Name: a strategy to validate the role of callose-mediated plasmodesmal gating in the tropic response
Uploaded: 2016-04-17T14:00:00
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Diese Arbeit wurde von der National Research Foundation of Korea (NRF-2015R1A2A1A10053576) und durch einen Zuschuss aus dem Next-Generation BioGreen 21 Programm unterstützt wurde (SSAC, gewähren PJ01137901), ländliche Entwicklung Verwaltung, der Republik Korea. RK, WS, ABB und DK wurden von Brain Korea 21-Plus-Programm (BK21 +) unterstützt.

1. Screening von Mutanten mit Altered Phototrope und Gravitrope Antworten <ol><li> Bereiten Sie 1x Murashige und Skoog (MS) Medium, pH 5,7, mit 0,8% Agar einen Tag vor dem Experiment. <ol><li> In 800 ml doppelt destilliertem Wasser in einen 2 l-Erlenmeyerkolben und rühren mit einem Magnetstab. </li><li> In 4,4 g MS Salz in den Erlenmeyerkolben. </li><li> Mit 0,5 g 2- (N-Morpholino) ethansulfonsäure (MES) und rühren, bis alle Salze vollständig gelöst sind. </li><li> Der pH-Wert des Mediums auf 5,7 mit 1 M KOH. </l...

<ol>
	<li>Went, F. W., Thimann, K. V., Bard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytohormones.">Phytohormones.</a> Experimental biology monographs. , 204 (1937).</li><li>Bennett, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+AUX1+gene:+a+permease-like+regulator+of+root+gravitropism.">Arabidopsis AUX1 gene: a permease-like regulator of root gravitropism.</a> Science. 273 (5277), 948-950 (1996).</li><li>Christensen, S. K., Dagenais, N., Chory, J., Weigel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+auxin+response+by+the+protein+kinase+PINOID.">Regulation of auxin response by the protein kinase PINOID.</a> Cell. 100 (4), 469-478 (2000).</li><li>Jurgens, G., Geldner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+high+road+and+the+low+road:+trafficking+choices+in+plants.">The high road and the low road: trafficking choices in plants.</a> Cell. 130 (6), 977-979 (2007).</li><li>Michniewicz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+regulation+of+PIN+phosphorylation+by+PP2A+and+PINOID+directs+auxin+flux.">Antagonistic regulation of PIN phosphorylation by PP2A and PINOID directs auxin flux.</a> Cell. 130 (6), 1044-1056 (2007).</li><li>Noh, B., Bandyopadhyay, A., Peer, W. A., Spalding, E. P., Murphy, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+gravi-+and+phototropism+in+plant+mdr+mutants+mislocalizing+the+auxin+efflux+protein+PIN1.">Enhanced gravi- and phototropism in plant mdr mutants mislocalizing the auxin efflux protein PIN1.</a> Nature. 423 (6943), 999-1002 (2003).</li><li>Weijers, D., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snap+Shot:+auxin+signaling+and+transport.">Snap Shot: auxin signaling and transport.</a> Cell. 136 (6), 1172-1172 (2009).</li><li>Wisniewska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+PIN+localization+directs+auxin+flow+in+plants.">Polar PIN localization directs auxin flow in plants.</a> Science. 312 (5775), 883 (2006).</li><li>Murphy, A. S., Hoogner, K. R., Peer, W. A., Taiz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+purification,+and+molecular+cloning+of+N-1-naphthylphthalmic+acid-binding+plasma+membrane-associated+aminopeptidases+from+Arabidopsis.">Identification, purification, and molecular cloning of N-1-naphthylphthalmic acid-binding plasma membrane-associated aminopeptidases from Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 128 (3), 935-950 (2002).</li><li>Kleine-Vehn, J., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+targeting+and+endocytic+recycling+in+auxin-dependent+plant+development.">Polar targeting and endocytic recycling in auxin-dependent plant development.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 24, 447-473 (2008).</li><li>Yang, Y., Hammes, U. Z., Taylor, C. G., Schachtman, D. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+gravitropism+is+regulated+by+a+transient+lateral+auxin+gradient+controlled+by+a+tipping+point+mechanism.">Root gravitropism is regulated by a transient lateral auxin gradient controlled by a tipping point mechanism.</a> Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 109 (12), 4668-4673 (2012).</li><li>Vanneste, S., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxin:+a+trigger+for+change+in+plant+development.">Auxin: a trigger for change in plant development.</a> Cell. 136 (6), 1005-1016 (2009).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxin-callose-mediated+plasmodesmal+gating+is+essential+for+tropic+auxin+gradient+formation+and+signaling.">Auxin-callose-mediated plasmodesmal gating is essential for tropic auxin gradient formation and signaling.</a> Dev. Cell. 28 (2), 132-146 (2014).</li><li>Kumar, R., Kumar, D., Hyun, T. K., Kim, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Players+at+plasmodesmal+nano-channels.">Players at plasmodesmal nano-channels.</a> J. Plant Biol. 58, 75-86 (2015).</li><li>Chen, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+callose+synthase+gene+GSL8+is+required+for+cytokinesis+and+cell+patterning.">The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning.</a> Plant Physiol. 150, 105-113 (2009).</li></ol>

