Name: the use of flow cytometry to assess the state of chromatin in t cells
Uploaded: 2015-12-17T14:00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells at JoVE.com

Dit project werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (5 P20 RR016461 en 8 P20 GM103499), de National Science Foundation (EPS-0.903.795). Verdere ondersteuning door Furman University Research en professionele groei en Furman Advantage awards.

Deze studie werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health uitgevoerd. Het dier protocol werd goedgekeurd door de Furman University Institutional Animal Care en gebruik Comite (Permit nummer: A3242-01). Alle materialen en apparatuur die wordt gebruikt in dit protocol is te vinden in de tabel van materialen en apparatuur, terwijl de buffers gebruikt kunnen worden gevonden in de tabel van Buffers en oplossingen. 1. enkele celsuspensie van lymfocyten van de muis Milten <ol><li> Offeren muizen via CO 2 stikken. Bevestig euthanasie door cervicale dislocatie. Opmerking: Gebruik de milt van twee 6-8 weken oude isogene muizen (bijv C57B / 6) van hetzelfde geslacht. Gewoonlijk worden twee milt verwerkt. </li><li> Spray de dieren overvloedig met 70% ethanol-oplossing en oriënteren zodanig dat het hoofd naar links. </li><li> Met behulp van een tang, til de huid van het dier omhoog en weg van tHij lichaam. Met een schaar, snijd een inkeping door de huid in de buurt van de buik van het dier. Met behulp van vingers, trekt elke zijde van de inkeping om het buikvlies van de hals blootstellen aan het begin van de achterpoten. De milt moet rechtstreeks zichtbaar zijn onder het buikvlies. </li><li> Met behulp van een tang, til het buikvlies en maak een kleine incisie aan de milt bloot. Verwijder de milt met een tang en gebruik een schaar om weg te plagen elke vet- en bindweefsel. </li><li> Plaats de milt in een 50 ml conische buis met 10 ml PBS aangevuld met 2% foetaal runderserum (hierna aangeduid als PBS + 2%). Houd de buis op ijs pas klaar om de enkele celsuspensie beginnen. Opmerking: Typisch herstel is tussen 60-90000000 cellen per milt, en typisch, zijn 2 miljoen cellen nodig per monster. Voer alle volgende stappen in een weefselkweek kap. </li><li> Giet de milten in een steriele 100 mm weefselkweekplaat. </li><li> Verkrijgen twee frosted microscoop dia&#39;s en houd thij glijdt zodat de twee ruwe matte oppervlakken naar binnen naar elkaar. Bevochtig de objectglaasjes in PBS + 2% oplossing gegoten in de petrischaal. </li><li> Houd de milt tussen de matte oppervlakken van de dia met de randen nog steeds onder water, en maal de milt zachtjes bewegen van de schuiven en weer tegen elkaar (figuur 1A). De cellen in de petrischaal vallen. Verder malen totdat alle cellen is bekend en de overblijfselen van de milt wit lijken (Figuur 1B). </li><li> Het opstellen van de celsuspensie in een pipet en filteren het langzaam door een 70 pm filter in een nieuwe steriele 50 ml conische buis. Merk op dat kleine stukjes rode pulp aanwezig op het filter (Figuur 2A) zal zijn. <ol><li> Als de filter stijgt, til deze iets omhoog om de vloeistof door middel van uitlekken en plaats het filter terug in de 50 ml conische buis en blijven, dit proces te herhalen als nodig is. Indien de verwerking