Name: the use of flow cytometry to assess the state of chromatin in t cells
Uploaded: 2015-12-17T14:00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells at JoVE.com

Dette projekt blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (5 P20 RR016461 og 8 P20 GM103499), National Science Foundation (EPS-0.903.795). Yderligere støtte fra Furman Universitets forskning og faglig udvikling og Furman Advantage prisuddelinger.

Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr i National Institutes of Health. Dyret Protokollen blev godkendt af Furman University Institutional Animal Care og brug Udvalg (Permit nummer: A3242-01). Alle materialer og udstyr, der anvendes i denne protokol, kan findes i tabellen af ​​materialer og udstyr, mens anvendte buffere kan findes i tabellen af ​​buffere og løsninger. 1. Single Cell Suspension af lymfocytter fra Mouse Milte <ol><li> Sacrifice mus via CO 2 kvælning. Bekræft eutanasi ved cervikal dislokation. Bemærk: Brug milt fra to 6-8 uger gamle isogen mus (f.eks C57B / 6) af samme køn. Typisk er to milte behandles. </li><li> Spray dyrene voldsomt med 70% ethanolopløsning og orient, således at hovedet er mod venstre. </li><li> Ved hjælp af pincet, løfte huden på dyret opad og væk fra tHan organ. Med en saks, klippe en lille hak gennem huden i nærheden af ​​maven af ​​dyret. Brug af fingrene, træk hver side af indskæringen for at blotlægge peritoneum fra halsen til begyndelsen af ​​bagbenene. Milten skal være synlig direkte under bughinden. </li><li> Ved hjælp af pincet, løfte peritoneum og lave et lille snit for at blotlægge milten. Fjern milten med pincet og bruge en saks til at drille væk enhver fedt og bindevæv. </li><li> Placer milten i en 50 ml konisk rør indeholdende 10 ml PBS suppleret med 2% kalvefosterserum (i det følgende benævnt PBS + 2%). Hold røret på is indtil klar til at begynde den enkelt celle suspension. Bemærk: Typisk opsving er mellem 60-90 millioner celler pr milt og typisk er der behov for 2 millioner celler pr prøve. Udfør alle de følgende trin i en vævskultur hætte. </li><li> Dekanteres miltene i en steril 100 mm vævskulturskål. </li><li> Opnå to frostede objektglas og hold than glider således at de to ru overflader matteret vende indad mod hinanden. Fugt dias i PBS + 2% opløsning hældt i petriskålen. </li><li> Hold milten mellem frosted overflader af objektglas, med kanterne stadig neddykkede, og male milten forsigtigt ved at bevæge slæderne frem og tilbage mod hinanden (figur 1A). Cellerne vil falde ned i petriskålen. Fortsæt med slibning, indtil alle celler er blevet frigivet, og resterne af milten forekommer hvide (figur 1B). </li><li> Udarbejde cellesuspensionen i en pipette og filtreres langsomt gennem en 70 um filter over i en ny steril 50 ml konisk rør. Bemærk, at små stykker af rød pulp vil være til stede på filteret (figur 2A). <ol><li> Hvis filteret stiger op, forsigtigt løfte det en smule op for at tillade fluid at dræne igennem og placere filteret tilbage i 50 ml konisk rør og fortsætte, at gentage denne proces som nødvendigt. Hvis forarbejdning