Name: genome-wide mapping of drug-dna interactions in cells with cosmic (crosslinking of small molecules to isolate chromatin)
Uploaded: 2016-01-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin at JoVE.com

We thank members of the Ansari lab and Prof. Parameswaran Ramanathan for helpful discussions. This work was supported by NIH grants CA133508 and HL099773, the H.&#8197;I. Romnes faculty fellowship, and the W.&#8197;M. Keck Medical Research Award to A.Z.A. G.S.E. was supported by a Peterson Fellowship from the Department of Biochemistry and Molecular Biosciences Training Grant NIH T32 GM07215. A.E. was supported by the Morgridge Graduate Fellowship and the Stem Cell and Regenerative Medicine Center Fellowship, and D.B. was supported by the NSEC grant from NSF.

1. La reticulación en células vivas <ol><li> Comience con ~ 2.5x10 7 células H1, ​​u otras células cultivadas. NOTA: Este número de células H1 corresponde a cinco platos de 10 cm (aproximadamente 40% de confluencia). </li><li> Cultivar las células en medios E8 en placas revestidas en una superficie que soporta las células madre pluripotentes (ver Lista de Materiales), y se incuba a 37 ° C en ambiente humidificado del 5% de CO 2. Células Cosecha enzimáticamente (ver Lista de ...

One of the primary challenges with conventional ChIP is the identification of suitable antibodies. ChIP depends heavily upon the quality of the antibody, and most commercial antibodies are unacceptable for ChIP. In fact, the Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) consortium found only 20% of commercial antibodies to be suitable for ChIP assays.50 With COSMIC, antibodies are replaced by streptavidin. Because polyamides are functionalized with biotin, streptavidin is used in place of an antibody to capture polyam...