van meer dan 5 spleens, kan het noodzakelijk zijn te verdelen in twee batches en gebruik een nieuwe filter voor elk. </li></ol></li><li> De stopper gedeelte van een spuit 3 ml druk de rode pulp met de overige cellen door de zeef (figuur 2B). Zorg ervoor dat het filter op zowel bodem en zijkanten zodat alle rode pulp door het filter (Figuur 2C). </li><li> Voeg 10 mlof PBS + 2% de weefselkweekplaat en gebruiken om de glijbanen, spuit stop en schotel wassen om eventuele resterende cellen te herstellen. Passeert dit via dezelfde 70 micrometer cel zeef in de 50 ml conische buis. Herhaal dit indien nodig. </li><li> Centrifugeer de gefilterde celsuspensie bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li><li> Voorzichtig decanteren en gooi de supernatant, Zorg dat u de pellet te verstoren. Een sporenhoeveelheid PBS + 2% wordt gelaten in de buis. Cap de buis en flick de pellet totdat de pellet volledig geresuspendeerd. </li><li> Lyse rode bloedcellen door adding 2 ml ACK lyseerbuffer (0,15 M NH 4 Cl, 1 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH 7,2, bewaren bij 4 ° C) per milt op de conische buis en draaien en keren de tube te zorgen dat alle cellen in contact met de ACK buffer. Zwenk de buis gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur. </li><li> Breng het volume van de celsuspensie 50 ml door toevoeging van PBS + 2% van de buis naar de ACK buffer te neutraliseren. Inverteer de buis 10 maal en centrifugeer 5 min bij 300 xg bij 4 ° C. Na het centrifugeren voltooid, moet de witte pellet (Figuur 3) zijn. </li><li> Voorzichtig decanteren en gooi de supernatant, Zorg dat u de pellet te verstoren. Laat een spoor hoeveelheid PBS + 2% in de buis, de dop op de tube en flick de pellet te resuspenderen. </li><li> Voeg 10 ml T-celmedium [10% FBS, 10 mM HEPES (pH 7,0), 2 mM GlutaMAX, 1 mM natrium pyruvaat, 1X niet-essentiële aminozuren, 1 x penicilline / streptomycine en 50 mM β-mercaptoethanol], en verder resuspendeer de pellet door voorzichtigen neer te pipetteren. Filteren vervolgens de suspensie door een nieuwe 70 pm filter in een nieuwe 50 ml conische buis. </li><li> Met een 5-10 ml T-celmedium met de oorspronkelijke buis te spoelen en geven deze door de 70 urn filter in het buisje met de rest van de gefilterde cellen. Indien voor meer dan twee milten, kan het volume van T-celmedium verhoogd tot terugwinning te maximaliseren. </li><li> Houd cellen op ijs pas klaar om te worden gekleurd. De cellen moeten worden geteld en de levensvatbaarheid toegankelijk. <ol><li> Cellen tellen combineren 3 ml cellen met 24 ml PBS + 2% en 3 ml van 0,4% trypan blauw. Laad 10 ml van de in iedere kamer van een verbeterde Neubauer hemocytometer. Levensvatbaarheid, zoals vastgesteld door trypan blauw exclusie, ligt typisch tussen 85-95%. </li></ol></li></ol> 2. levensvatbaarheid en Surface kleuring <ol><li> Pellet cellen door centrifugeren gedurende 10 min bij 300 xg bij 4 ° C. Resuspendeer cellen in T-celmedium met een concentratie van 1 x 10 7 cellen / ml. Transfer 2.000.000 cellen (100 ml) in een putje van een U-bodem 96-putjes weefsel kweekplaat. </li><li> Centrifugeer de 96-well plaat gedurende 10 min bij 300 xg bij 4 ° C. </li><li> Verwijder het supernatant uit elk putje door de knop vloeistof in de wells plaat in de gootsteen (de celpellet wordt in de put blijven) en deppen de plaat op een schone papieren handdoek. Was de cellen door resuspenderen in 200 pi PBS, gevolgd door centrifugatie bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Voer alle wassingen Zo tenzij anders vermeld. Opmerking: Gebruik geen PBS + 2% als het zal interfereren met de opgelapt PI vlek. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof door de knop de plaat en voeg 100 ml vers bereide commerciële vlek (bijv fixable rode dode cellen vlek) aan elk putje. <ol><li> Maak de vlek door het verdunnen van de reactieve kleurstof 1:10 voorraadoplossing in DMSO gevolgd door een 1:10 verdunning in PBS. Incubeer de plaat bij 4 ° C gedurende 30 min beschermd tegen licht. </li></ol></li><li> Centrifugeer de plaat gedurende 10 min bij 300 xg bij 4 ° C. Op dit punt naar voren, voeren alle werken met de plaat met de weefselkweek kap licht uit. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof door de knop de plaat en voeg vervolgens 100 ml Fc blok oplossing. Maak Fc blok oplossing door verdunning van Fc blok stock oplossing 1: 100 in PBS. </li><li> Verdun antilichamen worden gebruikt voor oppervlakte kleuring (bijvoorbeeld anti-CD4 of anti-CD8) in PBS en voeg 100 ml in elk putje. Incubeer de 96-well plaat gedurende 30 min bij 4 ° C beschermd tegen licht. Opmerking: Oppervlakte vlek antilichamen worden getitreerd voor optimale prestaties. Typisch gebruik van een 1: 200 of 1: 400 verdunning per protocol van de fabrikant. </li></ol> 3. Intracellulaire kleuring voor histon H3 <ol><li> Na incubatie van het oppervlak vlek, was de cellen tweemaal in PBS. </li><li> Na de laatste wasbeurt, voeg 100 ul van 4% paraformaldehyde aan elk putje. Incubeer de 96-well plaat gedurende 5 min bij RT. Maak 4% paraformaldehyde door diluting 16% paraformaldehyde in PBS. Maak dit vers. </li><li> Was de cellen tweemaal in PBS. </li><li> Maak Perm / Block-oplossing (voorraad Perm oplossing PBS + 2% + 0,02% Triton X-100, op te slaan bij 4 ° C), door het combineren van 2 ml normaal konijnenserum per 100 ml bouillon Perm oplossing. Voeg voldoende voor 60 ml / monster. </li><li> Voeg 40 ml Perm / Block aan elk monster goed en meng goed door voorzichtig en neer te pipetteren, zorg ervoor dat u bellen te maken. Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 45 min in het donker. Opslaan resterende Perm / Block voor stap 3.6. </li><li> Verdun fluorescent geconjugeerd histon H3K4me1 antilichaam in Perm / Block oplossing gereserveerd stap 3,5 en voeg 10 ul van deze verdunning aan elk putje. Meng door zachtjes en neer te pipetteren. Incubeer de 96-well plaat in het donker gedurende 1 uur bij 4 ° C. Opmerking: Gebruik een H3K4me1 antilichaam geconjugeerd met de R-fycoerythrine conjugatie kit volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Was de cellen tweemaal in PBS + 2%. </li><li> Resuspendeer de cellen in 200gl PBS + 2% en breng de monsters FACS buizen voor flowcytometrie analyse. De monsters kunnen bij 4 ° C worden bewaard in het donker. Voor optimale resultaten te analyseren van de monsters binnen twee dagen. Afzonderlijk gekleurd monsters kunnen worden gebruikt als flowcytometrie compensatie controles. </li></ol>