mere end 5 spleENS, kan det være nødvendigt at opdele i to portioner og bruge et nyt filter for hver. </li></ol></li><li> Ved hjælp af prop del af en 3 ml sprøjte forsigtigt trykke på den røde papirmasse, som indeholder de resterende celler gennem sien (figur 2B). Sørg for at trykke både filteret bund og sider for at sikre, at alle røde papirmasse er passeret gennem filteret (Figur 2C). </li><li> Tilsæt 10 mlof PBS + 2% til vævskulturskål og bruge denne til at vaske dias, sprøjte prop, og parabol til at inddrive eventuelle resterende celler. Videregive dette gennem samme 70 um cellefilter ind i 50 ml konisk rør. Gentag dette trin efter behov. </li><li> Centrifugeres den filtrerede cellesuspension ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. </li><li> Forsigtigt dekanteres og kassér supernatanten, passe på ikke at forstyrre bundfaldet. En spormængde af PBS + 2% vil blive efterladt i røret. Cap røret og bladre pelleten indtil pellet resuspenderes fuldstændigt. </li><li> Lyserer røde blodlegemer ved adding 2 ml ACK Lysis Buffer (0,15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH til 7,2, opbevares ved 4 ° C) pr milten til konisk rør og rotere og vend røret for at sikre, at alle celler komme i kontakt med ACK buffer. Vend forsigtigt røret i 1 min ved stuetemperatur. </li><li> Bringe volumenet af cellesuspensionen til 50 ml ved tilsætning af PBS + 2% røret for at neutralisere ACK buffer. Vend røret 10 gange og centrifugeres i 5 minutter ved 300 xg ved 4 ° C. Efter centrifugering er færdig, skal være hvid pellet (figur 3). </li><li> Forsigtigt dekanteres og kassér supernatanten, passe på ikke at forstyrre bundfaldet. Efterlad et spor mængde PBS + 2% i røret, cap røret, og svirp pillen at opblande det. </li><li> Der tilsættes 10 ml af T-celle medier [10% FBS, 10 mM HEPES (pH 7,0), 2 mM GlutaMAX, 1 mM natriumpyruvat, 1x ikke-essentielle aminosyrer, 1x penicillin / streptomycin og 50 mM β-mercaptoethanol], og yderligere resuspender pellet ved forsigtigtpipettere op og ned. Derefter filtreres suspensionen gennem en ny 70 um filter over i en ny 50 ml konisk rør. </li><li> Brug en anden 5-10 ml af T-celle medier at skylle det oprindelige rør og passerer denne gennem 70 um filter i rør indeholdende resten af ​​de filtrerede celler. Hvis forarbejdning mere end to milt, kan mængden af ​​T-celle-medier øges for at maksimere inddrivelsen. </li><li> Hold celler på is indtil klar til at blive plettet. Cellerne skal tælles og levedygtighed adgang. <ol><li> At tælle celler, kombinere 3 ml celler med 24 ml PBS + 2% og 3 ml 0,4% trypanblåt. Load 10 ml af denne i hvert kammer i en forbedret Neubauer hæmocytometer. Levedygtighed som bedømt ved trypanblåt-udelukkelse, er typisk mellem 85-95%. </li></ol></li></ol> 2. Levedygtighed og Surface Farvning <ol><li> Pellet celler ved centrifugering i 10 minutter ved 300 xg ved 4 ° C. Resuspender celler i T-celle-medium til en koncentration på 1 x 10 7 celler / ml. TransfER 2 millioner celler (100 ml) i en brønd i en U-bundede 96-brønds vævskulturplade. </li><li> Centrifugeres 96-brønds plade