La información para hacer cada célula en el cuerpo humano está codificado en el ADN. El uso selectivo de la información que gobierna el destino de una célula. Los factores de transcripción (TFS) son proteínas que se unen a secuencias específicas de ADN para expresar un subconjunto particular de los genes en el genoma, y ​​el mal funcionamiento de TFS está vinculada a la aparición de una amplia gama de enfermedades, incluyendo defectos de desarrollo, el cáncer y la diabetes 1,2. Hemos estado interesados ​​en el desarrollo de moléculas que pueden unirse selectivamente al genoma y modular las redes de regulación de genes. Poliamidas compuestos de N -methylpyrrole y N metilimidazol son moléculas que pueden diana de ADN con especificidades y afinidades que los factores de transcripción naturales rivales. 3-6 Estas moléculas se unen a secuencias específicas en el surco menor del ADN racionalmente diseñados. 4,5,7 -11 Las poliamidas se han empleado tanto para reprimir y activar la expresión de g específicaenes. 4,12-19 También tienen interesantes antivirales 20-24 y anticancerígenas 12,13,25-30 propiedades. Una característica atractiva de poliamidas es su capacidad para acceder a secuencias de ADN que están metilados 31,32 y envuelven alrededor de las proteínas histonas 9,10,33. Para medir las especificidades de unión integrales de moléculas de unión al ADN, nuestro laboratorio creó el método de identificador de sitio de reconocimiento (CSI). 34-39 La aparición prevista de sitios de unión basado en in vitro especificidades (genomescapes) se puede visualizar en el genoma, ya que el in vitro intensidades de unión son directamente proporcionales a las constantes de asociación (K a). 34,35,37 Estos genomescapes proporcionan información sobre la ocupación de poliamida en todo el genoma, pero poliamida medir la unión en células vivas ha sido un reto. ADN está estrechamente empaquetado en el núcleo, que podría influir en la accesibilidad de los sitios de unión. La Accesibilidad de estas secuencias de ADN cromatinizados a poliamidas sigue siendo un misterio. Recientemente, muchos métodos para estudiar las interacciones entre pequeñas moléculas y ácidos nucleicos han surgido. 40-48 La captura por afinidad química y la secuenciación del ADN masivamente paralelo (chem-ss) es una de estas técnicas. Chem-ss utiliza formaldehído para reticular moléculas pequeñas a una diana genómica de interés y un derivado biotinilado de una pequeña molécula de interés para capturar la interacción ligando-diana. 48,49 Reticulación formaldehído conduce a interacciones indirectas que pueden producir falsos positivos. 50 Hemos desarrollado un nuevo método, la reticulación de moléculas pequeñas para aislar la cromatina (cósmica), 51 con un fotoentrecruzador para eliminar estos llamados picos &quot;fantasma&quot;. 50 Para empezar, hemos diseñado y sintetizado derivados trifuncionales de poliamidas. Estas moléculas contienen una pol unión al ADNyamide, un fotoentrecruzador (psoraleno), y un asa de afinidad (biotina, Figura 1). Con poliamidas trifuncionales, podemos capturar covalentemente interacciones de ADN de poliamida con irradiación UV 365 nm, una longitud de onda que no daña el ADN o inducir no psoraleno-basado de reticulación. 51 A continuación, fragmentar el genoma y purificar el ADN capturado bajo estrictas, semi condiciones -denaturing para disminuir ADN que es no covalentemente. Por lo tanto, visión cósmica como un método relacionado con chem-SEQ, pero con una lectura más directa de ADN de direccionamiento. Es importante destacar que los débiles (K a 10 3 -10 4 M -1) afinidad de psoraleno para el ADN no detectable de poliamida de impacto especificidad. 51,52 Los fragmentos de ADN enriquecidos pueden ser analizados por cualquiera de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa 51 (COSMIC-qPCR) o mediante la secuenciación de próxima generación 53 (COSMIC-ss). Estos datos permiten un diseño imparcial genoma guiada de ligandos que entreactuar con sus loci genómica deseada y minimizar los efectos fuera de objetivo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53510/53510fig1.jpg"/> Figura 1. poliamidas bioactivos y esquema cósmico. (A) poliamidas horquilla 1-2 diana la secuencia de ADN 5&#39;-WACGTW-3 &#39;. Poliamidas lineales 3 - 4 diana 5&#39;-AAGAAGAAG-3 &#39;. Anillos de N-metilimidazol están en negrita para mayor claridad. Los círculos vacíos y llenos representan N -methylpyrrole y N metilimidazol, respectivamente. Plaza representa 3-clorotiofeno y diamantes representan β-alanina. Psoralen y la biotina se denotan por P y B, respectivamente. (B) esquema cósmico. Las células se tratan con derivados trifuncionales de poliamidas. Después de la reticulación con 365 nm de la irradiación UV, las células son lse corta ADN genómico y ysed. Se añaden perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina para capturar aductos de ADN-poliamida. El ADN se libera y puede ser analizado mediante PCR cuantitativa (qPCR) o mediante la secuenciación de próxima generación (NGS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53510/53510fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="727">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td style="width:180px;">any source</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:75px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Benzamidine</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pepstatin</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Proteinase K</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Other sources can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">StemPro&#174; Accutase&#174; Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>We have tried other manufacturers of DNA columns with success.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TruSeq ChIP Sample Prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>IP-202-1012</td>
			<td>This Kit can be used to prepare COSMIC DNA for next-generation sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td>Used to coat plates in order to grow H1 ESCs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH paper</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">amber microcentrifuge tubes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">microcentrifuge tubes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pyrex filter</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td>Pyrex baking dishes are suitable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">qPCR master mix</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HCl (6 N)</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10-cm tissue culture dishes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Serological pipettes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pasteur pipettes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette tips</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">15-mL conical tubes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">centrifuge</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">microcentrifuge</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">nutator</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnetic separation rack</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UV source</td>
			<td>CalSun</td>
			<td>B001BH0A1A</td>
			<td>Other UV sources can be used, but crosslinking time must be optimized empirically</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Misonix Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>S4000 with 431C1 cup horn</td>
			<td>Other sonicators can be used, but sonication conditions must be optimized empirically</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Humidified CO2 incubator</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biological safety cabinet with vacuum outlet</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide mapping of drug-dna interactions in cells with cosmic (crosslinking of small molecules to isolate chromatin)