<ol>
	<li>Bravo-Ferrada, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+surface+damage+on+cell+envelope+assesed+by+afm+and+flow+cytometry+of+lactobacillus+plantarum+exposed+to+ethanol+and+dehydration.">Study of surface damage on cell envelope assesed by afm and flow cytometry of lactobacillus plantarum exposed to ethanol and dehydration.</a> J Appl Microbiol. , (2015).</li><li>Agola, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Bead-Based+Flow+Cytometry+for+Assaying+Rab7+GTPase+Interaction+with+the+Rab-Interacting+Lysosomal+Protein+(RILP)+Effector+Protein.">Quantitative Bead-Based Flow Cytometry for Assaying Rab7 GTPase Interaction with the Rab-Interacting Lysosomal Protein (RILP) Effector Protein.</a> Methods Mol Biol. 1298, 331-354 (2015).</li><li>Toh, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+flow+cytometry+to+analyze+intracellular+location+and+trafficking+of+cargo+in+cell+populations.">Application of flow cytometry to analyze intracellular location and trafficking of cargo in cell populations.</a> Methods Mol Biol. 1270, 227-238 (2015).</li><li>Rawlings, J. S., Gatzka, M., Thomas, P. G., Ihle, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+condensation+via+the+condensin+II+complex+is+required+for+peripheral+T-cell+quiescence.">Chromatin condensation via the condensin II complex is required for peripheral T-cell quiescence.</a> EMBO J. 30, 263-276 (2011).</li><li>Lee, M. D., Bingham, K. N., Mitchell, T. Y., Meredith, J. L., Rawlings, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+mobilization+is+both+required+and+sufficient+for+initiating+chromatin+decondensation+during+activation+of+peripheral+T-cells.">Calcium mobilization is both required and sufficient for initiating chromatin decondensation during activation of peripheral T-cells.</a> Mol Immunol. 63, 540-549 (2015).</li><li>Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamental immunology. , (2013).</li><li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling+in+lymphocyte+activation+and+disease.">Calcium signalling in lymphocyte activation and disease.</a> Nat Rev Immunol. 7, 690-702 (2007).</li><li>Isakov, N., Altman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C(theta)+in+T+cell+activation.">Protein kinase C(theta) in T cell activation.</a> Annu Rev Immunol. 20, 761-794 (2002).</li><li>Macian, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NFAT+proteins:+key+regulators+of+T-cell+development+and+function.">NFAT proteins: key regulators of T-cell development and function.</a> Nat Rev Immunol. 5, 472-484 (2005).</li><li>Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+by+calcium,+calcineurin+and+NFAT.">Transcriptional regulation by calcium, calcineurin and NFAT.</a> Genes Dev. 17, 2205-2232 (2003).</li><li>Rawlings, J. S., Rosler, K. M., Harrison, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK/STAT+signaling+pathway.">The JAK/STAT signaling pathway.</a> J Cell Sci. 117, 1281-1283 (2004).</li><li>Ihle, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STATs:+signal+transducers+and+activators+of+transcription.">STATs: signal transducers and activators of transcription.</a> Cell. 84, 331-334 (1996).</li><li>Moriggl, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stat5+is+required+for+IL-2-induced+cell+cycle+progression+of+peripheral+T+cells.">Stat5 is required for IL-2-induced cell cycle progression of peripheral T cells.</a> Immunity. 10, 249-259 (1999).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+and+their+function.">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li></ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

