Name: genome-wide mapping of drug-dna interactions in cells with cosmic (crosslinking of small molecules to isolate chromatin)
Uploaded: 2016-01-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin at JoVE.com

We thank members of the Ansari lab and Prof. Parameswaran Ramanathan for helpful discussions. This work was supported by NIH grants CA133508 and HL099773, the H.&#8197;I. Romnes faculty fellowship, and the W.&#8197;M. Keck Medical Research Award to A.Z.A. G.S.E. was supported by a Peterson Fellowship from the Department of Biochemistry and Molecular Biosciences Training Grant NIH T32 GM07215. A.E. was supported by the Morgridge Graduate Fellowship and the Stem Cell and Regenerative Medicine Center Fellowship, and D.B. was supported by the NSEC grant from NSF.

Canlı hücreler 1. Çapraz bağlanma, <ol><li> ~ 2.5x10 7 H1 hücreleri veya diğer kültür hücreleri ile başlayın. Not: H1 Bu hücre sayısı beş ila 10 cm&#39;lik kaplar (yaklaşık% 40 konflüans) karşılık gelir. </li><li> Pluripotent kök hücrelerin destekleyen bir yüzey üzerinde kaplı kaplar üzerinde E8 ortam hücreleri büyümek (Malzeme listesi bakınız) ve 5% CO2 nemlendirilmiş bir atmosferde 37 ° C&#39;de inkübe. Hasat hücreleri enzimatik (Malzeme Listesi&#39;ne...

One of the primary challenges with conventional ChIP is the identification of suitable antibodies. ChIP depends heavily upon the quality of the antibody, and most commercial antibodies are unacceptable for ChIP. In fact, the Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) consortium found only 20% of commercial antibodies to be suitable for ChIP assays.50 With COSMIC, antibodies are replaced by streptavidin. Because polyamides are functionalized with biotin, streptavidin is used in place of an antibody to capture polyam...

