Name: a strategy to validate the role of callose-mediated plasmodesmal gating in the tropic response
Uploaded: 2016-04-17T14:00:00
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Cette recherche a été soutenue par la National Research Foundation de Corée (NRF-2015R1A2A1A10053576), et par une subvention du Programme Next-Generation BioGreen 21 (SSAC, accorder PJ01137901), Administration du développement rural, République de Corée. RK, WS, ABB et DK ont été pris en charge par Brain Korea 21 programme Plus (BK21 +).

1. Dépistage des Mutants avec réponses phototropiques et gravitropique Altered <ol><li> Préparer 1x Murashige et Skoog (MS) Medium, pH 5,7, avec 0,8% Agar Un jour avant l&#39;expérience. <ol><li> Ajouter 800 ml d&#39;eau distillée deux fois à un 2 L fiole conique et remuer avec un barreau magnétique. </li><li> Ajouter 4,4 g de MS sel dans la fiole conique. </li><li> Ajouter 0,5 g de 2- (N-morpholino) l&#39;acide éthanesulfonique (MES) et remuer jusqu&#39;à ce que tous les sels sont complètement dissous. </li...

<ol>
	<li>Went, F. W., Thimann, K. V., Bard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytohormones.">Phytohormones.</a> Experimental biology monographs. , 204 (1937).</li><li>Bennett, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+AUX1+gene:+a+permease-like+regulator+of+root+gravitropism.">Arabidopsis AUX1 gene: a permease-like regulator of root gravitropism.</a> Science. 273 (5277), 948-950 (1996).</li><li>Christensen, S. K., Dagenais, N., Chory, J., Weigel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+auxin+response+by+the+protein+kinase+PINOID.">Regulation of auxin response by the protein kinase PINOID.</a> Cell. 100 (4), 469-478 (2000).</li><li>Jurgens, G., Geldner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+high+road+and+the+low+road:+trafficking+choices+in+plants.">The high road and the low road: trafficking choices in plants.</a> Cell. 130 (6), 977-979 (2007).</li><li>Michniewicz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+regulation+of+PIN+phosphorylation+by+PP2A+and+PINOID+directs+auxin+flux.">Antagonistic regulation of PIN phosphorylation by PP2A and PINOID directs auxin flux.</a> Cell. 130 (6), 1044-1056 (2007).</li><li>Noh, B., Bandyopadhyay, A., Peer, W. A., Spalding, E. P., Murphy, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+gravi-+and+phototropism+in+plant+mdr+mutants+mislocalizing+the+auxin+efflux+protein+PIN1.">Enhanced gravi- and phototropism in plant mdr mutants mislocalizing the auxin efflux protein PIN1.</a> Nature. 423 (6943), 999-1002 (2003).</li><li>Weijers, D., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snap+Shot:+auxin+signaling+and+transport.">Snap Shot: auxin signaling and transport.</a> Cell. 136 (6), 1172-1172 (2009).</li><li>Wisniewska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+PIN+localization+directs+auxin+flow+in+plants.">Polar PIN localization directs auxin flow in plants.</a> Science. 312 (5775), 883 (2006).</li><li>Murphy, A. S., Hoogner, K. R., Peer, W. A., Taiz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+purification,+and+molecular+cloning+of+N-1-naphthylphthalmic+acid-binding+plasma+membrane-associated+aminopeptidases+from+Arabidopsis.">Identification, purification, and molecular cloning of N-1-naphthylphthalmic acid-binding plasma membrane-associated aminopeptidases from Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 128 (3), 935-950 (2002).</li><li>Kleine-Vehn, J., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+targeting+and+endocytic+recycling+in+auxin-dependent+plant+development.">Polar targeting and endocytic recycling in auxin-dependent plant development.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 24, 447-473 (2008).</li><li>Yang, Y., Hammes, U. Z., Taylor, C. G., Schachtman, D. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+gravitropism+is+regulated+by+a+transient+lateral+auxin+gradient+controlled+by+a+tipping+point+mechanism.">Root gravitropism is regulated by a transient lateral auxin gradient controlled by a tipping point mechanism.</a> Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 109 (12), 4668-4673 (2012).</li><li>Vanneste, S., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxin:+a+trigger+for+change+in+plant+development.">Auxin: a trigger for change in plant development.</a> Cell. 136 (6), 1005-1016 (2009).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxin-callose-mediated+plasmodesmal+gating+is+essential+for+tropic+auxin+gradient+formation+and+signaling.">Auxin-callose-mediated plasmodesmal gating is essential for tropic auxin gradient formation and signaling.</a> Dev. Cell. 28 (2), 132-146 (2014).</li><li>Kumar, R., Kumar, D., Hyun, T. K., Kim, J. 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Dans ce manuscrit, une stratégie pour l&#39;écran mutant / over-expression lignes qui sont défectueux dans les réponses phototrophes et gravitropique en raison de callose modifié PD et, par conséquent, PD SEL est décrite en détail. synthèse de callose PD et à la dégradation est principalement accomplie par synthases callose et β-1,3-glucanases, mais la régulation de ces enzymes est contrôlée par de nombreux facteurs en amont. Pour rechercher ces facteurs en amont ou les candidats qui sont directement impl...

