаимодействия полиамида-ДНК с 365 нм УФ-облучения, длины волны, чтобы не повредить ДНК или индуцировать не-Psoralen на основе сшивания. 51 Далее, мы фрагментировать геном и очистить захваченный ДНК под жесткими, полу -denaturing условия для уменьшения ДНК, которая является нековалентно связаны. Таким образом, мы считаем, КОСМИЧЕСКИЙ как метод, связанные с чем-SEQ, но с более прямой считывания ДНК ориентации. Важно отметить, что слабым (К 10 3 -10 4 М -1) близость псоралена для ДНК не обнаруживаемой воздействие полиамида специфичность. 51,52 обогащенного фрагменты ДНК могут быть проанализированы количественные полимеразной цепной реакции 51 (космические-КПЦР) или следующего поколения секвенирования (53 КОСМИЧЕСКИХ SEQ). Эти данные позволяют объективную, геном наведением дизайн лигандов, которые междудействовать с желаемой локусов генома и свести к минимуму мимо эффекты. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/53510/53510fig1.jpg"/> Рисунок 1. Биологически активные полиамиды и космической схеме. (A) Шпилька полиамиды 1 - 2 целевые последовательность ДНК 5&#39;-WACGTW-3 &quot;. Линейные полиамиды 3 - 4 мишени 5&#39;-AAGAAGAAG-3 &quot;. Кольца N-метилимидазола выделены жирным шрифтом для наглядности. Открытые и заполненные круги представляют N -methylpyrrole и N метилимидазол, соответственно. Площадь представляет 3-хлортиофена, и бриллианты представляют бета-аланин. Псораленом и биотин обозначаются Р и В, соответственно. (B), космической схеме. Клетки обрабатывали трифункциональных производных полиамидов. После сшивания 365 нм УФ-облучения, клетки лysed и геномная ДНК разрезается. Покрытых стрептавидином магнитные гранулы добавляют захватить аддукты полиамид-ДНК. ДНК высвобождается и может быть проанализирована с помощью количественной ПЦР (КПЦР) или следующего поколения секвенирования (NGS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53510/53510fig1highres.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="727">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td style="width:180px;">any source</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:75px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Benzamidine</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pepstatin</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Proteinase K</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Other sources can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">StemPro&#174; Accutase&#174; Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>We have tried other manufacturers of DNA columns with success.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TruSeq ChIP Sample Prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>IP-202-1012</td>
			<td>This Kit can be used to prepare COSMIC DNA for next-generation sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td>Used to coat plates in order to grow H1 ESCs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH paper</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">amber microcentrifuge tubes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">microcentrifuge tubes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pyrex filter</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td>Pyrex baking dishes are suitable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">qPCR master mix</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HCl (6 N)</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10-cm tissue culture dishes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Serological pipettes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pasteur pipettes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette tips</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">15-mL conical tubes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">centrifuge</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">microcentrifuge</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">nutator</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnetic separation rack</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UV source</td>
			<td>CalSun</td>
			<td>B001BH0A1A</td>
			<td>Other UV sources can be used, but crosslinking time must be optimized empirically</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Misonix Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>S4000 with 431C1 cup horn</td>
			<td>Other sonicators can be used, but sonication conditions must be optimized empirically</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Humidified CO2 incubator</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biological safety cabinet with vacuum outlet</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide mapping of drug-dna interactions in cells with cosmic (crosslinking of small molecules to isolate chromatin)

Геном мишенью некоторые из наиболее эффективных химиотерапевтических средств, но большинство из этих препаратов не имеют специфичность последовательности ДНК, что приводит к дозозависимой токсичности и многие неблагоприятные побочные эффекты. Ориентация геном с последовательностью конкретных малых молекул может позволить молекулы с повышенной терапевтическим индексом и меньшими мимо эффектов. N -methylpyrrole / N метилимидазол полиамиды являются молекулы, которые могут быть рационально, предназначенные для решения конкретных последовательностей ДНК с изысканной точностью. И в отличие от большинства природных факторов транскрипции, полиамиды могут связываться с метиловым и chromatinized ДНК без потери сродства. Последовательность Специфика полиамидов была тщательно изучена в пробирке с родственным идентификации сайта (CSI) и с традиционными биохимических и биофизических подходов, но изучение полиамида связывания с геномной целей в клетках остается неуловимым. Здесь мы приводим метод сшивания малых молекул Isolaте хроматина (космические), который идентифицирует полиамидные сайты связывания в геноме. Космический аналогична иммунопреципитации хроматина (чип), но отличается в двух важных способов: (1) photocrosslinker используется для того, чтобы избирательное, временно контролируемый захват полиамидных связывания событий и (2) биотин сродством ручка используется для очистки полиамид -DNA конъюгаты под полу-денатурирующих условиях, чтобы уменьшить ДНК, которая является нековалентно связаны. Космический является общей стратегией, которые могут быть использованы для выявления генома связывания события полиамидов и других биологических поражающих химиотерапевтических агентов.

Для учета неравномерного генома фрагментации и других переменных, очищенный ДНК всегда должны быть нормализованы против ведения ввода ДНК. Праймеров, специфичных к локусу интерес может быть использован. Это полезно также проанализировать локус, где молекула не ожидается, чтобы связа?...

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin at JoVE.com

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Генома Отображение лекарственно-ДНК взаимодействий в клетках с космическими (сшивание малых молекул изолировать хроматина)

Выявление прямых целей генома таргетирования молекул остается серьезной проблемой. Чтобы понять, как молекулы ДНК-связывающего заниматься геном, мы разработали метод, который опирается на сшивания малых молекул, чтобы изолировать хроматина (космические).

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

Генома Анализ аминоацилирования (зарядка) уровни тРНК Использование Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Генома анализа с использованием чип-изоформы Определить конкретные цели Гена

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

iCLIP - транскриптома всей карты белка-РНК взаимодействия с отдельными нуклеотидных Резолюцию

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Хроматина анализ взаимодействия с парными-End тегов секвенирования (Chia-ПЭТ) для карт хроматина Взаимодействие и понимание регуляции транскрипции

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

По всему геному Гена удаления в<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; По высокая пропускная способность ПЦР

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

В естественных условиях Сшивание подход к Изолировать белковых комплексов С Дрозофилы Эмбрионы

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Генома белок-белковых Взаимодействие Скрининг белком-фрагментом комплементации анализа (РСА) в живых клетках

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

Выделение конкретных областей генома и идентификации Associated молекул enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

DamID-след: Генома Отображение белок-ДНК взаимодействий с высокой пропускной секвенирования аденина-метилированных фрагментов ДНК

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Amplification, следующего поколения Секвенирование и геномную ДНК Mapping ретровирусных интеграции сайты

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...