Name: genome-wide mapping of drug-dna interactions in cells with cosmic (crosslinking of small molecules to isolate chromatin)
Uploaded: 2016-01-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin at JoVE.com

We thank members of the Ansari lab and Prof. Parameswaran Ramanathan for helpful discussions. This work was supported by NIH grants CA133508 and HL099773, the H.&#8197;I. Romnes faculty fellowship, and the W.&#8197;M. Keck Medical Research Award to A.Z.A. G.S.E. was supported by a Peterson Fellowship from the Department of Biochemistry and Molecular Biosciences Training Grant NIH T32 GM07215. A.E. was supported by the Morgridge Graduate Fellowship and the Stem Cell and Regenerative Medicine Center Fellowship, and D.B. was supported by the NSEC grant from NSF.

1. Tvärbindning i levande celler <ol><li> Börja med ~ 2,5x10 7 H1-celler, eller andra odlade celler. OBS: Denna antal H1 celler motsvarar fem 10-cm rätter (ca 40% konfluens). </li><li> Odla celler i E8 media på skålar belagda på en yta som stöder pluripotenta stamceller (se Material List), och inkubera dem vid 37 ° C i fuktad atmosfär av 5% CO2. Harvest celler enzymatiskt (se Materials List). Obs: Låt inte H1 celler att överstiga 90% konfluens; konfluens inducerar spontan differ...

One of the primary challenges with conventional ChIP is the identification of suitable antibodies. ChIP depends heavily upon the quality of the antibody, and most commercial antibodies are unacceptable for ChIP. In fact, the Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) consortium found only 20% of commercial antibodies to be suitable for ChIP assays.50 With COSMIC, antibodies are replaced by streptavidin. Because polyamides are functionalized with biotin, streptavidin is used in place of an antibody to capture polyam...