Les plantes, comme les organismes vivants sessiles, ont développé un réseau très sophistiqué de la signalisation de cellule à cellule pour traiter divers stimuli environnementaux. Réponses tropique sont l&#39;un des phénomènes par lequel les plantes répondent à des stimuli environnementaux. Les plantes montrent deux principales réponses trophiques, phototropisme et gravitropisme. plantes photosynthétiques courbent vers la source lumineuse par phototropisme pour récolter un maximum d&#39;énergie. De même, gravitropisme rend les plantes à croître vers le centre de gravité. Le mécanisme fondamental qui conduit à ces réponses tropique implique asymétrique formation de gradient de la phytohormone auxine 1. L&#39;acte de formation de gradient de auxine locale est bien caractérisée; les gènes qui sont impliqués dans ce mécanisme constituent un plan d&#39;action de l&#39; hormone de 2-8. La position spécifique des transporteurs d&#39;efflux auxine, tels que PIN FORMÉ (PIN) et les glycoprotéines P, exécute le mouvement de l&#39; auxine à partir du cytoplasme de la paroi cellulaire des cellules donneuses 9,10. Far ailleurs, par la H + / AAI activité symport active des transporteurs d&#39;afflux auxine, tels que les protéines de la famille LAX AUX1 /, l&#39; auxine est finalement délivré aux cellules réceptrices adjacentes 2,11,12. Ce mouvement directionnel d&#39;auxine est connu comme transport de l&#39;auxine polaire (PAT). PAT conduit à une distribution de l&#39; auxine différentielle à divers stades de développement et en réponse à différents stimuli environnementaux 13,14. En outre, la perturbation de la localisation ou l&#39;expression de l&#39;un de ces transporteurs d&#39;efflux ou afflux auxine conduit à une altération sévère PAT, ce qui entraîne une perturbation du gradient de l&#39;auxine, ce qui conduit à des défauts de développement. Récemment, Han et al. a rapporté que la réglementation plasmodesmal est également nécessaire de maintenir le gradient de auxine 15. À ce jour, plus de 30 protéines plasmodesmal ont été identifiés 16. Parmi ces protéines, AtGSL8 a été rapporté comme une enzyme clé pour la synthèse de callose à plasmodesmes (PD) et joue donc un rôle essentiel dans maintaining la limite PD d&#39;exclusion de taille (SEL). AtGSL8 expression réprimée a donné lieu à un motif de gradient de auxine déformé conduisant à aucune réponse à tropisme contrairement aux plants de type sauvage 15. Dans ce manuscrit, les méthodes d&#39;explorer de nouveaux gènes candidats qui sont impliqués dans la régulation de PD sont fournis. AtGSL8 a été utilisé comme protéine modèle pour tester ces méthodes, il est une enzyme clé qui contribue à la biosynthèse PD callose. En raison de la plantule létalité gsl8 de mutants knock-out 17, la dexaméthasone (Dex) les lignes ont été utilisées inductible par ARNi selon un rapport publié antérieurement 15. La stratégie fournie ici peut être adapté pour cribler des gènes qui sont impliqués dans la réponse hypocotyle tropic commandé par PD SEL.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="890">
	<tbody>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:223px;">HPTS (8-Hydroxypyrene -1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt)</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:175px;">H1529-1G</td>
			<td style="width:335px;">Fluorescent dye as symplasmic tracer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">LE Agarose</td>
			<td style="width:157px;">Dongin-Genomic</td>
			<td style="width:175px;">GEL001-500G</td>
			<td style="width:335px;">Used for HPTS agarose block</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Microwave oven</td>
			<td style="width:157px;">LG-Goldstar</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:335px;">Machine for boiling agarose gel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">100 mL glass conical flask</td>
			<td style="width:157px;">Dong Kwang</td>
			<td style="width:175px;">A0205</td>
			<td style="width:335px;">Used to boil HPTS agarose gel</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:223px;">Petri Dish (35x10 mm)</td>
			<td style="width:157px;">SPL life sciences</td>
			<td style="width:175px;">SPL10035</td>
			<td style="width:335px;">Used to make HPTS agarose blocks and wash plant samples&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="79">
			<td height="79" style="height:79px;width:223px;">Microscope cover slides and glass slides (24 x 50 mm)</td>
			<td style="width:157px;">Marienfeld Laboratory Glassware</td>
			<td style="width:175px;">101222</td>
			<td style="width:335px;">Used for HPTS agarose blocks and microscopic sample preparation</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:223px;">MS medium plates 125 x 125 x 20 mm</td>
			<td style="width:157px;">SPL life sciences</td>
			<td style="width:175px;">SPL11125</td>
			<td style="width:335px;">Plates to make MS agar medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Scissors</td>
			<td style="width:157px;">Germany Stainless</td>
			<td style="width:175px;">HSB 942-11</td>
			<td style="width:335px;">Used to excise hook region of plant samples</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:223px;">Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture</td>
			<td style="width:157px;">Duchefa</td>
			<td style="width:175px;">P10453.01</td>
			<td style="width:335px;">MS medium including vitamins.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) monohydrate</td>
			<td style="width:157px;">Bioshop</td>
			<td style="width:175px;">3G30212</td>
			<td style="width:335px;">To make MS media.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Plant agar</td>
			<td style="width:157px;">Duchefa</td>
			<td style="width:175px;">P1001.1000</td>
			<td style="width:335px;">To solidify MS media.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Autoclave</td>
			<td style="width:157px;">ALP</td>
			<td style="width:175px;">CL-40L</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:223px;">Shaker</td>
			<td style="width:157px;">Wise Mix</td>
			<td style="width:175px;">SHO-1D</td>
			<td style="width:335px;">To wash off the aniline blue staining buffer and HPTS dye in a placid way.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">1 ml Blue tips</td>
			<td style="width:157px;">Sorenson</td>
			<td style="width:175px;">10040</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">1 ml pipette</td>
			<td style="width:157px;">BioPette</td>
			<td style="width:175px;">L-1101-2</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Surgical tape</td>
			<td style="width:157px;">MIcropore</td>
			<td style="width:175px;">1530-0</td>
			<td style="width:335px;">To seal the MS plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Aniline blue (Methyl blue)</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:175px;">M5528-25G</td>
			<td style="width:335px;">Used to prepare aniline blue staining buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glycine</td>
			<td style="width:157px;">Bioshop</td>
			<td style="width:175px;">GLN001</td>
			<td style="width:335px;">Used to prepare aniline blue staining buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">DDG</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:175px;">D8375-1G</td>
			<td style="width:335px;">Used for the inhibition of callose synthases.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:223px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:157px;">Olympus</td>
			<td style="width:175px;">FV1000MPE SIM</td>
			<td style="width:335px;">To check aniline blue staining and HPTS dye loading result.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Stirrer&#160;</td>
			<td style="width:157px;">I lab&#160;</td>
			<td style="width:175px;">K400</td>
			<td style="width:335px;">To mix media solution.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Aluminium foil</td>
			<td style="width:157px;">SW cooking foil</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:335px;">To wrap plates in a dark condition.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Sodium hypochlorite</td>
			<td style="width:157px;">Samjin Industry</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:335px;">To surface-sterilized seeds</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a strategy to validate the role of callose-mediated plasmodesmal gating in the tropic response