We ontwikkelden een protocol waarmee voor de beoordeling van chromatine condensatie in T-cellen. Het berust op de eenvoudige waarneming dat histon H3 antilichamen niet gemakkelijk toegang tot hun epitopen in naïeve cellen, maar bij T-celactivering, deze zelfde antilichamen kunnen binden aan hun epitopen. Bij vergelijking van de MFI van histone H3 kleuring tussen behandelingsgroepen, kunnen de relatieve mate van condensatie of decondensatie bepaald. We hebben dit protocol dat wordt gebruikt om de relatieve condensatie-status tijdens thymocyte ontwikkeling en tijdens de T-cel activatie 4 bepalen. We hebben ook gebruik gemaakt van deze protocol om de mechanismen die de decondensatie proces 5 controle te onderzoeken. Dit protocol gebaseerd op het gebruik van histon H3 antilichaam voor chromatinecondensatie toestand te detecteren. Omdat er geen wereldwijde verandering in histonmodificatie tijdens T-cel activatie 4, zijn we in staat om een H3K4me1 antilichaam gebruiken om chromatine beoordelenstatus van dit protocol. We hebben antilichamen opgewekt tegen ongewijzigde histon H3 gebruikt; echter, het geproduceerde signaal was veel zwakker algemeen. In onze ervaring, antilichamen opgewekt tegen gemodificeerde histon H3 beter werken in immunofluorescentie en flowcytometrie testen, terwijl antilichamen tegen ongewijzigde histon H3 beter werken in Western blot. Er zij op gewezen dat het ook mogelijk is om antilichamen opgewekt tegen andere histon eiwitten gebruiken, maar er is getracht het. De Perm / Block en histon H3 antilichaam stappen zijn de meest cruciale stappen in het protocol. De hoeveelheid Perm / Block oplossing gebruikt moet worden geoptimaliseerd telkens de voorraad Perm oplossing wordt bereid. Dit kan door de prestaties van verschillende verdunningen van de voorraadoplossing. Een typisch experiment vergelijkt men chromatine status naïeve T-cellen die geactiveerd voor 3 uur (Figuur 4). Men moet de verdunning dat de grootste verandering produceert in MFI dan kiezende periode geanalyseerd. De voorraadoplossing kan worden verdund in PBS + 2% Perm / Block sterkte afnemen door eerst de cellen te resuspenderen in zoverre 100 ml PBS + 2% na stap 3,4 en toevoegen van de Perm / blok in stap 3,5. Een soortgelijk proefproject worden gebruikt om verschillende verdunningen te testen van de fluorescent geconjugeerde histon H3 antilichaam elke nieuwe partij antilichaam gelabeld. Deze stappen zijn bijzonder kritisch voor succesvolle detectie van condensatie verschillen vroeg in T-cel activatie (bijvoorbeeld binnen 3 h activatie). Soms zijn er cellen die geen gepermeabiliseerde krijgen en zullen dus geen vlekken de Histon H3 antilichaam. Dit kan gebeuren als de cellen niet goed worden geresuspendeerd bij het toevoegen van de Perm / blok of de Perm / Block niet sterk genoeg is. Deze cellen zullen als gebeurtenissen gedrukt tegen de as bij het visualiseren van een histogram van Histon H3 kleuring. Aangezien deze gebeurtenissen zal scheef de totale MFI, kunnen deze gebeurtenissen worden weggelaten uit de analyse door Gating de normale verdeling van histon H3 positieve cellen. Extra hulp kan worden gevonden in de handleiding Problemen oplossen (tabel 1). De opname van een vastzetbaar dode cel kleuring maakt de beoordeling van cellevensvatbaarheid in de test. Dit is absoluut van cruciaal belang bij het manipuleren van T-cel activatie, omdat bepaalde prikkels celdood kan induceren. In een dergelijk geval kan het histon H3 antilichaam histonen in dode cellen binden anders dan levende cellen, wat leidt tot een verkeerde interpretatie van de resultaten. Dit protocol is ontworpen voor gebruik in 96-well plaat formaat, waardoor een hoge doorvoer analyse van chromatine toestand. Een milt uit een 6-8 weken oude vrouwtjes zal typisch opbrengst tussen 60-90 miljoen cellen via het protocol. Aangezien de kleuring protocol vereist 2 miljoen cellen per monster, kan men gemakkelijk testen meerdere behandelingsgroepen en tijdstippen in drievoud met een milt op een 96-wells plaat. Het is mogelijk om perform het protocol met minder cellen per monster; Vanwege het aantal centrifugatiestappen en het inherente verlies van cellen bij elk van deze stappen, is het niet raadzaam om het aantal cellen te verlagen door veel. We hebben met succes het protocol met 1.000.000 cellen per monster voltooid. We gebruiken dit protocol om chromatine status CD4 + T-helpercellen en CD8 + cytotoxische T-cellen te onderzoeken. Dit wordt mogelijk gemaakt omdat het protocol bevat standaard oppervlak vlekken. Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor het onderzoeken van chromatine op andere lymfocyt subpopulaties met antilichamen tegen specifieke populatie oppervlaktemerkers. Dit protocol kan ook gemakkelijk worden aangepast aan andere celtypen mits antilichamen die relevant oppervlaktemerkers zijn en goede fixatie / permeabilisatie voorwaarden bekend.

