Name: the use of flow cytometry to assess the state of chromatin in t cells
Uploaded: 2015-12-17T14:00:00
Duration: 11 min 1 s
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Ce projet a été soutenu par des subventions des Instituts nationaux de la santé (5 P20 RR016461 et 8 P20 GM103499), la National Science Foundation (EPS-0903795). Un soutien supplémentaire fournie par la recherche et la croissance professionnelle de l&#39;Université Furman et récompenses Furman Advantage.

Cette étude a été réalisée en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Le protocole de l&#39;animal a été approuvé par le (numéro de permis: de A3242-01) Comité institutionnel de protection et d&#39;utilisation des animaux de l&#39;Université Furman. Tous les matériaux et l&#39;équipement utilisés dans ce protocole peuvent être trouvés dans la table des matières et équipements, tandis que les tampons utilisés peuvent être trouvés dans la table des tampons et solutions. 1. Single suspension cellulaire des lymphocytes de rates de souris <ol><li> Sacrifiez souris via CO 2 asphyxie. Confirmez l&#39;euthanasie par dislocation cervicale. Remarque: Utilisez les rates de deux vieux 6-8 semaines souris isogénique (par exemple, C57B / 6) du même sexe. En règle générale, deux rates sont traitées. </li><li> Vaporiser les animaux abondamment avec une solution d&#39;éthanol à 70% et orienter de telle sorte que la tête est tournée vers la gauche. </li><li> En utilisant des pinces, soulever la peau de l&#39;animal vers le haut et loin de til corps. Avec des ciseaux, couper une petite encoche dans la peau près de l&#39;abdomen de l&#39;animal. Avec les doigts, tirez de chaque côté de l&#39;encoche pour exposer le péritoine du cou au début des pattes postérieures. La rate doit être visible directement sous le péritoine. </li><li> En utilisant des pinces, soulever le péritoine et faire une petite incision pour exposer la rate. Retirer la rate avec une pince et utiliser des ciseaux pour taquiner l&#39;écart toute tissu adipeux et conjonctif. </li><li> Placer la rate dans un tube conique de 50 ml contenant 10 ml de PBS supplémenté avec 2% de sérum bovin fœtal (ci-après dénommé PBS + 2%). Garder le tube sur la glace jusqu&#39;à ce que prêt à commencer la suspension de cellule unique. Remarque: la récupération typique est entre 60 à 90.000.000 cellules par la rate, et typiquement, 2 millions de cellules sont nécessaires par échantillon. Effectuer toutes les étapes suivantes dans une hotte de culture de tissu. </li><li> Décanter les rates dans une boîte de 100 mm de culture de tissu stérile. </li><li> Obtenir deux lames de microscope givrées et maintenez til glisse de sorte que les deux surfaces rugueuses font face vers l&#39;intérieur dépoli vers l&#39;autre. Mouiller les lames dans la solution de PBS + 2% versé dans la boîte de Pétri. </li><li> Maintenez la rate entre les surfaces dépolies des diapositives, avec les bords encore submergées, et broyer la rate doucement en déplaçant les glissières avant et en arrière une contre l&#39;autre (figure 1A). Les cellules vont tomber dans la boîte de Pétri. Continuer de broyage jusqu&#39;à ce que toutes les cellules ont été libérés et les restes de la rate apparaissent en blanc (figure 1B). </li><li> Dresser la suspension cellulaire dans une pipette et filtrer lentement à travers un filtre de 70 um dans un nouveau 50 ml tube conique stérile. Notez que les petits morceaux de pulpe rouge seront présents sur le filtre (figure 2A). <ol><li> Si le filtre se lève doucement le soulever légèrement pour permettre au fluide de drain à travers et placez le filtre dans le tube