i 10 minutter ved 300 xg ved 4 ° C. </li><li> Fjern supernatanten fra hver brønd ved at bladre væske i brønden pladen i vasken (cellepelleten forbliver i brønden) og duppe pladen på et rent papirhåndklæde. Vask cellerne ved resuspendering dem i 200 pi PBS efterfulgt af centrifugering ved 300 xg i 10 minutter ved 4 ° C. Udfør alle vaske denne, medmindre andet er angivet. Bemærk: Du må ikke bruge PBS + 2%, da det vil forstyrre fixable PI pletten. </li><li> Fjern supernatanten ved at stille pladen, og der tilsættes 100 ml frisklavet kommercielle plet (f.eks fixable røde døde celle plet) til hver brønd. <ol><li> Gør pletten ved fortynding af reaktivt farvestof stamopløsning 1:10 i DMSO efterfulgt af en 1:10 fortynding i PBS. Inkubér pladen ved 4 ° C i 30 minutter beskyttet mod lys. </li></ol></li><li> Centrifugeres psent til 10 minutter ved 300 xg ved 4 ° C. På dette punkt frem, udføre alt arbejde med pladen med vævskultur hætte lys slukket. </li><li> Fjern supernatanten ved at stille pladen og derefter tilsættes 100 ml Fc blok løsning. Gør Fc blok ved at fortynde Fc blok stamopløsning 1: 100 i PBS. </li><li> Fortyndede antistoffer, der skal anvendes til overfladefarvning (f.eks, anti-CD4 eller anti-CD8) i PBS, og der tilsættes 100 ml til hver brønd. Inkubér 96-brønds plade i 30 minutter ved 4 ° C beskyttet mod lys. Bemærk: Surface plet antistoffer bør titreret for optimal ydeevne. Anvender typisk en 1: 200 eller 1: 400 fortynding pr fabrikantens protokol. </li></ol> 3. Intracellulær farvning for histon H3 <ol><li> Efter inkubering af overfladen pletten, vaske cellerne to gange i PBS. </li><li> Efter den sidste vask tilsættes 100 pi 4% paraformaldehyd til hver brønd. Inkubér 96-brønds plade i 5 minutter ved stuetemperatur. Lav 4% paraformaldehyd ved diluting 16% paraformaldehyd i PBS. Gør dette friske. </li><li> Vask cellerne to gange i PBS. </li><li> Gør Perm / blokeringsopløsning (stock Perm løsning er PBS + 2% + 0,02% Triton X-100, opbevares ved 4 ° C) ved at kombinere 2 ml normalt kaninserum pr 100 ml stock Perm løsning. Lav nok til 60 ml / prøve. </li><li> Tilsæt 40 ​​ml Perm / Block til hver prøve, godt og bland godt ved forsigtigt at pipettere op og ned, pas på ikke at lave bobler. Inkubér pladen ved stuetemperatur i 45 minutter i mørke. Spar resterende Perm / blok til trin 3.6. </li><li> Fortynd fluorescens konjugeret histon H3K4me1 antistof i Perm / blokeringsopløsning reserveret i trin 3.5, og der tilsættes 10 pi af denne fortynding til hver brønd. Bland ved forsigtigt at pipettere op og ned. Inkubér 96-brønds plade i mørke i 1 time ved 4 ° C. Bemærk: Brug en H3K4me1 antistof konjugeret under anvendelse af R-Phycoerythrin konjugering kit ifølge producentens anvisninger. </li><li> Vask cellerne to gange i PBS + 2%. </li><li> Resuspender cellerne i 200pi PBS + 2% og overføre prøver til FACS rør til flowcytometri analyse. Prøverne kan opbevares ved 4 ° C i mørke. For at opnå optimale resultater analysere prøverne inden for to dage. Enkeltvis farvede prøver kan bruges som flowcytometri kontroller kompensation. </li></ol>