El genoma es el objetivo de algunos de los agentes quimioterapéuticos más eficaces, pero la mayoría de estos fármacos carecen de especificidad de secuencia de ADN, que conduce a la toxicidad limitante de la dosis y muchos efectos secundarios adversos. Targeting el genoma con pequeñas moléculas específicas de secuencia puede permitir moléculas con el aumento del índice terapéutico y menos efectos fuera de objetivo. -methylpyrrole N / N poliamidas metilimidazol son moléculas que pueden ser racionalmente diseñados para dirigir las secuencias de ADN específicas con exquisita precisión. Y a diferencia de la mayoría de los factores de transcripción naturales, poliamidas pueden unirse al ADN metilado y cromatinizados sin una pérdida en la afinidad. La especificidad de secuencia de poliamidas ha sido ampliamente estudiado in vitro con la identificación del emplazamiento cognado (CSI) y con los enfoques bioquímicos y biofísicos tradicionales, pero el estudio de poliamida unión a dianas genómicas en las células sigue siendo difícil de alcanzar. Aquí mostramos un método, la reticulación de moléculas pequeñas a Isolate cromatina (cósmica), que identifica los sitios de unión de poliamida en todo el genoma. Cósmico es similar a inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), pero difiere en dos aspectos importantes: (1) un fotoentrecruzador se emplea para permitir la captura selectiva, controlada temporalmente de eventos de unión de poliamida, y (2) el asa de afinidad biotina se utiliza para purificar poliamida conjugados -ADN en condiciones semi-desnaturalizante para disminuir ADN que es no covalentemente. Cósmico es una estrategia general que puede ser utilizado para revelar los eventos de unión en todo el genoma de poliamidas y otros agentes quimioterapéuticos del genoma de metas.

Para tener en cuenta la fragmentación del genoma no uniforme y otras variables, el ADN purificado siempre debe ser normalizado contra una referencia de ADN de entrada. Los cebadores específicos de un locus de interés pueden ser utilizados. Es útil también para analizar un locus donde no se espera que la molécula para unirse, como un control negativo. Vemos un incremento&gt; 100 veces en la ocupación de poliamida tras la irradiación con luz de 365 nm (Figura 2). Enriq...

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Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Mapeo de todo el genoma de la droga-ADN interacciones en células con COSMIC (reticulación de pequeñas moléculas para aislar la cromatina)

La identificación de los blancos directos de moléculas del genoma de metas sigue siendo un reto importante. Para entender cómo las moléculas de unión al ADN involucran el genoma, hemos desarrollado un método que se basa en la reticulación de moléculas pequeñas para aislar la cromatina (cósmica).

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

Todo el genoma análisis de Aminoacilación (de carga) Niveles de tRNA utilizando microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Investigación

Biología

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Análisis de todo el genoma con chip para identificar objetivos específicos para cada isoforma Gene

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

iClip - transcriptoma en todo el mapeo de la proteína-ARN interacciones con la Resolución de nucleótidos individuales

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

La cromatina Análisis de Interacción con la etiqueta de secuenciación pareadas final (Chia-PET) para el mapeo de la cromatina y la comprensión de las interacciones Reglamento Transcripción

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

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Genoma escala supresiones de genes en<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Por PCR de alto rendimiento

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

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Un In vivo Enfoque de reticulación para aislar Complejos de Proteína Desde Drosophila Los embriones

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

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Genoma toda la Proteína-proteína interacción Screening por Complementación de ensayo de proteínas-fragmento (PCA) en las células vivas

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

El aislamiento de regiones genómicas específicas e identificación de moléculas asociadas por enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

-DamID siguientes: Genoma de toda la cartografía de la proteína-ADN Interacciones de alto rendimiento de secuenciación de fragmentos de ADN adenina-metilado

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Amplificación, secuenciación de próxima generación, y Genómica Mapeo de ADN retrovirales sitios de integración

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...