In diesem Manuskript, zu screenen, eine Strategie Mutante / Überexpression Linien, die aufgrund veränderter PD phototropes und gravitropen Antworten defekt sind Kallose- und somit PD SEL im Detail beschrieben wird. PD Callose Synthese und Abbau wird hauptsächlich durch Callose Synthasen und β-1,3-Glucanasen erreicht, aber Regulation dieser Enzyme wird von vielen Faktoren stromaufwärts gesteuert. Um solche vorgelagerten Faktoren oder Kandidaten zu suchen, die bei Parkinson-Verordnung unmittelbar beteiligt sind, habe...

Pflanzen, wie sessile Lebewesen haben ein hochentwickeltes Netz von Zell-zu-Zell-Signal entwickelt, um verschiedene Umweltstimuli ansprechen. Tropic Reaktionen sind eines der Phänomene, bei dem Pflanzen auf Umweltreize reagieren. Pflanzen zeigen zwei Haupt tropischen Antworten, Phototropismus und Gravitropismus. Photosynthetic Pflanzen biegen in Richtung der Lichtquelle durch Phototropismus maximale Energie zu ernten. In ähnlicher Weise macht Gravitropismus die Pflanzen in Richtung des Schwerpunkts zu wachsen. Der grundlegende Mechanismus für solche tropischen Reaktionen führen beinhaltet asymmetrische Gradienten Bildung der Phytohormone Auxin 1. Der Akt des lokalen Auxin Gradienten Bildung ist gut charakterisiert; die Gene , die an diesem Mechanismus beteiligt sind , bieten einen Fahrplan für die Hormonwirkung 2-8. Die spezifische Position der Auxin Efflux Träger, wie PIN-FORMED (PIN) und P-Glykoproteine, führt die Bewegung von Auxin aus dem Cytoplasma in den Zellwand von Donorzellen 9,10. Furthermore, durch die aktive H + / IAA Symport Aktivität von Auxin Einstrom Träger wie AUX1 / LAX Familienproteine, Auxin wird schließlich zu den benachbarten Empfängerzellen 2,11,12 geliefert. Diese gerichtete Bewegung von Auxin als polare Auxin-Transport (PAT) bekannt. PAT führt zu einer differentiellen Auxin Verteilung während der verschiedenen Entwicklungsstadien und als Reaktion auf unterschiedliche Umweltreize 13,14. Darüber hinaus führt die Unterbrechung der Lokalisierung oder Expression von beliebigen dieser Auxin Einströmen oder Ausströmen Träger schwerer Veränderung in PAT, die eine Unterbrechung des Auxin-Gradienten bewirkt, zu Entwicklungsstörungen führen. Vor kurzem Han et al. berichtet , dass plasmodesmal Regelung auch notwendig ist , 15 die Auxin - Gradienten zu halten. Bis heute, mehr als 30 plasmodesmal Proteine ​​wurden 16 identifiziert. Unter diesen Proteinen als ein Schlüsselenzym für die Synthese bei Callose plasmodesmata (PD), und somit spielt eine wichtige Rolle in maint berichtet AtGSL8 wurdeaining die PD Größe Ausschlussgrenze (SEL). Unterdrückte AtGSL8 Expression führte zu einer verzerrten Muster Auxin Gradienten zu keinem tropischen Reaktion im Gegensatz zu Wildtyp - Sämlinge 15 führt. In diesem Manuskript, zu Methoden, um neue Kandidaten-Gene erforschen, die bei Parkinson-Regulation beteiligt sind, zur Verfügung gestellt. AtGSL8 wurde als Modell-Protein verwendet, um diese Methoden zu testen, da es ein Schlüsselenzym trägt Callose Biosynthese PD. Aufgrund der Sämlings-Letalität gsl8 17 Mutanten knock-out, Dexamethason (Dex) -induzierbaren RNAi - Linien wurden in Übereinstimmung mit einem zuvor veröffentlichten Bericht 15 verwendet. Die Strategie hier kann vorgesehen sein, angepasst Gene zu suchen, die in Hypokotyls Tropic Antwort von PD SEL gesteuert beteiligt sind.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="890">
	<tbody>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:223px;">HPTS (8-Hydroxypyrene -1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt)</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:175px;">H1529-1G</td>
			<td style="width:335px;">Fluorescent dye as symplasmic tracer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">LE Agarose</td>
			<td style="width:157px;">Dongin-Genomic</td>
			<td style="width:175px;">GEL001-500G</td>
			<td style="width:335px;">Used for HPTS agarose block</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Microwave oven</td>
			<td style="width:157px;">LG-Goldstar</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:335px;">Machine for boiling agarose gel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">100 mL glass conical flask</td>
			<td style="width:157px;">Dong Kwang</td>
			<td style="width:175px;">A0205</td>