conique de 50 ml et continuer, répétant ce processus si nécessaire. Si le traitement de plus de 5 SPLEens, il peut être nécessaire de diviser en deux lots et utiliser un nouveau filtre pour chaque. </li></ol></li><li> Utilisation de la partie de butée d&#39;une seringue de 3 ml appuyez doucement sur ​​la pulpe rouge contenant les cellules restantes à travers le tamis (figure 2B). Assurez-vous d&#39;appuyer sur les deux bas et les côtés filtre pour veiller à ce que toute la pulpe rouge a traversé le filtre (figure 2C). </li><li> Ajouter 10 mlof PBS + 2% à la boîte de culture de tissu et l&#39;utiliser pour laver les lames, seringue bouchon, et le plat pour récupérer toutes les cellules restantes. Passez-la dans le même 70 um tamis cellulaire dans le tube de 50 ml conique. Répétez cette étape si nécessaire. </li><li> Centrifuger la suspension cellulaire filtré à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Décanter délicatement et jeter le surnageant, attention à ne pas perturber le culot. Une quantité de trace de PBS + 2% sera laissé dans le tube. Boucher le tube et feuilleter le culot jusqu&#39;à ce que le culot est remis en suspension complètement. </li><li> Lyse des globules rouges par annonceDing 2 mL de ACK tampon de lyse (0,15 M NH 4 Cl, 1 mM KHCO3, EDTA 0,1 mM, pH 7,2, conserver à 4 ° C) par rate au tube conique et faire pivoter et inverser le tube pour assurer que toutes les cellules entrer en contact avec le tampon ACK. Agitez doucement le tube pendant 1 min à température ambiante. </li><li> Amener le volume de la suspension de cellules à 50 ml par addition de PBS + 2% le tube pour neutraliser le tampon d&#39;accusé de réception. Inverser le tube 10 fois et centrifuger pendant 5 min à 300 g à 4 ° C. Après la centrifugation est terminée, la pastille doit être blanc (figure 3). </li><li> Décanter délicatement et jeter le surnageant, attention à ne pas perturber le culot. Laissez une trace de PBS + 2% dans le tube, fermer le tube, et feuilleter le culot de remettre en suspension. </li><li> Ajouter 10 ml de milieu de cellules T [10% de FBS, 10 mM de HEPES (pH 7,0), 2 mM GlutaMAX, du pyruvate 1 mM de sodium, 1X acides aminés non essentiels, 1 x pénicilline / streptomycine et 50 mM β-mercaptoéthanol], et en outre remettre le culot en douceurpipetage de haut en bas. Puis filtrer la suspension à travers un filtre de 70 um dans un nouveau 50 ml tube conique. </li><li> Utilisez un autre 5-10 ml de milieu de cellules T pour rincer le tube original et passer ce à travers le filtre de 70 um dans le tube contenant le reste des cellules filtrées. Si le traitement de plus de deux rates, le volume de milieu de cellules T peut être augmenté pour maximiser la récupération. </li><li> Gardez cellules sur la glace jusqu&#39;à ce que prêt à être colorés. Les cellules doivent être comptés et la viabilité accessibles. <ol><li> Pour compter les cellules, mélanger 3 ml de cellules avec 24 ml de PBS + 2% et 3 ml de 0,4% de bleu trypan. Charge 10 ml de cette entrée dans chaque chambre d&#39;un hémocytomètre Neubauer amélioré. Viabilité, tel qu&#39;évalué par l&#39;exclusion du bleu trypan, est généralement comprise entre 85-95%. </li></ol></li></ol> 2. Viabilité et coloration de la surface <ol><li> Pellet cellules par centrifugation pendant 10 min à 300 g à 4 ° C. Remettre en suspension les cellules dans un milieu de lymphocytes T à une concentration de 1 x 10 7 cellules / ml. TransfEr 2 millions de cellules (100 ml) dans un puits d&#39;une plaque à 96 puits de culture de tissu à fond en U. </li><li> Centrifuger la plaque de 96 puits pendant 10 min à 300 g à 4 ° C. </li><li> Retirer le