Flowcytometrie is een laser gebaseerde technologie ontwikkeld voor de analyse van meerdere fysieke en fluorescentie parameters celpopulaties. Deze technologie werkt als gesuspendeerde cellen in een vloeistofstroom ontmoeting een laser, spannende fluorescente markeringen op of in de cellen. Deze merkers vervolgens licht uitstralen dat wordt gedetecteerd en gekwantificeerd door fotomultiplicatorbuizen. Hoewel flowcytometrie oudsher gebruikt om populaties van cellen te identificeren, heeft bewezen een geschikte technologie bij het ​​bestuderen van een array van celeigenschappen met inbegrip celmembraanintegriteit, eiwit-eiwit interacties en eiwittransport 1-3. Wij hebben een protocol waarmee deze technologie te gebruiken om de toestand van chromatine in T-cellen te detecteren als zij geactiveerd worden in vitro 4 ontwikkeld. We hebben ook gebruik gemaakt van deze protocol om het mechanisme van activering geïnduceerde chromatine decondensatie van T-cellen 5 te onderzoeken. T-cel activation en proliferatie cruciaal zijn voor een goede immuunrespons. T-cellen, een specifieke ondergroep van lymfocyten in het immuunsysteem, zijn vereist voor de juiste immuunrespons en de ontwikkeling van immunologisch geheugen. Activering begint wanneer een antigeen wordt gepresenteerd in de context van de grote verenigbaarheid complex aan de T-celreceptor (TCR) die op het extracellulaire oppervlak van rustende T-cellen (besproken in 6). Dit veroorzaakt een reeks dynamische en sterk geordende moleculaire gebeurtenissen in T-cellen die leiden tot een toename van de intracellulaire Ca2 + -concentratie 7 en nucleaire translocatie van transcriptiefactoren die nodig zijn voor activatie (besproken in 8-10). Eenmaal geactiveerd T-cellen verwerven het vermogen om te reageren op interleukine-2 (IL-2), een potente groeifactor die de JAK (Janus Kinase) / STAT gebruikt (Signal Transducer en Activator van Transcriptie) route om klonale proliferatie van geactiveerde T drijven 11 cellen. In het kort, IL-2 stimulatieresulteert in de fosforylatie van STAT-eiwitten, een familie van latente cytosolische transcriptiefactoren. Eenmaal gefosforyleerd STAT eiwitten dimeriseren, naar de kern en rijden expressie van genen waaronder die betrokken bij celcyclusprogressie. In T-cellen, IL-2 signalen via STAT5, die nodig is voor T-celproliferatie 12,13. Om klonale expansie van geactiveerde T-cellen te bereiken, moeten die cellen die niet ervaren antigeen-TCR engagement (naïeve T-cellen), een mechanisme om de krachtige effecten van IL-2 te negeren. Dit wordt bereikt via de regulering van chromatine-status. Naïeve T-cellen bezitten een gecondenseerd chromatine dat STAT5-DNA betrokkenheid verbiedt in respons op IL-2 stimulatie. Na activering, kan chromatine decondenses en STAT5 toegang tot de initiatiefnemers van target genen, waardoor klonen proliferatie 4. Interessant is dat deze veranderingen in chromatine status niet afhankelijk epigenetische modificatie van histon Proteins (voor een overzicht, zie 14) en zagen we geen wereldwijde verandering in histonmodificatie tijdens T-cel activatie 4. Tijdens het uitvoeren van deze studies, ontdekten we dat antilichamen opgewekt tegen histoneiwitten moeilijk toegang tot hun epitopen in naïeve cellen had ook, maar dat na activatie konden hun epitopen 4 gemakkelijker te binden. Aldus antilichaambinding aan histonen dient als een uitlezing voor chromatinecondensatie toestand. Hier presenteren we de methode flowcytometrie om fluorescent geconjugeerde histon H3 antilichamen om chromatine status T-cellen te beoordelen. Chromatinecondensatie in een populatie van cellen wordt gemeten als de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van Histon H3 kleuring. In de context van T-cel activatie, de MFI van histone H3 kleuring toeneemt, betekent de decondensatie van chromatine. Naast het meten van chromatine-status via intracellulaire histon H3 kleuring, dit protocol incorpora ooktes oppervlak vlekken en een fixable vlek voor levende cellen, waardoor de analyse van subpopulaties van cellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:584px;" width="585">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">100mm tissue culture dish</td>
			<td style="width:83px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Precleaned frosted microscope slides</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sterile cell strainer, 70mm nylon mesh</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">3mL syringe, Luer-Lok tip</td>
			<td style="width:83px;">BD</td>
			<td>309585</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Falcon 50mL polypropylene conical tube</td>
			<td style="width:83px;">Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">LIVE/DEAD fixable red dead cell stain kit</td>
			<td style="width:83px;">Life Technologies</td>
			<td>L23102</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies sells versions of this kit with different colors</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Fc Block</td>
			<td style="width:83px;">BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">16% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:83px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Normal rabbit serum</td>
			<td style="width:83px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">R9133</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Anti-H3K4me1 antibody</td>
			<td style="width:83px;">Abcam</td>
			<td>ab8895</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">R-Phycoerythrin conjugation kit</td>
			<td style="width:83px;">Abcam</td>
			<td>ab102919</td>
			<td style="width:167px;">Alternatively, the LYNX rapid RPE kit from AbD Serotec can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of flow cytometry to assess the state of chromatin in t cells