Bilgi, insan vücudunda her hücre DNA&#39;sında kodlanmış yapmak. Bu bilginin seçici olarak kullanımı, bir hücrenin kaderi yönetir. Transkripsiyon faktörleri (TF) genomunda genlerin özel bir alt ifade özel DNA dizilerine bağlanan proteinler, ve TFS arıza gelişimsel bozukluklar, kanser, ve diyabet gibi hastalıkların geniş bir dizinin başlangıcından bağlantılıdır . 1,2 Biz seçici genom bağlanan ve gen düzenleyici ağlar modüle moleküller geliştirmek isteyen olmuştur. Poliamidler N-metilpirol oluşan ve N, rakip doğal transkripsiyon faktörleri. 3-6 Bu moleküller DNA minör oyuk içinde oluşan özel dizilerine bağlanan özgüllükleri ve afiniteleri olan hedef DNA molekülleri olabilir metilimidazol rasyonel tasarlanmıştır. 4,5,7 -11 Polyamidler hem bastırmak için kullanılan ve spesifik g ifadesini aktive edilmişenes. 4,12-19 Ayrıca ilginç 20-24 anti-viral ve anti-kanser 12,13,25-30 özelliklere sahiptir. Poliamidlerin bir çekici özelliği 31,32 metillenmiş ve histon proteinleri 9,10,33 sarılı DNA dizilerini ulaşmak için yetenekleridir. DNA bağlama moleküllerinin kapsamlı bir birleşme spesifisitelerine ölçmek için, laboratuar, 34-39, in vitro özgüllükleri (genomescapes) dayalı bağlanma yerlerinin tahmini oluşum genomu üzerinde görüntülenebilir. Kognat Alanı tanımlayıcısı (CSI) yöntemini yarattığı için in vitro bağlanma şiddetleri dernek sabitleri ile doğru orantılıdır (K a). 34,35,37 Bu genomescapes genom boyunca poliamid doluluk içgörü sağlar, ancak canlı hücrelerde bağlanmasını ölçme poliamid bir meydan okuma olmuştur. DNA, sıkı bir şekilde bağlanma sitelerinin erişilebilirliğini etkileyebilir çekirdek içinde paketlenir. Birpoliamidlere bu chromatinized DNA dizilerinin ccessibility bir gizem kalıyor. Son zamanlarda, birçok yöntem ortaya çıkmıştır küçük moleküller ve nükleik asitler arasındaki etkileşimleri incelemek için. 40-48 kimyasal afinite yakalama ve kitlesel paralel DNA dizileme (kimya-seq) böyle bir tekniktir. Chem seq ligand-hedef etkileşimi yakalamak için ilgi konusu bir genomik hedef ve ilgi konusu bir küçük molekülün, bir biyotinile türevine küçük moleküller çapraz bağlanması için formaldehit kullanır. 48,49 Formaldehit çapraz bağlama hata üretebilirken dolaylı etkileşimleri yol açar. 50 Yeni bir yöntem, küçük moleküllerin çapraz bağlama olarak adlandırılan bu &quot;hayalet&quot; tepe ortadan kaldırmak için bir foto çapraz bağlayıcının ile kromatin (KOZMIK), 51 izole etmek için. 50 başlamak için geliştirilen biz tasarladık ve poliamitlerin üç işlevli türevleri sentezlendi. Bu moleküller, bir DNA-bağlama pol ihtivayamide bir Foto çapraz bağlayıcı (psoralen) ve bir afinite kolu (biotin, Şekil 1). Üç işlevli poliamidler ile, kovalent. 365 nm UV ışıması, DNA hasarı ya da olmayan psoralen-esaslı çapraz bağlanmasını yol açan bir dalga boyuna sahip poliamid-DNA etkileşimlerini yakalayabilir 51 Sonra, katı, yarı altında çekilen DNA genom fragman ve saflaştırmak -denaturing koşulları kovalent olmayan bir şekilde bağlı olan DNA azaltmak için kullanılır. Böylece, kimya-SEQ ilişkin bir yöntem olarak KOZMIK görebilir, ancak DNA &#39;nın daha doğrudan bir okuma ile hedeflenmesi. Önemli bir şekilde, zayıf (K 10 3 -10 4 M-1) DNA için psoralen afinitesi yapar saptanabilir etki poliamid spesifikliği. 51,52 zenginleştirilmiş DNA fragmanları kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu ya da 51 ile analiz edilebilir (kozmik qPCR) ya da yeni nesil dizileme 53 (COSMIC-seq) tarafından. Bu veriler ligandların tarafsız bir genom güdümlü tasarım etkinleştirmek arasıOnların arzu genomik loci ile hareket ve hedef dışı etkilerini en aza indirmek. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53510/53510fig1.jpg"/> Şekil 1. Biyoaktif poliamidler ve KOZMİK düzeni. (A) Firkete poliamitler 1-2 hedef DNA sekansı 5&#39;-WACGTW-3 &#39;. Lineer poliamidler 3-4 hedef 5&#39;-AAGAAGAAG-3 &#39;. N-metilimidazol Rings netlik için kalın edilmektedir. Açık ve dolu daireler sırasıyla N-metilpirol ve N-metilimidazol temsil etmektedir. Kare 3-klorotiofen temsil eder ve elmas β-alanin temsil etmektedir. Psoralen biotin, sırasıyla, P ve B ile temsil edilir. (B) KOZMİK düzeni. Hücreler Poliamidlerin üç işlevli türevleri ile muamele edilmektedir. 365 nm UV ışınlama ile çapraz sonra, hücreler l vardırysed ve genomik DNA &#39;kırılır. Streptavidin-kaplı manyetik boncuklar, poliamid-DNA adüktleri yakalamak için ilave edilir. DNA serbest bırakılır ve kantitatif PCR (qPCR) veya yeni nesil dizileme (NGS) tarafından analiz edilebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53510/53510fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="727">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td style="width:180px;">any source</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:75px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Benzamidine</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pepstatin</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Proteinase K</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Other sources can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">StemPro&#174; Accutase&#174; Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>We have tried other manufacturers of DNA columns with success.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TruSeq ChIP Sample Prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>IP-202-1012</td>
			<td>This Kit can be used to prepare COSMIC DNA for next-generation sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td>Used to coat plates in order to grow H1 ESCs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH paper</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">amber microcentrifuge tubes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">microcentrifuge tubes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pyrex filter</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td>Pyrex baking dishes are suitable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">qPCR master mix</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HCl (6 N)</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10-cm tissue culture dishes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Serological pipettes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pasteur pipettes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette tips</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">15-mL conical tubes</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">centrifuge</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">microcentrifuge</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">nutator</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnetic separation rack</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UV source</td>
			<td>CalSun</td>
			<td>B001BH0A1A</td>
			<td>Other UV sources can be used, but crosslinking time must be optimized empirically</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Misonix Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>S4000 with 431C1 cup horn</td>
			<td>Other sonicators can be used, but sonication conditions must be optimized empirically</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Humidified CO2 incubator</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biological safety cabinet with vacuum outlet</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide mapping of drug-dna interactions in cells with cosmic (crosslinking of small molecules to isolate chromatin)