surnageant de chaque puits en feuilletant liquide dans la plaque et dans l&#39;évier (le culot cellulaire restera dans le puits) et tamponnant la plaque sur une serviette en papier propre. Laver les cellules en les remettant en suspension dans 200 ul de PBS suivis d&#39;une centrifugation à 300 xg pendant 10 min à 4 ° C. Effectuer tous les lavages de cette façon, sauf indication contraire. Note: Ne pas utiliser PBS + 2% comme il va interférer avec le PI tache réparable. </li><li> Eliminer le surnageant en feuilletant la plaque et ajouter 100 ml de colorant commerciale fraîchement préparé (par exemple, fixable Red Dead tache de cellule) à chaque puits. <ol><li> Faire la tache par dilution de la solution réactive 1:10 colorant dans du DMSO suivi par une dilution 1:10 dans PBS. Incuber la plaque à 4 ° C pendant 30 min à l&#39;abri de la lumière. </li></ol></li><li> Centrifuger le pfin pendant 10 min à 300 g à 4 ° C. A ce point de l&#39;avant, effectuer tous les travaux avec la plaque avec la culture de tissus hotte lumière éteinte. </li><li> Eliminer le surnageant en feuilletant la plaque, puis ajoutez 100 ml de solution de bloc Fc. Préparer une solution de bloc Fc par dilution Fc bloc solution stock 1: 100 dans du PBS. </li><li> Diluer anticorps à utiliser pour la coloration de la surface (par exemple, anti-CD4 ou anti-CD8) dans du PBS et ajouter 100 ml à chaque puits. Incuber la plaque à 96 puits pendant 30 min à 4 ° C à l&#39;abri de la lumière. Remarque: les anticorps de taches de surface devraient être titrés pour des performances optimales. Typiquement utiliser une dilution de 1: 400, selon le protocole du fabricant: 200 ou 1. </li></ol> 3. intracellulaire coloration pour l&#39;histone H3 <ol><li> Après incubation de la tache de surface, laver les cellules deux fois dans PBS. </li><li> Après le dernier lavage, ajouter 100 pi de paraformaldehyde à 4% dans chaque puits. Incuber la plaque à 96 puits pendant 5 min à température ambiante. Assurez paraformaldéhyde 4% par dilutment 16% de paraformaldehyde dans du PBS. Faire de cette nouvelle. </li><li> Laver les cellules deux fois dans PBS. </li><li> Assurez solution Perm / Block (solution mère de Perm est PBS + 2% + 0,02% de Triton X-100, conserver à 4 ° C) en combinant 2 ml de sérum de lapin normal par 100 ml de solution de Perm. Faire assez pour 60 ml / échantillon. </li><li> Ajouter 40 ml Perm / Bloquer pour chaque échantillon et bien mélanger par pipetage de haut en bas, en prenant soin de ne pas faire des bulles. Incuber la plaque à température ambiante pendant 45 min dans l&#39;obscurité. Enregistrer restant Perm / Bloquer pour l&#39;étape 3.6. </li><li> Diluer anticorps conjugué fluorescence Histone H3K4me1 en solution Perm / bloc réservé à l&#39;étape 3.5 et ajouter 10 ul de cette dilution dans chaque puits. Mélanger doucement par pipetage de haut en bas. Incuber la plaque à 96 puits dans l&#39;obscurité pendant 1 h à 4 ° C. Remarque: Utilisez un anticorps H3K4me1 conjugué en utilisant le kit de conjugaison R-phycoérythrine en suivant les instructions du fabricant. </li><li> Laver les cellules deux fois dans du PBS + 2%. </li><li> Reprendre les cellules dans 200pi de PBS + 2% et de transférer les échantillons à tubes FACS pour cytométrie de flux. Les échantillons peuvent être conservés à 4 ° C dans l&#39;obscurité. Pour des résultats optimaux analyser les échantillons un délai de deux jours. Singly échantillons colorés peuvent être utilisés comme la cytométrie de flux contrôles de compensation. </li></ol>

<ol>
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Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrentes.