Den information för att göra varje cell i människokroppen är kodad i DNA. Den selektiv användning av denna information styr ödet för en cell. Transkriptionsfaktorer (TFS) är proteiner som binder till specifika DNA-sekvenser för att uttrycka en speciell undergrupp av generna i genomet, och fel på TF: er är kopplad till uppkomsten av ett brett spektrum av sjukdomar, inklusive utvecklingsdefekter, cancer och diabetes . 1,2 Vi har varit intresserade av att utveckla molekyler som selektivt kan binda till arvsmassan och modulerar genreglerande nätverk. Polyamider som består av N -methylpyrrole och N -metylimidazol är rationellt utformade molekyler som kan rikta DNA med särdrag och tillhörighet som rivaliserande naturliga transkriptionsfaktorer. 3-6 Dessa molekyler binder till specifika sekvenser i mindre spår av DNA. 4,5,7 -11 Polyamider har använts för att både undertrycka och aktivera uttrycket av specifika genes. 4,12-19 De har också intressanta antivirala 20-24 och cancer 12,13,25-30 egenskaper. En attraktiv egenskap av polyamider är deras förmåga att få tillgång till DNA-sekvenser som är metylerade 31,32 och lindade runt histonproteiner 9,10,33. För att mäta de omfattande bindningsspecificiteter av DNA-bindande molekyler, skapade vårt labb det besläktade platsen identifieringsmetod (CSI). 34-39 Den förutspådda förekomsten av bindningsställen baserat på in vitro-specifika förhållanden (genomescapes) kan visas på genomet, eftersom in vitro bindningsnivåer är direkt proportionell mot associationskonstanter (K a). 34,35,37 Dessa genomescapes ge insikt i polyamid beläggning över genomet, men mätning av polyamid bindande i levande celler har varit en utmaning. DNA är tätt förpackad i kärnan, som skulle kunna påverka tillgängligheten till bindningsställen. The accessibility av dessa chromatinized DNA-sekvenser till polyamider förblir ett mysterium. Nyligen många metoder studera interaktioner mellan små molekyler och nukleinsyror har uppstått. 40-48 Den kemiska affinitetsinfångning och massivt parallella DNA-sekvensering (kem-punkter) är en sådan teknik. Chem-seq använder formaldehyd för att tvärbinda små molekyler till en genomisk mål av intresse och ett biotinylerat derivat av en liten molekyl av intresse för att fånga ligand-mål-interaktion. 48,49 Formaldehyd tvärbindning leder till indirekt interaktion som kan producera falska positiva. 50 Vi har utvecklat en ny metod, tvärbindningen av små molekyler för att isolera kromatin (COSMIC), 51 med en fototvärbindare att eliminera dessa så kallade &quot;fantom&quot; toppar. 50 Till att börja, Vi designade och syntetiserade trifunktionella derivat av polyamider. Dessa molekyler innehöll en DNA-bindande polyamide, en fototvärbindare (psoralen), och en affinitetshandtag (biotin, figur 1). Med trifunktionella polyamider, kan vi kovalent fånga polyamid-DNA-interaktioner med 365 nm UV-bestrålning, en våglängd som inte skadar DNA eller förorsaka icke psoralen-baserade tvärbindning. 51 Nästa, vi fragmentera genomet och rena den infångade DNA under stringenta, semi -denaturing betingelser för att minska DNA som är icke-kovalent bunden. Därför ser vi COSMIC som en metod i samband med kemiska-punkter, men med en mer direkt avläsning av DNA inriktning. Viktigt är att svaga (K 10 3 -10 4 M -1) affinitet psoralen för DNA inte påvisbart påverkan polyamid specificitet. 51,52 De anrikade DNA-fragment kan analyseras antingen genom kvantitativ polymerase chain reaction 51 (COSMIC-qPCR) eller genom nästa generations sekvensering 53 (COSMIC-punkter). Dessa uppgifter möjliggöra en opartisk, genom styrd utformning av ligander som interhandla med deras önskade genomiska loci och minimera off-target effekter. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/53510/53510fig1.jpg"/> Figur 1. Bioaktiva polyamider och kosmisk ordning. (A) hårnål polyamider 1-2 målgrupp DNA-sekvensen 5&#39;-WACGTW-3 &#39;. Linjära polyamider 3-4 målgrupp 5&#39;-AAGAAGAAG-3 &#39;. Ringar av N-metylimidazol är i fetstil för tydlighets skull. Öppna och fyllda cirklar representerar N -methylpyrrole och N metylimidazol, respektive. Square representerar 3-klortiofen och diamanter representerar β-alanin. Psoralen och biotin betecknas med P och B, respektive. (B) KOSMISK system. Celler behandlas med trifunktionella derivat av polyamider. Efter tvärbindning med 365 nm UV-bestrålning, celler är lysed och genomisk DNA klippt. Streptavidinbelagda magnetiska pärlor tillsätts för att fånga polyamid-DNA-addukter. DNA frigörs och kan analyseras med kvantitativ PCR (qPCR) eller genom nästa generations sekvensering (NGS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53510/53510fig1highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="727">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td style="width:180px;">any source</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:75px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Benzamidine</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pepstatin</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Proteinase K</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Other sources can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">StemPro&#174; Accutase&#174; Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>We have tried other manufacturers of DNA columns with success.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TruSeq ChIP Sample Prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>IP-202-1012</td>
			<td>This Kit can be used to prepare COSMIC DNA for next-generation sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td>Used to coat plates in order to grow H1 ESCs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH paper</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">amber microcentrifuge tubes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">microcentrifuge tubes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pyrex filter</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td>Pyrex baking dishes are suitable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">qPCR master mix</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HCl (6 N)</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10-cm tissue culture dishes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Serological pipettes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pasteur pipettes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette tips</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">15-mL conical tubes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">centrifuge</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">microcentrifuge</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">nutator</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnetic separation rack</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UV source</td>
			<td>CalSun</td>
			<td>B001BH0A1A</td>
			<td>Other UV sources can be used, but crosslinking time must be optimized empirically</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Misonix Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>S4000 with 431C1 cup horn</td>
			<td>Other sonicators can be used, but sonication conditions must be optimized empirically</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Humidified CO2 incubator</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biological safety cabinet with vacuum outlet</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide mapping of drug-dna interactions in cells with cosmic (crosslinking of small molecules to isolate chromatin)

