Name: the use of flow cytometry to assess the state of chromatin in t cells
Uploaded: 2015-12-17T14:00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells at JoVE.com

इस परियोजना को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (5 P20 RR016461 और 8 P20 GM103499) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया, राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (ईपीएस-0,903,795)। Furman विश्वविद्यालय के अनुसंधान और पेशेवर विकास और Furman लाभ पुरस्कार से आगे समर्थन करते हैं।

<ol>
	<li>Bravo-Ferrada, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+surface+damage+on+cell+envelope+assesed+by+afm+and+flow+cytometry+of+lactobacillus+plantarum+exposed+to+ethanol+and+dehydration.">Study of surface damage on cell envelope assesed by afm and flow cytometry of lactobacillus plantarum exposed to ethanol and dehydration.</a> J Appl Microbiol. , (2015).</li><li>Agola, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Bead-Based+Flow+Cytometry+for+Assaying+Rab7+GTPase+Interaction+with+the+Rab-Interacting+Lysosomal+Protein+(RILP)+Effector+Protein.">Quantitative Bead-Based Flow Cytometry for Assaying Rab7 GTPase Interaction with the Rab-Interacting Lysosomal Protein (RILP) Effector Protein.</a> Methods Mol Biol. 1298, 331-354 (2015).</li><li>Toh, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+flow+cytometry+to+analyze+intracellular+location+and+trafficking+of+cargo+in+cell+populations.">Application of flow cytometry to analyze intracellular location and trafficking of cargo in cell populations.</a> Methods Mol Biol. 1270, 227-238 (2015).</li><li>Rawlings, J. S., Gatzka, M., Thomas, P. G., Ihle, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+condensation+via+the+condensin+II+complex+is+required+for+peripheral+T-cell+quiescence.">Chromatin condensation via the condensin II complex is required for peripheral T-cell quiescence.</a> EMBO J. 30, 263-276 (2011).</li><li>Lee, M. D., Bingham, K. N., Mitchell, T. Y., Meredith, J. L., Rawlings, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+mobilization+is+both+required+and+sufficient+for+initiating+chromatin+decondensation+during+activation+of+peripheral+T-cells.">Calcium mobilization is both required and sufficient for initiating chromatin decondensation during activation of peripheral T-cells.</a> Mol Immunol. 63, 540-549 (2015).</li><li>Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamental immunology. , (2013).</li><li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling+in+lymphocyte+activation+and+disease.">Calcium signalling in lymphocyte activation and disease.</a> Nat Rev Immunol. 7, 690-702 (2007).</li><li>Isakov, N., Altman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C(theta)+in+T+cell+activation.">Protein kinase C(theta) in T cell activation.</a> Annu Rev Immunol. 20, 761-794 (2002).</li><li>Macian, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NFAT+proteins:+key+regulators+of+T-cell+development+and+function.">NFAT proteins: key regulators of T-cell development and function.</a> Nat Rev Immunol. 5, 472-484 (2005).</li><li>Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+by+calcium,+calcineurin+and+NFAT.">Transcriptional regulation by calcium, calcineurin and NFAT.</a> Genes Dev. 17, 2205-2232 (2003).</li><li>Rawlings, J. S., Rosler, K. M., Harrison, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK/STAT+signaling+pathway.">The JAK/STAT signaling pathway.</a> J Cell Sci. 117, 1281-1283 (2004).</li><li>Ihle, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STATs:+signal+transducers+and+activators+of+transcription.">STATs: signal transducers and activators of transcription.</a> Cell. 84, 331-334 (1996).</li><li>Moriggl, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stat5+is+required+for+IL-2-induced+cell+cycle+progression+of+peripheral+T+cells.">Stat5 is required for IL-2-induced cell cycle progression of peripheral T cells.</a> Immunity. 10, 249-259 (1999).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+and+their+function.">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li></ol>