Nous avons développé un protocole qui permet à l&#39;évaluation de condensation de la chromatine dans les cellules T. Elle repose sur la simple observation que les anticorps histone H3 ne peuvent pas accéder à leurs épitopes facilement dans les cellules naïves, mais lors de l&#39;activation des lymphocytes T, ces mêmes anticorps sont capables de se lier à leurs épitopes. En comparant la coloration MFI de l&#39;histone H3 entre les groupes de traitement, le degré relatif de condensation ou décondensation peut être déterminée. Nous avons utilisé ce protocole pour déterminer l&#39;état de condensation par rapport au cours du développement des thymocytes et pendant l&#39;activation des cellules T 4. Nous avons également utilisé ce protocole pour étudier les mécanismes qui contrôlent le processus de décondensation 5. Ce protocole repose sur l&#39;utilisation d&#39;un anticorps Histone H3 de détecter l&#39;état de condensation de la chromatine. Comme il n&#39;y a pas de changement global dans la modification des histones pendant l&#39;activation des cellules T 4, nous sommes en mesure d&#39;utiliser un anticorps H3K4me1 pour évaluer la chromatinestatut de ce protocole. Nous avons utilisé des anticorps dirigés contre l&#39;histone H3 non modifié; Cependant, le signal produit était beaucoup plus faible en général. Dans notre expérience, des anticorps dirigés contre Histone H3 modifiée fonctionnent mieux en immunofluorescence et la cytométrie de flux essais, tandis que les anticorps contre l&#39;histone H3 non modifié fonctionnent mieux dans Western blot. Il est à noter qu&#39;il est également possible d&#39;utiliser des anticorps dirigés contre d&#39;autres protéines d&#39;histone, mais on n&#39;a pas tenté. Les étapes d&#39;anticorps Perm / bloc et l&#39;histone H3 sont les étapes les plus critiques dans le protocole. La quantité de solution Perm / Bloquer utilisé doit être optimisée à chaque fois la solution mère de Perm est faite. Cela peut être fait en comparant les performances des différentes dilutions de solution de stock. Une expérience typique consiste à comparer l&#39;état de la chromatine dans les cellules T naïves à celles activées pendant 3 heures (Figure 4). On doit choisir la dilution qui produit le plus grand changement dans IMF plusla période de temps analysée. La solution stock peut être dilué dans PBS + 2% pour diminuer Perm / Bloquer force en première remise en suspension des cellules dans la mesure où 100 ml de PBS + 2% après l&#39;étape 3.4 puis en ajoutant le Perm / Bloquer à l&#39;étape 3.5. Une expérience pilote similaire devrait être utilisé pour tester différentes dilutions de l&#39;anticorps conjugué fluorescence histone H3 à chaque fois qu&#39;un nouveau lot d&#39;anticorps est marqué. Ces mesures sont particulièrement critiques pour la réussite de la détection des différences de condensation au début de l&#39;activation des cellules T (par exemple, moins de 3 h d&#39;activation). Parfois, il ya des cellules qui ne reçoivent pas perméabilisée et donc ne tache pas avec l&#39;anticorps histone H3. Cela peut arriver si les cellules ne sont pas bien remis en suspension lors de l&#39;ajout de Perm / Bloquer ou si le Perm / Bloc est pas assez fort. Ces cellules apparaissent comme des événements pressées contre l&#39;axe lors de la visualisation d&#39;un histogramme de l&#39;histone H3 coloration. Depuis ces événements va fausser les IMF générale, ces événements peuvent être exclues de l&#39;analyse par Gating la distribution normale des cellules positives à l&#39;histone H3. Une aide supplémentaire peut être trouvée dans le Guide de dépannage (tableau 1). L&#39;inclusion d&#39;une mort cellulaire tache fixable permet pour l&#39;évaluation de la viabilité des cellules dans le dosage. Ceci est absolument essentiel lors de la manipulation activation des cellules T car certains stimuli peuvent induire la mort cellulaire. Dans un tel cas, l&#39;anticorps peut se lier histone H3 histones dans les cellules mortes différemment que les cellules vivantes, conduisant à une mauvaise interprétation des résultats. Ce protocole est conçu pour une utilisation en format plaque de 96 puits, permettant une analyse à haut débit de l&#39;état de la chromatine. Une rate d&#39;un vieux 6-8 semaines souris femelle donne habituellement entre 60 à 90.000.000 cellules en utilisant le protocole. Depuis le protocole de coloration nécessite 2 millions de cellules par échantillon, on peut facilement doser plusieurs groupes de traitement et des points de temps en triple exemplaire, avec une seule rate sur une plaque de 96 puits unique. Il est possible de pperformance des services de protocole avec moins de cellules par échantillon; Toutefois, en raison du nombre d&#39;étapes de centrifugation et la perte inhérente de cellules à chacune de ces étapes, il est déconseillé de réduire le nombre de cellules par beaucoup. Nous avons complété avec succès le protocole avec 1 million de cellules par échantillon. Nous avons utilisé ce protocole pour examiner l&#39;état de la chromatine dans les cellules T helper CD4 + et CD8 + T cytotoxiques. Ceci est rendu possible parce que le protocole comprend une coloration de surface standard. Le protocole peut être facilement adapté à l&#39;examen de la chromatine dans d&#39;autres sous-populations lymphocytaires contre en utilisant des anticorps marqueurs de surface spécifiques aux populations. Ce protocole pourrait aussi facilement être adapté à d&#39;autres types de cellules tant que des anticorps reconnaissant des marqueurs de surface pertinents sont les conditions de fixation / perméabilisation disponibles et appropriées sont connus.