			<td style="width:335px;">Used to boil HPTS agarose gel</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:223px;">Petri Dish (35x10 mm)</td>
			<td style="width:157px;">SPL life sciences</td>
			<td style="width:175px;">SPL10035</td>
			<td style="width:335px;">Used to make HPTS agarose blocks and wash plant samples&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="79">
			<td height="79" style="height:79px;width:223px;">Microscope cover slides and glass slides (24 x 50 mm)</td>
			<td style="width:157px;">Marienfeld Laboratory Glassware</td>
			<td style="width:175px;">101222</td>
			<td style="width:335px;">Used for HPTS agarose blocks and microscopic sample preparation</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:223px;">MS medium plates 125 x 125 x 20 mm</td>
			<td style="width:157px;">SPL life sciences</td>
			<td style="width:175px;">SPL11125</td>
			<td style="width:335px;">Plates to make MS agar medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Scissors</td>
			<td style="width:157px;">Germany Stainless</td>
			<td style="width:175px;">HSB 942-11</td>
			<td style="width:335px;">Used to excise hook region of plant samples</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:223px;">Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture</td>
			<td style="width:157px;">Duchefa</td>
			<td style="width:175px;">P10453.01</td>
			<td style="width:335px;">MS medium including vitamins.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) monohydrate</td>
			<td style="width:157px;">Bioshop</td>
			<td style="width:175px;">3G30212</td>
			<td style="width:335px;">To make MS media.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Plant agar</td>
			<td style="width:157px;">Duchefa</td>
			<td style="width:175px;">P1001.1000</td>
			<td style="width:335px;">To solidify MS media.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Autoclave</td>
			<td style="width:157px;">ALP</td>
			<td style="width:175px;">CL-40L</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:223px;">Shaker</td>
			<td style="width:157px;">Wise Mix</td>
			<td style="width:175px;">SHO-1D</td>
			<td style="width:335px;">To wash off the aniline blue staining buffer and HPTS dye in a placid way.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">1 ml Blue tips</td>
			<td style="width:157px;">Sorenson</td>
			<td style="width:175px;">10040</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">1 ml pipette</td>
			<td style="width:157px;">BioPette</td>
			<td style="width:175px;">L-1101-2</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Surgical tape</td>
			<td style="width:157px;">MIcropore</td>
			<td style="width:175px;">1530-0</td>
			<td style="width:335px;">To seal the MS plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Aniline blue (Methyl blue)</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:175px;">M5528-25G</td>
			<td style="width:335px;">Used to prepare aniline blue staining buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glycine</td>
			<td style="width:157px;">Bioshop</td>
			<td style="width:175px;">GLN001</td>
			<td style="width:335px;">Used to prepare aniline blue staining buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">DDG</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:175px;">D8375-1G</td>
			<td style="width:335px;">Used for the inhibition of callose synthases.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:223px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:157px;">Olympus</td>
			<td style="width:175px;">FV1000MPE SIM</td>
			<td style="width:335px;">To check aniline blue staining and HPTS dye loading result.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Stirrer&#160;</td>
			<td style="width:157px;">I lab&#160;</td>
			<td style="width:175px;">K400</td>
			<td style="width:335px;">To mix media solution.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Aluminium foil</td>
			<td style="width:157px;">SW cooking foil</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:335px;">To wrap plates in a dark condition.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Sodium hypochlorite</td>
			<td style="width:157px;">Samjin Industry</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:335px;">To surface-sterilized seeds</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a strategy to validate the role of callose-mediated plasmodesmal gating in the tropic response