<ol>
	<li>Bravo-Ferrada, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+surface+damage+on+cell+envelope+assesed+by+afm+and+flow+cytometry+of+lactobacillus+plantarum+exposed+to+ethanol+and+dehydration.">Study of surface damage on cell envelope assesed by afm and flow cytometry of lactobacillus plantarum exposed to ethanol and dehydration.</a> J Appl Microbiol. , (2015).</li><li>Agola, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Bead-Based+Flow+Cytometry+for+Assaying+Rab7+GTPase+Interaction+with+the+Rab-Interacting+Lysosomal+Protein+(RILP)+Effector+Protein.">Quantitative Bead-Based Flow Cytometry for Assaying Rab7 GTPase Interaction with the Rab-Interacting Lysosomal Protein (RILP) Effector Protein.</a> Methods Mol Biol. 1298, 331-354 (2015).</li><li>Toh, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+flow+cytometry+to+analyze+intracellular+location+and+trafficking+of+cargo+in+cell+populations.">Application of flow cytometry to analyze intracellular location and trafficking of cargo in cell populations.</a> Methods Mol Biol. 1270, 227-238 (2015).</li><li>Rawlings, J. S., Gatzka, M., Thomas, P. G., Ihle, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+condensation+via+the+condensin+II+complex+is+required+for+peripheral+T-cell+quiescence.">Chromatin condensation via the condensin II complex is required for peripheral T-cell quiescence.</a> EMBO J. 30, 263-276 (2011).</li><li>Lee, M. D., Bingham, K. N., Mitchell, T. Y., Meredith, J. L., Rawlings, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+mobilization+is+both+required+and+sufficient+for+initiating+chromatin+decondensation+during+activation+of+peripheral+T-cells.">Calcium mobilization is both required and sufficient for initiating chromatin decondensation during activation of peripheral T-cells.</a> Mol Immunol. 63, 540-549 (2015).</li><li>Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamental immunology. , (2013).</li><li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling+in+lymphocyte+activation+and+disease.">Calcium signalling in lymphocyte activation and disease.</a> Nat Rev Immunol. 7, 690-702 (2007).</li><li>Isakov, N., Altman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C(theta)+in+T+cell+activation.">Protein kinase C(theta) in T cell activation.</a> Annu Rev Immunol. 20, 761-794 (2002).</li><li>Macian, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NFAT+proteins:+key+regulators+of+T-cell+development+and+function.">NFAT proteins: key regulators of T-cell development and function.</a> Nat Rev Immunol. 5, 472-484 (2005).</li><li>Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+by+calcium,+calcineurin+and+NFAT.">Transcriptional regulation by calcium, calcineurin and NFAT.</a> Genes Dev. 17, 2205-2232 (2003).</li><li>Rawlings, J. S., Rosler, K. M., Harrison, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK/STAT+signaling+pathway.">The JAK/STAT signaling pathway.</a> J Cell Sci. 117, 1281-1283 (2004).</li><li>Ihle, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STATs:+signal+transducers+and+activators+of+transcription.">STATs: signal transducers and activators of transcription.</a> Cell. 84, 331-334 (1996).</li><li>Moriggl, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stat5+is+required+for+IL-2-induced+cell+cycle+progression+of+peripheral+T+cells.">Stat5 is required for IL-2-induced cell cycle progression of peripheral T cells.</a> Immunity. 10, 249-259 (1999).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+and+their+function.">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li></ol>