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा।

हम टी कोशिकाओं में क्रोमेटिन संक्षेपण के आकलन के लिए अनुमति देता है कि एक प्रोटोकॉल विकसित की है। यह histone H3 एंटीबॉडी भोले कोशिकाओं में आसानी से उनकी एपिटोप्स का उपयोग नहीं कर सकते हैं कि साधारण अवलोकन पर निर्भर करता है, लेकिन टी सेल सक्रियण पर, ये वही एंटीबॉडी उनकी एपिटोप्स के लिए बाध्य करने में सक्षम हैं। उपचार समूहों के बीच एमएफआई histone H3 का धुंधला की तुलना करके, संक्षेपण या decondensation के रिश्तेदार डिग्री निर्धारित किया जा सकता है। हम thymocyte विकास के दौरान और टी सेल सक्रियण 4 के दौरान रिश्तेदार संक्षेपण स्थिति का निर्धारण करने के लिए इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है। हम यह भी decondensation प्रक्रिया 5 कि नियंत्रण तंत्र की जांच करने के लिए इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है। इस प्रोटोकॉल क्रोमेटिन संक्षेपण स्थिति का पता लगाने के लिए एक histone H3 एंटीबॉडी के उपयोग पर निर्भर करता है। टी सेल सक्रियण 4 के दौरान हिस्टोन संशोधन में कोई वैश्विक परिवर्तन होता है के बाद से, हम क्रोमेटिन का आकलन करने के लिए एक H3K4me1 एंटीबॉडी का उपयोग करने में सक्षम हैंइस प्रोटोकॉल में स्थिति। हम असंशोधित histone H3 के खिलाफ उठाया एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया है; हालांकि, उत्पादन संकेत काफी कमजोर समग्र था। असंशोधित histone H3 के खिलाफ एंटीबॉडी पश्चिमी धब्बा में बेहतर काम करते हुए हमारे अनुभव में, संशोधित histone H3 के खिलाफ उठाया एंटीबॉडी, इम्यूनोफ्लोरेसेंस में बेहतर काम करते हैं और cytometry assays के प्रवाह। यह है कि हम यह प्रयास नहीं किया है, हालांकि यह भी अन्य हिस्टोन प्रोटीन के खिलाफ उठाया एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए संभव है कि ध्यान दिया जाना चाहिए। पेर्म / ब्लॉक और हिस्टोन H3 एंटीबॉडी कदम प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। इस्तेमाल किया पेर्म / ब्लॉक समाधान की राशि शेयर पेर्म समाधान किया जाता है हर बार अनुकूलित किया जाना चाहिए। इस शेयर के समाधान के विभिन्न dilutions के प्रदर्शन की तुलना द्वारा किया जा सकता है। एक ठेठ प्रयोग 3 घंटा (चित्रा 4) के लिए सक्रिय उन लोगों के लिए भोले टी कोशिकाओं में क्रोमेटिन स्थिति की तुलना करना शामिल है। एक से अधिक एमएफआई में सबसे बड़ा परिवर्तन है कि उत्पादन के कमजोर पड़ने का चयन करना चाहिएसमय अवधि का विश्लेषण किया। शेयर समाधान पहले 3.5 चरण में पेर्म / ब्लॉक जोड़ने तो 3.4 कदम के बाद के रूप में ज्यादा एमएल 100 के रूप में पीबीएस + 2% में कोशिकाओं resuspending और से पेर्म / ब्लॉक ताकत कम करने के लिए पीबीएस + 2% में पतला किया जा सकता। इसी तरह का एक पायलट प्रयोग fluorescently संयुग्मित histone H3 एंटीबॉडी के एंटीबॉडी का एक नया बैच लेबल है हर बार अलग dilutions के परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। ये कदम (सक्रियण के 3 घंटा