Genom en etkili kemoterapötik bazı hedef, ancak bu ilaçların en doz sınırlayıcı toksisite ve çok sayıda olumsuz yan etkilere neden DNA sekansı özgüllük yoksundur. Diziye özgü küçük moleküller ile genom hedefleme artan terapötik indeksi ve daha az hedef dışı etkileri olan molekülleri sağlayabilir. N-metilpirol / N-metilimidazol poliamidler rasyonel mükemmel hassasiyetle spesifik DNA dizileri hedeflemek için tasarlanmış olabilir moleküllerdir. Ve en doğal transkripsiyon faktörleri farklı olarak, polyamidler afinite kaybı olmaksızın metil ve chromatinized DNA&#39;ya bağlanabilir. Poliamidlerin dizisi özgüllüğü yoğun aynı kökenli yerinin tanımlanması (CSI) ile in vitro olarak, geleneksel biyokimyasal ve biyofiziksel yaklaşımlarla ele alınmıştır, ancak hücrelerin genomik hedeflere bağlanabilen poliamidin çalışması zor olmaya devam etmektedir. Bir yöntemi rapor Burada, küçük moleküllerin çapraz bağlama için isolate kromatin (KOZMIK), genom çapında polyamid bağlanma yeri tanımlar. KOZMIK kromatin immunoprecipitation (chip) benzer olmakla birlikte, iki önemli noktada ayrılır: olarak bir foto çapraz seçici zamansal kontrollü polyamid bağlanma olgularının yakalama ve (2) biotin afinite kolu poliamid saflaştırmak için kullanılır sağlamak için kullanılır (1) Yarı denatüre edici koşullar altında a-DNA konjügatları kovalent olmayan bir şekilde bağlı olan DNA azaltmak için kullanılır. KOZMIK poliamitler ve diğer genom hedefleme kemoterapötik ajanların genom bağlayıcı olayları ortaya çıkarmak için kullanılan bir genel bir stratejidir.

Düzgün olmayan genom parçalanma ve diğer değişkenler hesaba katılması için, saflaştırılmış DNA daima Girdi DNA referans karşı normalize edilmelidir. Ilgi odağı özgü primerler kullanılabilir. Aynı zamanda, negatif bir kontrol olarak, bir molekül bağlamak beklenmemektedir bir bölgeyi analiz etmek için yararlıdır. Bu 365 nm ışık (Şekil 2) ile radyasyona tabi tutulduktan sonra poliamid doluluk bir&gt; 100-misli bir artış görülür. Zenginleşti...

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin at JoVE.com

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

COSMIC ile Hücrelerde İlaç-DNA Etkileşimlerinin genom Haritalama (Küçük moleküllerinin çapraz bağlanmasını Kromatin yalıtmak için)

Genom hedefleme moleküllerinin doğrudan hedefleri belirlenmesi önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. DNA bağlama molekülleri genomu meşgul anlamak için, kromatin izole etmek için küçük moleküllerin çapraz bağlama dayanan bir yöntem (COSMIC) geliştirdi.

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

Mikroarray&#39;ler kullanarak tRNA Aminoacylation (Şarj) Seviyeler genom Analizi

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Izoform özel Gen Hedefler Belirlemek için ChIP kullanarak genom analizi

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

iCLIP - Bireysel Nükleotid Çözünürlük protein-RNA Etkileşimleri Transcriptome geniş Haritalama

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Kromatin Etkileşimler haritalama ve Transkripsiyon Yönetmelik anlamak için paired-end Tag Dizileme (Chia-PET) ile Kromatin Etkileşim Analizi

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genom çapında Gen Delesyonlar içinde<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Yüksek Verimli PCR ile

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Bir In vivo</emŞu Protein Kompleksler yalıtmak için> Çapraz yaklaşım Drosophila Embriyolar

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Yaşayan Hücrelerde Protein-fragmanı tamamlama Assay (PCA) ile genom Protein-protein etkileşimi Eleme

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

Belirli Genomik Bölgeler ve enChIP tarafından İlişkili Moleküllerin Tanımlanması İzolasyonu

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

DamID seq: Adenin-metillenmiş DNA Fragments Yüksek Verimli Dizileme tarafından Protein-DNA Etkileşimleri genom Haritalama

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviral Entegrasyon Siteleri Amplifikasyon, Yeni Nesil Sıralama ve Genomik DNA Haritalama

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...