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Vi udviklede en protokol, der giver mulighed for vurdering af chromatinkondensering i T-celler. Den er afhængig af den simple iagttagelse, at histon H3-antistoffer ikke kan få adgang til deres epitoper let i naive celler, men på T-celle aktivering, de samme antistoffer er i stand til at binde sig til deres epitoper. Ved at sammenligne MFI af histon H3 farvning mellem behandlingsgrupperne, kan bestemmes den relative grad af kondensvand eller dekondensering. Vi har brugt denne protokol til at bestemme relative kondens status under thymocyt udvikling og under T-celle aktivering 4. Vi har også brugt denne protokol til at undersøge de mekanismer, der styrer dekondensering processen 5. Denne protokol bygger på anvendelsen af ​​en histon H3-antistof til påvisning chromatinkondensering status. Da der ikke er nogen global ændring i histon modifikation under T-celle-aktivering 4, er vi i stand til at bruge en H3K4me1 antistof til at vurdere kromatinstatus i denne protokol. Vi har brugt antistoffer mod umodificeret Histone H3; imidlertid signalet produceret var meget svagere samlet. Det er vores erfaring, antistoffer mod modificeret Histone H3 fungere bedre i immunfluorescens og flowcytometri analyser, mens antistoffer mod umodificeret Histone H3 fungere bedre i Western blot. Det skal bemærkes, at det også er muligt at anvende antistoffer mod andre histonproteiner, selv om vi ikke har forsøgt det. De Perm / Block og histon H3 antistof trin er de mest kritiske trin i protokollen. Mængden af ​​Perm / blokeringsopløsning anvendes skal optimeres hver gang bestanden Perm opløsningen er fremstillet. Dette kan gøres ved at sammenligne effektiviteten af ​​forskellige fortyndinger af stamopløsningen. Et typisk eksperiment omfatter en sammenligning kromatin status i naive T-celler til dem aktiveret i 3 timer (figur 4). Man bør vælge den fortynding, der producerer den største ændring i MFI løbettidsperioden analyseret. Stamopløsningen kan fortyndes i PBS + 2% for at mindske Perm / Block styrke ved først at resuspendering af cellerne i så meget som 100 ml PBS + 2% efter trin 3.4 og derefter tilsætte Perm / Block i trin 3.5. Et lignende pilotforsøg bør anvendes til at teste forskellige fortyndinger af fluorescens konjugeret histon H3-antistof hver gang et nyt parti af antistof er mærket. Disse trin er særligt afgørende for en vellykket påvisning af kondensationsprodukter forskelle tidligt i T-celleaktivering (f.eks indenfor 3 timer for aktivering). Indimellem er der celler, som ikke får permeabiliserede og vil således ikke farves med histon H3 antistof. Dette kan ske, hvis cellerne ikke resuspenderes godt, når tilsætning af Perm / Bloker eller hvis Perm / Block er ikke stærk nok. Disse celler vises som begivenheder presses mod aksen, når visualisere et histogram af histon H3 farvning. Da disse begivenheder vil forvrænge den samlede MFI, kan disse begivenheder udelades fra analyse af Gating den normale fordeling af histon H3-positive celler. Kan findes yderligere hjælp i Vejledning til fejlfinding (tabel 1). Inkluderingen af ​​et fixable døde cellefarvende muliggør vurdering af cellelevedygtighed i assayet. Dette er helt afgørende, når manipulere T-celle aktivering, fordi visse stimuli kan fremkalde celledød. I et sådant tilfælde, kan histon H3 antistoffet binder histoner i døde celler anderledes end levende celler, hvilket fører til fejlfortolkninger af resultaterne. Denne protokol er udviklet til brug i 96-brønds plade-format, tillader en høj produktion analyse af kromatin status. En milt fra en 6-8 uger gammel hunmus vil typisk give mellem 60 til 90.000.000 celler ved anvendelse af protokollen. Da farvningsprotokollen kræver 2 millioner celler pr prøven, kan man nemt analysere flere behandlingsgrupper og tidspunkter i tre eksemplarer med en enkelt milten på en enkelt plade med 96 brønde. Det er muligt at perform protokollen med mindre celler pr prøve; Men på grund af antallet af trin og centrifugeringstrin den iboende tab af celler ved hvert af disse trin, er det ikke tilrådeligt at sænke antallet af celler ved meget. Vi har med succes gennemført protokol med 1 million celler pr prøve. Vi brugte denne protokol til at undersøge kromatin status i CD4 + T-hjælper celler og CD8 + cytotoksiske T-celler. Dette er gjort muligt, fordi protokollen indeholder standard overflade farvning. Protokollen kunne let tilpasses til undersøgelse af kromatin i andre lymfocytsubpopulationer ved at bruge antistoffer mod befolkningens-specifikke overflademarkører. Denne protokol kan også nemt tilpasses til andre celletyper, så længe antistoffer, der genkender relevante overflademarkører er tilgængelige og korrekt fiksering / permeabilisering betingelser er kendt.