Genomet är målet för några av de mest effektiva kemoterapeutika, men de flesta av dessa läkemedel saknar DNA-sekvens specificitet, vilket leder till dosbegränsande toxicitet och många negativa biverkningar. Targeting genomet med sekvensspecifika små molekyler kan möjliggöra molekyler med ökad terapeutisk index och färre ej åsyftade effekter. N -methylpyrrole / N -metylimidazol polyamider är molekyler som kan rationellt utformade att inrikta sig på specifika DNA-sekvenser med utsökt precision. Och till skillnad från de flesta naturliga transkriptionsfaktorer, kan polyamider binda till metylerat och chromatinized DNA utan förlust i affinitet. Den sekvensspecificitet av polyamider har studerats in vitro med besläktat platsbeskrivning (CSI) och med traditionella biokemiska och biofysiska metoder, men studiet av polyamid-bindning till genomiska mål i celler fortfarande instabil. Här rapporterar vi ett förfarande, att tvärbindningen av små molekyler isolate kromatin (COSMIC), identifierar att polyamid bindningsställen över hela genomet. COSMIC liknar kromatin immunoprecipitation (chip), men skiljer sig i två viktiga sätt: (1) en fototvärbindare utnyttjas för att möjliggöra selektiv, tidsmässigt kontrollerade infångning av polyamid bindningshändelser, och (2) biotin affinitetshandtag används för att rena polyamid -DNA konjugat enligt semi-denaturerande betingelser för att minska DNA som är icke-kovalent bunden. COSMIC är en allmän strategi som kan användas för att avslöja de genomvida bindningshändelser av polyamider och andra genom-targeting kemoterapeutiska medel.

För att beakta olikformig genomet fragmentering och andra variabler, bör den renade DNA alltid normaliserades mot en referens av Ingångs-DNA. Primrar som är specifika för ett lokus av intresse kan användas. Det är användbart att också analysera en lokus där molekylen inte förväntas binda, som en negativ kontroll. Vi ser en&gt; 100-faldig ökning av polyamid beläggning vid bestrålning med 365 nm ljus (Figur 2). Anrikat DNA kan också analyseras genom nästa gene...

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin at JoVE.com

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Genomvid Kartläggning av narkotika DNA interaktioner i celler med COSMIC (Tvärbindning av små molekyler att isolera Chromatin)

Identifiera de direkta målen för genom-målsökande molekyler är fortfarande en stor utmaning. För att förstå hur DNA-bindande molekyler engagera genomet har vi utvecklat en metod som bygger på tvärbindning av små molekyler för att isolera kromatin (COSMIC).

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

Genomvid Analys av Aminoacylation (laddning) Nivåerna av tRNA Använda Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Genomvid Analys med hjälp av chip för att identifiera isoform-specifik gen mål

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

iCLIP - transkriptom hela Kartläggning av protein-RNA interaktioner med individuella Nukleotid Upplösning

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Kromatin Interaktion Analys med parade-End Tag sekvensering (CHIA-PET) för kartläggning kromatin Interaktioner och förstå transkriptionsreglering

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletioner i<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Av High Throughput PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Ett In vivo Tvärbindning metod att isolera proteinkomplex från Drosophila Embryon

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Genomvid Protein-proteininteraktion Screening av Protein-fragment kompletteringsanalys (PCA) i levande celler

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

Isolering av specifika genomregioner och Identifiering av associerade molekyler av enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

DamID-punkter: Genomvid Kartläggning av protein-DNA interaktioner från hög genomströmning sekvensering av Adenine-metylerade DNA-fragment

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Förstärkning, Nästa generations sekvensering, och Genomic DNA Kartläggning av retroviral integration webbplatser

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...