के भीतर, उदाहरण के लिए) जल्दी टी सेल सक्रियण में संक्षेपण मतभेदों के सफल का पता लगाने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं। कभी कभी, histone H3 एंटीबॉडी के साथ दाग नहीं होगा, इस प्रकार permeabilized पाने के लिए और नहीं है कि कोशिकाओं रहे हैं। इस पेर्म / ब्लॉक जोड़ने जब कोशिकाओं में अच्छी तरह से resuspended नहीं कर रहे हैं तो क्या कर सकते हैं या पेर्म / ब्लॉक पर्याप्त मजबूत नहीं है। इन कोशिकाओं को histone H3 धुंधला की एक हिस्टोग्राम visualizing जब अक्ष के खिलाफ लगाए घटनाओं के रूप में दिखाई देंगे। समग्र एमएफआई तिरछा जाएगा कि इन घटनाओं के बाद से, इन घटनाओं gatin द्वारा विश्लेषण से छोड़ा जा सकता हैजी histone H3 सकारात्मक कोशिकाओं की सामान्य वितरण। अतिरिक्त सहायता समस्या निवारण गाइड (1 टेबल) में पाया जा सकता है। एक फिक्स मृत सेल दाग का समावेश परख में सेल व्यवहार्यता का आकलन के लिए अनुमति देता है। कुछ उत्तेजनाओं कोशिका मृत्यु को उत्पन्न कर सकते हैं क्योंकि टी सेल सक्रियण में हेर-फेर करते हैं तो यह पूरी तरह से गंभीर है। ऐसे एक मामले में, हिस्टोन H3 एंटीबॉडी परिणामों की गलत व्याख्या करने के लिए अग्रणी, जीवित कोशिकाओं की तुलना में अलग मृत कोशिकाओं में histones बाध्य कर सकते हैं। इस प्रोटोकॉल क्रोमेटिन स्थिति का एक उच्च throughput विश्लेषण की अनुमति, 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप में इस्तेमाल के लिए बनाया गया है। एक 6-8 सप्ताह पुराने महिला माउस से एक तिल्ली आम तौर पर प्रोटोकॉल का उपयोग 60-90,000,000 बीच कोशिकाओं निकलेगा। धुंधला प्रोटोकॉल नमूना प्रति 2 मिलियन कोशिकाओं की आवश्यकता है, एक बड़ी आसानी से एक भी 96 अच्छी तरह से थाली पर एक भी तिल्ली के साथ तीन प्रतियों में कई उपचार समूहों और समय अंक परख सकते हैं। यह पी के लिए संभव हैनमूना प्रति कम कोशिकाओं के साथ प्रोटोकॉल erform; बहरहाल, कारण centrifugation कदम की संख्या और इनमें से प्रत्येक चरण में कोशिकाओं के निहित घटाने के लिए, यह बहुत से कोशिकाओं की संख्या कम करने के लिए उचित नहीं है। हम सफलतापूर्वक नमूना प्रति 1 लाख कोशिकाओं के साथ प्रोटोकॉल पूरा कर लिया है। हम सीडी 4+ टी सहायक कोशिकाओं और सीडी 8 + साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं में क्रोमेटिन स्थिति की जांच करने के लिए इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया। प्रोटोकॉल मानक सतह धुंधला भी शामिल है क्योंकि यह संभव बनाया है। प्रोटोकॉल को आसानी से जनसंख्या-विशिष्ट सतह मार्कर के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करके अन्य लिम्फोसाइट उप-जनसंख्या में क्रोमेटिन की परीक्षा के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल भी आसानी से प्रासंगिक सतह मार्कर पहचानने एंटीबॉडी के रूप में इतने लंबे समय के अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए उपलब्ध है और उचित निर्धारण / permeabilization की स्थिति में जाना जाता हैं अनुकूलित किया जा सकता है।