Bij een juiste immuunrespons, rustende T-cellen worden geactiveerd door antigeen presentatie aan de antigeenspecifieke T-celreceptor. Dit leidt tot klonale proliferatie van alleen die T-cellen die een receptor die het antigeen herkent dragen. Chromatine decondensatie is een kenmerk van T-cel activatie en is noodzakelijk voor T-cellen het vermogen om te prolifereren na antigen aangrijping verkrijgen. Deze verandering in chromatine condensatie kan worden gedetecteerd met behulp van antilichamen opgewekt tegen histon-eiwitten. Deze antilichamen kunnen binden aan hun epitopen in naïeve T-cellen en ze kunnen in geactiveerde T-cellen. We beschrijven hoe gelijktijdig vlek T-cel-specifieke oppervlakte markers, levensvatbaarheid track met een fixable dode cel vlek, en meet chromatine-status via intracellulaire kleuring van Histon H3 eiwitten. Gekleurde cellen worden geanalyseerd met stroomcytometrie en chromatine condensatie status wordt gemeten als de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van het Histon H3 vlek. Chromatin decondensatie tijdens T-celactivering wordt aangetoond als een toename van de MFI

Lymfocyten uit C57B / 6 muizen werden verwerkt tot een enkele celsuspensie volgens het protocol en geteld met een hemocytometer standaard. Cellen werden in drievoud bij 2 x 10 6 / ml in T-celmedium in 15 ml conische buizen en onbehandeld of gestimuleerd met 1 mg / ml oplosbaar anti-CD3-antilichamen (kloon 4C11) gedurende 3 uur bij 37 ° C in een standaard weefselkweek incubator. Dode cellen werden gekleurd en vervolgens cellen werden vervolgens gekleurd met behulp oppervlak FITC-CD8 en CD4-APC antilichamen volgens het protocol. Histon toegankelijkheid werd geanalyseerd via stroomcytometrie (Figuur 4). In beide naïeve CD4 + en CD8 + T-cellen was de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) is laag, betekent een gecondenseerd chromatine toestand. Omdat cellen worden geactiveerd met anti-CD3 antilichamen de MFI verhoogt significant (p &lt;0,001, Student t-test) aangeeft dat chromatine is decondensed. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig1.jpg" /> Figuur 1. Technieken voor het verwerken milten in een enkele celsuspensie met behulp frosted objectglaasjes. (A) De milt wordt gedrukt tegen de matte oppervlakken van twee microscoopglaasjes. (B) De dia&#39;s worden heen en weer tegen elkaar vrijgeven van lymfocyten verplaatst in een 100 mm petrischaal totdat de resten van de milt zijn wit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53533/53533fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig2.jpg" /> Figuur 2. Met behulp van een injectiespuit stopper resterende rode pulp door een 70 mm zeef cel drukt. (A) Rode pulp achterblijft na milt i<html> s verwerkt tot een enkele celsuspensie en door de 70 mm cel zeef. (B) De stop gedeelte van een injectiespuit 3 ml wordt gebruikt om voorzichtig resterende rode pulp door de cel zeef. (C) Na het gebruik van de spuit, moet er vrijwel geen rode pulp links in de cel zeef zijn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53533/53533fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig3.jpg" /> Figuur 3. ACK lysis van rode bloedcellen. (A) Centrifugeren van een enkele celsuspensie gegenereerd uit een enkele muis milt voorafgaand aan lysis ACK. (B) Na ACK lysis van rode bloedcellen, moet de celpellet wit zijn.krijgen = &quot;_ blank&quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig4.jpg" /> Figuur 4. Representatieve resultaten van het protocol. (A) Poortsignalen schema gebruikt om chromatine status CD4 + T-lymfocyten te analyseren. (B en C) T-cellen werden onbehandeld gelaten of geactiveerd met 1 mg / ml oplosbaar anti-CD3 antilichamen van 3 uur (in drievoud). De cellen werden daarna geanalyseerd met stroomcytometrie op chromatine condensatie in CD4 + cellen (B) en CD8 + cellen (C) te bepalen. Gegevens zijn gemiddelden ± standaarddeviatie van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van H3K4me1 kleuring. * p &lt;0,001 (T-test Student&#39;s) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53533/53533fig4large.jpg" target="_blank">Klik h</a>ere voor een grotere versie van deze figuur te bekijken. <img alt="tabel 1" src="/files/ftp_upload/53533/53533table1.jpg" /> Tabel 1:. Problemen oplossen Een snelle verwijzing naar gemeenschappelijke problemen en mogelijke oplossingen.