L&#39;auxine hormone végétale joue un rôle important dans de nombreux processus de croissance et de développement, y compris les réponses tropique à la lumière et la gravité. La mise en place d&#39;un gradient d&#39;auxine est un événement clé menant à phototropisme et gravitropisme. Auparavant, polaire transport de l&#39;auxine (PAT) a été montré pour établir un gradient de auxine dans différents domaines cellulaires des plantes. Cependant, Han et al. , A récemment démontré que , pour la bonne formation du gradient de l&#39; auxine, la connectivité plasmodesmal symplasmique callose à médiation entre les cellules adjacentes est également un facteur critique. Dans ce manuscrit, la stratégie visant à élucider le rôle des gènes particuliers, qui peuvent affecter phototropisme et gravitropisme en modifiant la connectivité symplasmique grâce à la modulation de la synthèse callose plasmodesmal, est discuté. La première étape consiste à filtrer les réponses tropique aberrantes de 3 jours-vieux plants étiolés de mutants ou surexpression lignes d&#39;un gène ainsi que le type sauvage. Cet examen préliminairepeut conduire à l&#39;identification d&#39;une série de gènes fonctionnant en PAT ou contrôlant la connectivité symplasmique. La deuxième sélection comprend le tri des candidats qui montrent les réponses tropique modifiées en affectant la connectivité symplasmique. Pour remédier à de tels candidats, le mouvement d&#39;un traceur symplasmique et le dépôt de callose plasmodesmal ont été examinés. Cette stratégie serait utile d&#39;explorer de nouveaux gènes candidats qui peuvent réguler la connectivité symplasmique directement ou indirectement au cours des réponses tropique et d&#39;autres processus de développement.

Dans la configuration actuelle, la dexaméthasone (dex) inductible par lignes ARNi de AtGSL8 [ci - après dsGSL8 (+ dex / -Dex)] ont été utilisés, comme les mutants d&#39;insertion ADN-T gsl8 homozygotes sont des plantules létale 18. Trois jours-vieux plants étiolés de dsGSL8 et plants de type sauvage avec dex ± ont été exposés à des stimuli phototrophes et gravitropique. Nous avons constaté que dsGSL8 (+ dex) plantules ...

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A Strategy to Validate the Role of Callose-mediated Plasmodesmal Gating in the Tropic Response

Cet article décrit les méthodes de criblage des gènes contrôlant la perméabilité plasmodesmal et gradient donc auxine pendant la réponse tropique. Cela inclut la mesure du degré de réponse à tropisme hypocotyle d&#39;Arabidopsis thaliana et de vérifier la perméabilité plasmodesmal par l&#39; acide 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonique (HPTS) le chargement et l&#39; évaluation du niveau finalement callose.

Une stratégie pour valider le rôle des Callose médiée Plasmodesmal Gating dans la réponse Tropic

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