प्रवाह cytometry सेल आबादी में कई शारीरिक और फ्लोरोसेंट मापदंडों का विश्लेषण के लिए विकसित किया गया एक लेजर आधारित तकनीक है। इस तकनीक पर या कोशिकाओं के भीतर तरल पदार्थ मुठभेड़ की एक धारा में निलंबित कर दिया कोशिकाओं के रूप में एक लेजर, रोमांचक फ्लोरोसेंट मार्करों काम करता है। इन मार्करों तो पता चला और photomultiplier ट्यूब द्वारा मात्रा निर्धारित है कि प्रकाश का उत्सर्जन। फ्लो का पारंपरिक रूप से कोशिकाओं की आबादी की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, यह कोशिका झिल्ली अखंडता, प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत और प्रोटीन की तस्करी 1-3 सहित सेल संपत्तियों की एक सरणी का अध्ययन करते समय एक उपयोगी प्रौद्योगिकी साबित हो गया है। हम इस तकनीक वे इन विट्रो 4 में सक्रिय कर रहे हैं के रूप में टी कोशिकाओं में क्रोमेटिन की स्थिति का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा करने की अनुमति देता है कि एक प्रोटोकॉल विकसित किया है। हम यह भी टी कोशिकाओं 5 की सक्रियता को प्रेरित क्रोमेटिन decondensation के तंत्र की जांच करने के लिए इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है। टी सेल activation और प्रसार के लिए एक उचित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए महत्वपूर्ण हैं। टी कोशिकाओं, प्रतिरक्षा प्रणाली के भीतर लिम्फोसाइटों के एक विशिष्ट सबसेट, उचित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और प्रतिरक्षाविज्ञानी स्मृति के विकास के लिए आवश्यक हैं। एक प्रतिजन (6 में समीक्षा) मौन टी कोशिकाओं की बाह्य सतह पर स्थित टी सेल रिसेप्टर (TCR) को प्रमुख अनुकूलता परिसर के संदर्भ में प्रस्तुत किया जाता है जब एक्टिवेशन शुरू की है। इस इंट्रासेल्युलर सीए 2 + एकाग्रता 7 और (8-10 में समीक्षा) क्रियान्वयन के लिए आवश्यक प्रतिलेखन कारक के परमाणु translocation में वृद्धि में culminate कि टी कोशिकाओं के भीतर गतिशील और अत्यधिक आदेश दिया आणविक घटनाओं की एक श्रृंखला चलाता है। एक बार, टी कोशिकाओं इंटरल्यूकिन -2 (आईएल -2), जे ए (जानूस Kinase) / स्टेट इस्तेमाल करता है कि एक शक्तिशाली वृद्धि कारक के लिए प्रतिक्रिया करने की क्षमता हासिल सक्रिय (सिग्नल ट्रांसड्यूसर और ट्रांसक्रिप्शन का उत्प्रेरक) मार्ग सक्रिय टी का प्रतिरूप प्रसार करने के लिए ड्राइव 11 कोशिकाओं। संक्षेप में, आईएल -2 उत्तेजनास्टेट प्रोटीन, अव्यक्त साइटोसोलिक प्रतिलेखन कारकों में से एक परिवार के फोस्फोराइलेशन में परिणाम है। फॉस्फोरिलेटेड एक बार, स्टेट प्रोटीन dimerize, नाभिक को सरकाना और कोशिका चक्र प्रगति में शामिल लोगों सहित जीनों की अभिव्यक्ति ड्राइव। टी कोशिकाओं में, टी सेल प्रसार 12,13 के लिए आवश्यक है, जो STAT5, के माध्यम से आईएल -2 का संकेत है। सक्रिय टी कोशिकाओं का प्रतिरूप विस्तार को प्राप्त करने के लिए, प्रतिजन TCR सगाई (भोले टी कोशिकाओं) का अनुभव नहीं है कि उन कोशिकाओं, आईएल -2 के शक्तिशाली प्रभाव की अनदेखी करने के लिए एक तंत्र होना चाहिए। इस क्रोमेटिन स्थिति के विनियमन के माध्यम से हासिल की है। भोले टी कोशिकाओं आईएल -2 उत्तेजना के जवाब में STAT5 डीएनए सगाई पर प्रतिबंध लगाता है कि एक गाढ़ा क्रोमेटिन के पास है। सक्रियण पर, क्रोमेटिन decondenses और STAT5 क्लोनल प्रसार 4 की अनुमति, लक्ष्य जीन के प्रमोटरों का उपयोग कर सकते हैं। दिलचस्प बात यह है क्रोमेटिन स्थिति में इस परिवर्तन हिस्टोन protei की epigenetic संशोधन पर निर्भर नहीं हैएनएस (समीक्षा के लिए, 14 देखें) हम टी सेल सक्रियण 4 के दौरान हिस्टोन संशोधन में कोई वैश्विक परिवर्तन के रूप में मनाया। इन अध्ययनों प्रदर्शन करते हुए, हम हिस्टोन प्रोटीन के खिलाफ उठाया एंटीबॉडी भी भोले कोशिकाओं में उनके एपिटोप्स पहुँचने मुश्किल था कि पता चला है, लेकिन सक्रियण पर कि और अधिक आसानी से उनकी एपिटोप्स 4 बाध्य कर सके। इस प्रकार, histones के लिए बाध्य एंटीबॉडी क्रोमेटिन संक्षेपण की स्थिति के लिए एक readout के रूप में कार्य करता है। यहाँ हम विधि टी कोशिकाओं में क्रोमेटिन स्थिति का आकलन करने के क्रम में fluorescently संयुग्मित histone H3 एंटीबॉडी का पता लगाने के प्रवाह cytometry का उपयोग करने के लिए उपस्थित थे। कोशिकाओं की आबादी में chromatin संघनन histone H3 धुंधला का मतलब पुष्पन तीव्रता (एमएफआई) के रूप में मापा जाता है। क्रोमेटिन की decondensation वाचक टी सेल सक्रियण, हिस्टोन H3 धुंधला बढ़ जाती है की एमएफआई, के संदर्भ में। इंट्रासेल्युलर histone H3 धुंधला के माध्यम से क्रोमेटिन स्थिति को मापने के अलावा, इस प्रोटोकॉल भी incorporaटीईएस कोशिकाओं के उप-जनसंख्या के विश्लेषण की अनुमति, धुंधला हो जाना और जीवित कोशिकाओं के लिए एक फिक्स दाग सतह।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:584px;" width="585">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">100mm tissue culture dish</td>
			<td style="width:83px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Precleaned frosted microscope slides</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sterile cell strainer, 70mm nylon mesh</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">3mL syringe, Luer-Lok tip</td>
			<td style="width:83px;">BD</td>
			<td>309585</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Falcon 50mL polypropylene conical tube</td>
			<td style="width:83px;">Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">LIVE/DEAD fixable red dead cell stain kit</td>
			<td style="width:83px;">Life Technologies</td>
			<td>L23102</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies sells versions of this kit with different colors</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Fc Block</td>
			<td style="width:83px;">BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">16% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:83px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Normal rabbit serum</td>
			<td style="width:83px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">R9133</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Anti-H3K4me1 antibody</td>
			<td style="width:83px;">Abcam</td>
			<td>ab8895</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">R-Phycoerythrin conjugation kit</td>
			<td style="width:83px;">Abcam</td>
			<td>ab102919</td>
			<td style="width:167px;">Alternatively, the LYNX rapid RPE kit from AbD Serotec can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of flow cytometry to assess the state of chromatin in t cells