La cytométrie en flux est une technologie à base de laser mis au point pour l&#39;analyse de plusieurs paramètres physiques et fluorescents dans des populations de cellules. Cette technologie fonctionne en tant que cellules en suspension dans un courant de fluide rencontre un laser, des marqueurs fluorescents intéressants sur ou à l&#39;intérieur des cellules. Ces marqueurs puis émettent de la lumière qui est détectée et quantifiée par des tubes photomultiplicateurs. Bien que la cytométrie en flux a été utilisée traditionnellement pour identifier les populations de cellules, il est avéré être une technologie utile lorsque l&#39;on étudie une gamme de propriétés de cellule, y compris l&#39;intégrité de la membrane cellulaire, interactions protéine-protéine et protéine trafic 3/1. Nous avons mis au point un protocole qui permet à cette technologie à être utilisé pour détecter l&#39;état de la chromatine dans les cellules T sont activées en tant in vitro 4. Nous avons également utilisé ce protocole pour étudier le mécanisme d&#39;activation induite-décondensation de chromatine des cellules T 5. T activatio cellulairen et la prolifération sont essentiels pour une réponse immunitaire appropriée. Lymphocytes T, un sous-ensemble spécifique des lymphocytes du système immunitaire, sont nécessaires pour des réponses immunitaires appropriées et le développement de la mémoire immunologique. L&#39;activation est déclenchée lorsqu&#39;un antigène est présenté dans le contexte du complexe majeur d&#39;compatibilité pour le récepteur des cellules T (TCR) situé sur la surface extracellulaire des cellules T quiescentes (revue dans 6). Ceci déclenche une série d&#39;événements moléculaires dynamiques et hautement ordonnées au sein de cellules T qui aboutissent à une augmentation de la concentration intracellulaire de Ca2 + 7 et la translocation nucléaire de facteurs de transcription requis pour l&#39;activation (revue dans 10/08). Une fois activées, les cellules T acquièrent la capacité de répondre à l&#39;interleukine-2 (IL-2), un facteur de croissance puissant qui utilise la JAK (Janus Kinase) / STAT (Signal Transducer et activateur de la transcription) voie pour entraîner la prolifération clonale de T activée, 11 cellules. En bref, la stimulation d&#39;IL-2se traduit par la phosphorylation de protéines STAT, une famille de facteurs de transcription cytosoliques latente. Une fois phosphorylé, protéines STAT dimérisent, une translocation vers le noyau et commander l&#39;expression de gènes, y compris ceux qui sont impliqués dans la progression du cycle cellulaire. Dans les cellules T, IL-2 par l&#39;intermédiaire de signaux STAT5, qui est nécessaire pour la prolifération des cellules T 12,13. Afin de parvenir à l&#39;expansion clonale de cellules T activées, les cellules qui ont subi engagement antigène non-TCR (cellules T naïves), doivent avoir un mécanisme pour ignorer les effets puissants de l&#39;IL-2. Ceci est réalisé par l&#39;intermédiaire de la régulation de l&#39;état de la chromatine. Lymphocytes T naïfs possèdent une chromatine condensée qui interdit l&#39;engagement STAT5-ADN en réponse à la stimulation d&#39;IL-2. Lors de l&#39;activation, decondenses chromatine et STAT5 peuvent accéder aux promoteurs de gènes cibles, permettant prolifération clonale 4. Fait intéressant, ce changement de statut de la chromatine ne dépend pas de modification épigénétique de l&#39;histone proteins (pour revue, voir 14) que nous avons observé aucun changement global dans la modification des histones pendant l&#39;activation des cellules T 4. Alors que de réaliser ces études, nous avons découvert que des anticorps dirigés contre des protéines histones ont également eu des difficultés à accéder à leurs épitopes dans des cellules naïves, mais que lors de l&#39;activation pourrions plus facilement lier leurs épitopes 4. Ainsi, la liaison à l&#39;anticorps histones sert une lecture pour le statut de condensation de la chromatine. Nous présentons ici la méthode à utiliser la