Das Pflanzenhormon Auxin spielt eine wichtige Rolle in vielen Wachstums- und Entwicklungsprozessen, einschließlich tropische Reaktionen auf Licht und Schwerkraft. Die Einrichtung eines Auxin Gradient ist ein Schlüsselereignis zu phototropism und Gravitropismus führt. Zuvor wurde polare Auxin-Transport (PAT) gezeigt ein Auxin Gradienten in verschiedenen zellulären Domänen von Pflanzen zu schaffen. Allerdings Han et al. Haben kürzlich gezeigt , dass für eine ordnungsgemäße Auxin Gradienten Bildung, plasmodesmal Kallose-vermittelte symplasmic Konnektivität zwischen den benachbarten Zellen ist auch ein kritischer Faktor. In diesem Manuskript, auf die Strategie, die Rolle bestimmter Gene aufzuklären, die phototropism und Gravitropismus durch Veränderung der symplasmic Konnektivität durch Modulation plasmodesmal Kallose- Synthese beeinflussen können, wird diskutiert. Der erste Schritt ist zusammen mit dem Wildtyp abweichenden tropischen Antworten von 3 Tage alten etiolated Sämlinge von Mutanten oder Überexpression Linien eines Gens zu screenen. Diese vorläufige Screeningkann dazu führen, symplasmic Verbindung zur Identifizierung einer Reihe von Genen in PAT funktionieren oder zu steuern. Das zweite Screening beinhaltet die Sortierung von Kandidaten, die durch Beeinflussung symplasmic Konnektivität veränderten tropischen Antworten zeigen. Um solche Kandidaten, die Bewegung eines symplasmic Tracer und die Ablagerung von plasmodesmal Callose adressieren wurden untersucht. Diese Strategie wäre nützlich, neue Kandidaten-Gene zu untersuchen, die symplasmic Konnektivität direkt oder indirekt bei Tropic Reaktionen und andere Entwicklungsprozesse regulieren kann.

In der aktuellen Setup, Dexamethason (DEX) -induzierbaren RNAi Linien AtGSL8 [im Folgenden dsGSL8 (+ dex / -dex)] verwendet wurden, als homozygote gsl8 T-DNA Insertionsmutanten letalen 18 Sämling. Drei Tage alten etiolated Sämlinge von dsGSL8 und Wildtyp - Sämlinge mit ± dex wurden phototropes und gravitropen Reizen ausgesetzt. Wir fanden , dass dsGSL8 (+ dex) Sämlinge 15 in phototropism und Gravitropismus defekt war...

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A Strategy to Validate the Role of Callose-mediated Plasmodesmal Gating in the Tropic Response

Dieser Artikel beschreibt die Methoden für die Gene Screening plasmodesmal Permeabilität und damit Auxin Gradienten während tropischen Reaktion zu steuern. Dies beinhaltet die Messung des Grades der Tropic Reaktion in Hypokotyl von Arabidopsis thaliana und plasmodesmal Permeabilität von 8-Hydroxypyren-1,3,6-trisulfonsäure (HPTS) Laden und schließlich Kallose- Ebene Beurteilung zu überprüfen.

Eine Strategie zur Validierung der Rolle der Kallose-vermittelten Plasmodesmal Gating im Tropic Antwort

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