एक उचित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के दौरान मौन टी कोशिकाओं को उनके विशिष्ट प्रतिजन टी सेल रिसेप्टर को प्रतिजन प्रस्तुति पर सक्रिय हो जाते हैं। इस प्रतिजन पहचानता है कि एक रिसेप्टर सहन कि केवल उन टी कोशिकाओं के प्रतिरूप प्रसार की ओर जाता है। क्रोमेटिन decondensation टी सेल सक्रियण की एक बानगी है और टी कोशिकाओं प्रतिजन सगाई के बाद पैदा करना करने की क्षमता हासिल करने के लिए आवश्यक है। क्रोमेटिन संक्षेपण में यह परिवर्तन हिस्टोन प्रोटीन के खिलाफ उठाया एंटीबॉडी का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है। ये एंटीबॉडी सक्रिय टी कोशिकाओं में के रूप में अच्छी तरह से वे कर सकते हैं भोले टी कोशिकाओं में उनकी एपिटोप्स करने के लिए बाध्य नहीं कर सकते। हम एक साथ एक फिक्स मृत सेल दाग के साथ टी सेल विशिष्ट सतह मार्कर, ट्रैक व्यवहार्यता दाग, और हिस्टोन H3 प्रोटीन के intracellular धुंधला के माध्यम से क्रोमेटिन स्थिति को मापने के लिए कैसे का वर्णन है। दाग कोशिकाओं प्रवाह cytometry से विश्लेषण कर रहे हैं और क्रोमेटिन संक्षेपण स्थिति histone H3 दाग का मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) के रूप में मापा जाता है। Chromatटी सेल सक्रियण के दौरान decondensation में एमएफआई में वृद्धि के रूप में प्रदर्शन किया है