Flowcytometri er en laserbaseret teknologi udviklet til analyse af flere fysiske og fluorescerende parametre i cellepopulationer. Denne teknologi fungerer som suspenderede celler i en strøm af fluid støder en laser, spændende fluorescerende markører på eller inden i cellerne. Disse markører derefter udsender lys, der detekteres og kvantificeres ved fotomultiplikatorrør. Mens flowcytometri traditionelt har været anvendt til at identificere populationer af celler, har det vist sig at være en nyttig teknologi, når man studerer en bred vifte af celleegenskaber, herunder cellemembranens integritet, protein-protein interaktioner og protein handel 1-3. Vi har udviklet en protokol, der tillader denne teknologi, der skal anvendes til at detektere tilstanden af kromatin i T-celler, når de aktiveres in vitro 4. Vi har også brugt denne protokol til at undersøge mekanismen for aktivering-induceret chromatin dekondensering af T-celler 5. T-celle activation og proliferation er afgørende for et svar korrekt immunrespons. T-celler, en specifik undergruppe af lymfocytter i immunsystemet, der er nødvendige for korrekt immunrespons og udvikling af immunologisk hukommelse. Aktivering initieres, når et antigen præsenteres i forbindelse med den større kompatibilitet komplekset til T-cellereceptoren (TCR) placeret på den ekstracellulære overflade af hvilende T-celler (gennemgået i 6). Dette udløser en række dynamiske og stærkt ordnede molekylære begivenheder i T-celler, som kulminerer i en stigning i intracellulær Ca2 + -koncentration 7 og nuklear translokation af transkriptionsfaktorer, der er nødvendige for aktivering (revideret i 8-10). Når den er aktiveret, får T-celler evnen til at reagere på Interleukin-2 (IL-2), en potent vækstfaktor, som udnytter JAK (Janus kinase) / STAT (signaltransducer og aktivator af transkription) pathway at drive klonal proliferation af aktiverede T celler 11. Kort fortalt, IL-2-stimuleringresulterer i phosphorylering af STAT-proteiner, en familie af cytosoliske latente transkriptionsfaktorer. Når phosphoryleret, STAT proteiner dimeriserer, translokere til kernen og drev ekspression af gener, herunder de involverede i cellecyklusprogression. I T-celler, IL-2 signaler via STAT5, som er nødvendig for T-celleproliferation 12,13. For at opnå klonal ekspansion af aktiverede T-celler, skal de celler, der ikke har oplevet antigen-TCR engagement (naive T-celler), har en mekanisme til at ignorere de potente virkninger af IL-2. Dette opnås via reguleringen af ​​kromatin status. Naive T-celler har en kondenseret kromatin, som forbyder STAT5-DNA engagement som respons på IL-2-stimulering. Ved aktivering kan kromatin decondenses og STAT5 adgang til initiativtagerne til målgener, tillader klonal proliferation 4. Interessant denne ændring i kromatin status er ikke afhængig af epigenetisk modifikation af histon Proteins (til gennemgang, se 14), da vi observeret nogen globale ændringer i histon modifikation under T-celle aktivering 4. Under udførelsen af disse undersøgelser, opdagede vi, at antistoffer rejst mod histonproteiner havde også svært ved at få adgang til deres epitoper i naive celler, men ved aktivering kunne lettere binde deres epitoper 4. Således antistofbinding til histoner fungerer som en udlæsning for chromatinkondensation status. Her præsenterer vi den metode at anvende flowcytometri til at detektere fluorescens konjugeret histon H3 antistoffer med henblik på at vurdere kromatin status i T-celler. Chromatinkondensering i en population af celler måles som den gennemsnitlige fluorescens intensitet (MFI) på histon H3-farvning. I forbindelse med T-celleaktivering, MFI histon H3 farvning stiger, symboliserer dekondensering af kromatin. Ud over at måle kromatin status via intracellulær Histone H3 farvning, denne protokol også incorporates overflade farvning og en fixable plet for levende celler, tillader analyse af subpopulationer af celler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:584px;" width="585">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">100mm tissue culture dish</td>
			<td style="width:83px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Precleaned frosted microscope slides</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sterile cell strainer, 70mm nylon mesh</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">3mL syringe, Luer-Lok tip</td>
			<td style="width:83px;">BD</td>
			<td>309585</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Falcon 50mL polypropylene conical tube</td>
			<td style="width:83px;">Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">LIVE/DEAD fixable red dead cell stain kit</td>
			<td style="width:83px;">Life Technologies</td>
			<td>L23102</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies sells versions of this kit with different colors</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Fc Block</td>
			<td style="width:83px;">BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">16% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:83px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Normal rabbit serum</td>
			<td style="width:83px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">R9133</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Anti-H3K4me1 antibody</td>
			<td style="width:83px;">Abcam</td>
			<td>ab8895</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">R-Phycoerythrin conjugation kit</td>
			<td style="width:83px;">Abcam</td>
			<td>ab102919</td>
			<td style="width:167px;">Alternatively, the LYNX rapid RPE kit from AbD Serotec can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of flow cytometry to assess the state of chromatin in t cells