cytométrie en flux pour détecter les anticorps histone H3 fluorescence conjugués afin d&#39;évaluer l&#39;état de la chromatine dans les cellules T. Condensation de la chromatine dans une population de cellules est mesurée par l&#39;intensité de fluorescence moyenne (MFI) de l&#39;histone H3 coloration. Dans le cadre de l&#39;activation des cellules T, le MFI de l&#39;histone H3 coloration augmente, signifiant la décondensation de chromatine. En plus de mesurer l&#39;état de la chromatine par coloration intracellulaire histone H3, ce protocole INCORPORA aussiTES surface coloration et une tache réparable pour les cellules vivantes, permettant l&#39;analyse des sous-populations de cellules.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:584px;" width="585">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">100mm tissue culture dish</td>
			<td style="width:83px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Precleaned frosted microscope slides</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sterile cell strainer, 70mm nylon mesh</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">3mL syringe, Luer-Lok tip</td>
			<td style="width:83px;">BD</td>
			<td>309585</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Falcon 50mL polypropylene conical tube</td>
			<td style="width:83px;">Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">LIVE/DEAD fixable red dead cell stain kit</td>
			<td style="width:83px;">Life Technologies</td>
			<td>L23102</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies sells versions of this kit with different colors</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Fc Block</td>
			<td style="width:83px;">BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">16% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:83px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Normal rabbit serum</td>
			<td style="width:83px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">R9133</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Anti-H3K4me1 antibody</td>
			<td style="width:83px;">Abcam</td>
			<td>ab8895</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">R-Phycoerythrin conjugation kit</td>
			<td style="width:83px;">Abcam</td>
			<td>ab102919</td>
			<td style="width:167px;">Alternatively, the LYNX rapid RPE kit from AbD Serotec can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of flow cytometry to assess the state of chromatin in t cells

Au cours d&#39;une réponse immunitaire appropriée, les cellules T quiescentes sont activées lors de la présentation des antigènes à leur récepteur des cellules T spécifique d&#39;un antigène. Cela conduit à une prolifération clonale de ces cellules T seules qui portent un récepteur qui reconnaît l&#39;antigène. Décondensation de la chromatine est une caractéristique de l&#39;activation des cellules T et est nécessaire pour les cellules T d&#39;acquérir la capacité à proliférer après l&#39;engagement de l&#39;antigène. Ce changement de condensation de la chromatine peut être détectée en utilisant des anticorps dirigés contre des protéines histones. Ces anticorps ne peuvent pas se lier à leurs épitopes dans des cellules T naïves ainsi comme ils peuvent dans les cellules T activées. Nous décrivons comment tache simultanément des marqueurs de surface spécifiques des cellules T, avec une piste viabilité morts tache cellulaire réparable, et de mesurer l&#39;état de la chromatine par coloration intracellulaire des protéines histone H3. Les cellules colorées sont analysées par cytométrie en flux et l&#39;état de condensation de la chromatine est mesurée en tant que l&#39;intensité de fluorescence moyenne (MFI) de la tache Histone H3. Chromaten cours de décondensation activation des cellules T comme le montre une augmentation du MFI