एक C57B / 6 माउस से लिम्फोसाइटों प्रोटोकॉल के अनुसार एक एकल कक्ष निलंबन में कार्रवाई की और एक मानक hemocytometer गिनती का उपयोग कर रहे थे। कोशिकाओं 2 एक्स 10 टी सेल मीडिया में 6 मिलीग्राम / 15 में मिलीलीटर में तीन प्रतियों में शंक्वाकार ट्यूबों वरीयता प्राप्त और इलाज छोड़ दिया, या में 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए 1 मिलीग्राम / एमएल घुलनशील विरोधी CD3 एंटीबॉडी (क्लोन 4C11) साथ प्रेरित किया गया एक मानक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर। मृत कोशिकाओं दाग थे और फिर कोशिकाओं तो प्रोटोकॉल के अनुसार FITC-सीडी 8 और एपीसी-सीडी 4 एंटीबॉडी का उपयोग दाग सतह थे। हिस्टोन पहुंच फ्लो (चित्रा 4) के माध्यम से विश्लेषण किया गया था। दोनों भोले सीडी 4 + और ​​CD8 + टी कोशिकाओं में, मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता (एमएफआई) एक संक्षिप्त क्रोमेटिन राज्य वाचक, कम है। कोशिकाओं विरोधी CD3 के साथ सक्रिय कर रहे हैं जैसा कि क्रोमेटिन decondensed है कि यह दर्शाता (पी &lt;0.001, छात्र टी परीक्षण) काफी एमएफआई बढ़ जाती है एंटीबॉडी। <img alt="आकृति 1" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig1.jpg" /> तुहिनाच्छादित खुर्दबीन स्लाइड का उपयोग कर एक एकल कक्ष निलंबन में spleens प्रसंस्करण के लिए चित्रा 1. तकनीक। (ए) तिल्ली दो माइक्रोस्कोप स्लाइड के तुहिनाच्छादित सतहों के खिलाफ दबाया जाता है। (बी) स्लाइड तिल्ली के अवशेष सफेद होते हैं जब तक एक 100 मिमी पेट्री डिश में आगे और पीछे एक दूसरे को रिहा लिम्फोसाइटों के खिलाफ चले गए हैं। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53533/53533fig1large.jpg" target="_blank">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a> <img alt="चित्र 2" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig2.jpg" /> एक तिल्ली के बाद शेष एक 70 मिमी सेल झरनी के माध्यम से लाल रंग का गूदा शेष प्रेस करने के लिए एक सिरिंज डाट का प्रयोग चित्रा 2। (ए) लाल रंग का गूदा मैं<html> एक एकल कक्ष निलंबन में कार्रवाई की और 70 मिमी सेल झरनी के माध्यम से पारित कर दिया है। (बी) के एक 3 मिलीलीटर सिरिंज की डाट भाग धीरे सेल झरनी के माध्यम से लाल रंग का गूदा शेष प्रेस करने के लिए प्रयोग किया जाता है। (सी) सिरिंज का उपयोग करने के बाद, लगभग सेल झरनी में छोड़ कोई लाल गूदा होना चाहिए। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53533/53533fig2large.jpg" target="_blank">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a> <img alt="चित्र तीन" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig3.jpg" /> लाल रक्त कोशिकाओं की चित्रा 3. एसीके सेल। सेल एसीके करने से पहले एक माउस तिल्ली से उत्पन्न एक एकल कक्ष निलंबन की (ए) केन्द्रापसारण। (बी) लाल रक्त कोशिकाओं के एसीके सेल के बाद, सेल गोली सफेद होना चाहिए।= &quot;_blank&quot; मिल&gt; यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। <img alt="चित्रा 4" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig4.jpg" /> चित्रा प्रोटोकॉल 4. प्रतिनिधि परिणाम है। (ए) Gating योजना सीडी 4+ टी lymphocytes में क्रोमेटिन स्थिति का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है। (बी और सी) टी कोशिकाओं अनुपचारित छोड़ दिया है या (तीन प्रतियों में) 3 घंटे के लिए 1 मिलीग्राम / एमएल घुलनशील विरोधी CD3 एंटीबॉडी के साथ सक्रिय थे। कोशिकाओं तो सीडी 4 + कोशिकाओं (बी) और सीडी 8 + कोशिकाओं (सी) में क्रोमेटिन संक्षेपण निर्धारित करने के लिए प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया। डेटा H3K4me1 धुंधला का मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता का मानक विचलन ± साधन हैं। * पी &lt;0.001 (छात्र टी परीक्षण) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53533/53533fig4large.jpg" target="_blank">ज क्लिक करें</a>अरे यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए। <img alt="तालिका एक" src="/files/ftp_upload/53533/53533table1.jpg" /> तालिका 1:। समस्या निवारण गाइड आम मुद्दों और संभावित समाधान के लिए एक त्वरित संदर्भ।