Watch this Scientific Journal Video about The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells at JoVE.com

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

Het gebruik van flowcytometrie om de staat van chromatine in T-cellen Assess

Flowcytometrie kan worden gebruikt om de toestand van chromatine in T-cellen te beoordelen. Dit protocol maakt wetenschappers bewijs van chromatine decondensatie tijdens T-celactivering aangetoond door een verhoging van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van fluorescente histon H3 antilichamen interpreteren

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Kwantitatieve beoordeling van immuuncellen in de gekwetste ruggenmergweefsel door flowcytometrie: een roman te gebruiken voor een cel zuiveringsmethode

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Menselijk In Vitro Onderdrukking als Screening Tool voor de erkenning van een vroege staat van Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting voor Zuivering van plasmacytoïde dendritische cellen van de muis Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Het beoordelen van het netvlies Microgliale fagocytosefunctietesten<em&gt; In Vivo</em&gt; Met behulp van een flowcytometrie-gebaseerde test

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Ontwikkeling van stamcel-afgeleide Antigeen-specifieke regulatoire T-cellen tegen auto-immuniteit

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Meting van de T-cel alloreactiviteit Met behulp van Imaging flowcytometrie

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolatie en In Vitro cultuur van lymfkliertest en menselijke alveolaire macrofagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

High-throughput meting van plasmamembraan opnieuw verzegelen efficiëntie bij zoogdiercellen

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Multicolor Stroom Cytometry gebaseerde kwantificering van Mitochondria en lysosomen in T cellen

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Voorbereiding van het hele beenmerg voor massa Cytometry analyse van neutrofiele-Lineage cellen

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...