Under et svar korrekt immunrespons, bliver hvilende T-celler aktiveres ved antigenpræsentation til deres antigen-specifik T-cellereceptor. Dette fører til klonal proliferation af kun de T-celler, som bærer en receptor, der genkender antigenet. Chromatin dekondensering er kendetegnende for T-celleaktivering og er nødvendig for T-celler at erhverve evnen til at proliferere efter antigen engagement. Denne ændring i chromatinkondensering kan detekteres under anvendelse af antistoffer rejst mod histonproteiner. Disse antistoffer kan ikke binde til deres epitoper i naive T-celler såvel som de kan i aktiverede T-celler. Vi beskriver, hvordan man samtidig plette T-celle-specifikke overflademarkører, levedygtighed spor med en fixable døde celle pletten, og måle kromatin status via intracellulær farvning af histon H3 proteiner. Farvede celler analyseres ved flowcytometri og chromatinkondensering status måles som den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) af histon H3 pletten. Chromati dekondensering under T-celleaktivering er påvist som en stigning i MFI

Lymfocytter fra en C57B / 6 mus blev forarbejdet til en enkelt celle suspension i overensstemmelse med protokollen og tælles ved hjælp af en standard hæmocytometer. Celler blev podet i tre eksemplarer ved 2 x 10 6 / ml i T-celle-medier i 15 ml koniske rør og efterladt ubehandlet eller stimuleret med 1 mg / ml opløselige anti-CD3-antistoffer (klon 4C11) i 3 timer ved 37 ° C i en standard vævskultur inkubator. Døde celler blev farvet og derefter celler blev derefter overfladebehandlet farvet under anvendelse FITC-CD8 og APC-CD4-antistoffer i overensstemmelse med protokollen. Histon tilgængelighed blev analyseret via flowcytometri (figur 4). I begge naive CD4 + og CD8 + T-celler, var den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) er lav, som betyder en kondenseret kromatin tilstand. Som celler aktiveres med anti-CD3-antistoffer MFI stiger signifikant (p &lt;0,001, Student t-test) at kromatin har dekondenseret. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig1.jpg" /> Figur 1. Teknik til behandling af milten i en enkelt cellesuspension under anvendelse af matteret mikroskopobjektglas. (A) Milten presses mod matteret overflader af to mikroskopobjektglas. (B) De glider flyttes frem og tilbage mod hinanden frigive lymfocytter i en 100 mm petriskål, indtil resterne af milten er hvide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53533/53533fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig2.jpg" /> Figur 2. Ved hjælp af en sprøjte prop til at trykke resterende røde pulp gennem en 70 mm cellesigte. (A) Red pulp tilbage efter en milt i<html> s forarbejdet til en enkelt cellesuspension og ledes gennem 70 mm cellefilter. (B) Den prop del af en 3 ml sprøjte anvendes til tryk forsigtigt resterende rødt papirmasse gennem cellen si. (C) Efter brug af sprøjten, bør der være næsten ingen røde papirmasse tilbage i cellen si. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53533/53533fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig3.jpg" /> Figur 3. ACK lysis af røde blodlegemer. (A) Centrifugering af en enkelt cellesuspension genereret fra en enkelt mus milt før ACK lysis. (B) Efter ACK lysis af røde blodlegemer, bør cellepelleten være hvidt.få = &quot;_ blank&quot;&gt; Klik her for at se en større version af dette tal. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig4.jpg" /> Figur 4. Repræsentative resultater af protokollen. (A) gating ordning anvendes til at analysere kromatin status i CD4 + T-lymfocytter. (B og C) T-celler blev efterladt ubehandlet eller aktiveret med 1 mg / ml opløselige anti-CD3-antistoffer i 3 timer (tre gange). Cellerne blev derefter analyseret ved flowcytometri til at bestemme chromatinkondensation i CD4 + celler (B) og CD8 + celler (C). Data er middelværdier ± standardafvigelse på middelværdien fluorescensintensitet H3K4me1 farvning. * p &lt;0,001 (Students t-test) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53533/53533fig4large.jpg" target="_blank">Klik h</a>førend at se en større version af dette tal. <img alt="Tabel 1" src="/files/ftp_upload/53533/53533table1.jpg" /> Tabel 1:. Fejlfinding En hurtig reference til almindelige problemer og mulige løsninger.

Watch this Scientific Journal Video about The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells at JoVE.com

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

Brug af flowcytometri at vurdere tilstanden af ​​kromatin i T-celler

Flowcytometri kan udnyttes til at vurdere tilstanden af ​​kromatin i T-celler. Denne protokol giver forskerne at fortolke bevis for chromatin dekondensering under T-celleaktivering påvises ved en stigning i den gennemsnitlige fluorescens intensitet (MFI) af fluorescerende histon H3 antistoffer

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescens-aktiveret cellesortering til oprensning af Plasmacytoide dendritiske celler fra knoglemarven i mus

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Vurdering Retinal mikrogliaceller fagocytotisk funktion<em&gt; In vivo</em&gt; Brug en flowcytometri-baseret assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Udvikling af Stem Cell-afledte antigen-specifikke regulatoriske T celler mod Autoimmunitet

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Måling af T-celle alloreaktivitet Brug Imaging flowcytometri

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation og In Vitro kultur af Murine og menneskelige alveolær makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

Høj overførselshastighed måling af Plasma membran genforsegling effektivitet i pattedyrceller

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Flerfarvet Flow flowcytometri-baserede kvantificering af mitokondrier og lysosomer i T celler

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Fremstilling af hele knoglemarv til masse cytometri analyse af neutrofile-Lineage celler

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Brug af flowcytometri at vurdere tilstanden af ​​kromatin i T-celler

Brug af flowcytometri at vurdere tilstanden af kromatin i T-celler