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The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

फ्लो का उपयोग टी कोशिकाओं में chromatin की स्थिति का आकलन करने के लिए

प्रवाह cytometry टी कोशिकाओं के भीतर क्रोमेटिन की स्थिति का आकलन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल वैज्ञानिकों फ्लोरोसेंट histone H3 एंटीबॉडी का मतलब पुष्पन तीव्रता (एमएफआई) में वृद्धि के द्वारा प्रदर्शन किया टी सेल सक्रियण के दौरान क्रोमेटिन decondensation के सबूत की व्याख्या करने की अनुमति देता है

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

घायल प्रवाह cytometry द्वारा स्पाइनल कॉर्ड ऊतक में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के मात्रात्मक मूल्यांकन: एक सेल शोधन विधि के लिए एक उपन्यास का प्रयोग करें

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

मानवीय इन विट्रो में इम्यून असंतुलन का एक प्रारंभिक राज्य की मान्यता के लिए स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में दमन

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

माउस अस्थि मज्जा से Plasmacytoid वृक्ष के समान कोशिकाओं की शुद्धि के लिए प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छंटनी

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

आकलन रेटिना microglial phagocytic समारोह<em&gt; Vivo</em&gt; एक से फ्लो आधारित परख का उपयोग

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

स्व-प्रतिरक्षात्मकता खिलाफ स्टेम सेल व्युत्पन्न विशिष्ट प्रतिजन विनियामक टी कोशिकाओं के विकास

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

टी सेल Alloreactivity का मापन इमेजिंग फ्लो का उपयोग करना

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

अलगाव और इन विट्रो संस्कृति Murine और मानव वायुकोशीय मैक्रोफेज

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

स्तनधारी कोशिकाओं में क्षमता को फिर से सील प्लाज्मा झिल्ली का उच्च प्रवाह माप

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

बहुरंगा प्रवाह Cytometry-टी कोशिकाओं में Mitochondria और Lysosomes के ठहराव आधारित

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

न्यूट्रोफिल-लाइनेज सेल के मास साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए पूरे अस्थि मज्जा की तैयारी

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...