Les lymphocytes provenant d&#39;un C57B / 6 souris ont été traitées dans une suspension de cellules isolées selon le protocole et comptées en utilisant un hémocytomètre standard. Les cellules ont été ensemencées en triple à 2 x 10 6 / ml dans un milieu de lymphocytes T dans 15 ml tubes coniques et laissées non traitées ou stimulées avec 1 mg / anticorps anti-CD3 solubles ml (clone 4C11) pendant 3 heures à 37 ° C dans un incubateur de culture de tissu standard. Les cellules mortes ont été colorées et cellules ont ensuite été surface colorées en utilisant des anticorps FITC-CD8 et APC-CD4 selon le protocole. Histone accessibilité a été analysée par cytométrie de flux (figure 4). Dans les deux cellules naïves CD4 + et CD8 + T, l&#39;intensité de fluorescence moyenne (MFI) est faible, ce qui signifie un état ​​chromatine condensée. Comme les cellules sont activées par des anticorps anti-CD3 les augmentations des IFM de manière significative (p &lt;0,001, test t de Student) indiquant que la chromatine a décondensée. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig1.jpg" /> Figure 1. Technique pour le traitement de la rate dans une suspension cellulaire unique en utilisant des lames de microscope givrées. (A) La rate est pressée contre les surfaces dépolies de deux lames de microscope. (B) Les lames sont déplacés d&#39;avant en arrière les uns contre les autres lymphocytes libérant dans un plat Petri 100 mm jusqu&#39;à ce que les restes de la rate sont blancs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53533/53533fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig2.jpg" /> Figure 2. Utilisation d&#39;un bouchon de la seringue pour appuyer restant pulpe rouge à travers un tamis cellulaire de 70 mm. (A) pulpe rouge restant après une rate i<html> s transformé en une suspension de cellules isolées et passé à travers le tamis cellulaire de 70 mm. (B) La partie de butée d&#39;une seringue de 3 ml est utilisée pour appuyer doucement sur ​​restante pulpe rouge à travers le tamis de la cellule. (C) Après l&#39;utilisation de la seringue, il devrait y avoir pratiquement aucune pulpe rouge à gauche dans le tamis cellulaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53533/53533fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig3.jpg" /> Figure 3. ACK lyse des globules rouges. (A) La centrifugation d&#39;une suspension de cellule unique produite à partir de la rate de souris unique avant la lyse ACK. (B) Après lyse ACK de globules rouges, le culot cellulaire doit être blanc.obtenir = &quot;_ blank&quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig4.jpg" /> Figure 4. Les résultats représentatifs du protocole. Schéma (A) entrée sont utilisés pour analyser l&#39;état de la chromatine dans les lymphocytes T CD4 +. (B et C) des cellules T ont été laissées non traitées ou activées avec 1 mg / anticorps anti-CD3 solubles ml pendant 3 heures (en triple). Les cellules ont ensuite été analysées par cytométrie de flux pour déterminer la condensation de la chromatine dans les cellules CD4 + (B) et des cellules CD8 + (C). Les données sont la moyenne ± écart-type de l&#39;intensité de fluorescence moyenne de H3K4me1 coloration. * p &lt;0,001 (test t de Student) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53533/53533fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer h</a>avant pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/53533/53533table1.jpg" /> Tableau 1:. Guide de dépannage Une référence rapide aux problèmes communs et des solutions possibles.

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The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

L&#39;utilisation de la cytométrie de flux pour évaluer l&#39;état de la chromatine dans les cellules T

La cytométrie en flux peut être utilisé pour évaluer l&#39;état de la chromatine dans les cellules T. Ce protocole permet d&#39;interpréter des preuves scientifiques de décondensation de la chromatine au cours de l&#39;activation des cellules T démontrée par une augmentation de l&#39;intensité de fluorescence moyenne (MFI) de l&#39;histone H3 anticorps fluorescents

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

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