Name: the use of flow cytometry to assess the state of chromatin in t cells
Uploaded: 2015-12-17T14:00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells at JoVE.com

Этот проект был поддержан грантами от Национальных Институтов Здоровья (5 P20 RR016461 и 8 P20 GM103499), Национальный научный фонд (EPS-0903795). Дальнейшая поддержка обеспечивается научно-исследовательского и профессионального роста Фурман университета Фурман Advantage наград.

Это исследование было проведено в строгом соответствии с рекомендациями, приведенными в руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения. Протокол животных был утвержден (номер лицензии: A3242-01) Фурман университет комитет Уходу за животными и использование. Все материалы и оборудование, используемые в настоящем протоколе можно найти в таблице материалов и оборудования, в то время как буферы, используемые могут быть найдены в таблице буферов и решения. 1. Single Cell Подвеска лимфоцитов из селезенок мышей <ol><li> Жертвоприношение мышей с помощью СО 2 удушья. Подтвердите эвтаназии путем смещения шейных позвонков. Примечание: Используйте селезенки из двух 6-8-недельных мышей изогенной (например, C57B / 6) того же пола. Как правило, два селезенки обрабатываются. </li><li> Спрей животных обильно 70% раствора этанола и сориентироваться таким образом, что голова смотрит влево. </li><li> Использование щипцов, поднимите кожу животного вверх и от тон тело. С помощью ножниц, вырезать небольшой вырез через кожу около живота животного. Использование пальца, тянуть каждую сторону выемки, чтобы выставить брюшины от шеи до начала задних ног. Селезенка должна быть видна непосредственно под брюшиной. </li><li> Использование щипцов, поднимите брюшины и сделать небольшой надрез, чтобы выставить селезенки. Удалить селезенки с пинцетом и использовать ножницы, чтобы дразнить от жировой и любой соединительной ткани. </li><li> Поместите селезенки в 50 мл коническую пробирку, содержащую 10 мл PBS с добавлением 2% фетальной бычьей сыворотки (далее упоминается как PBS + 2%). Держите трубку на льду до готовности, чтобы начать клеточной суспензии. Примечание: Типичный восстановления между 60-90 млн клеток на селезенку, и, как правило, 2 миллиона клеток необходимы в образце. Выполните все следующие шаги в капот культуры ткани. </li><li> Слейте селезенки в стерильной 100 мм блюдо культуры ткани. </li><li> Получить два матовых микроскопа и удерживайте тон скользит таким образом, что два грубые матовые поверхности обращены внутрь друг к другу. Намочите слайды в + 2% раствора PBS выливают в чашку Петри. </li><li> Держите селезенки между матовыми поверхностями в слайды, с краями еще погруженных и растереть селезенки осторожно перемещая слайды и обратно друг против друга (рис 1А). Клетки попадают в чашку Петри. Продолжить шлифовальные, пока все клетки не были освобождены, а остатки селезенки появляются белые (рис 1B). </li><li> Составление клеточной суспензии в пипетку и фильтровать ее медленно через 70 мкм фильтр в новую стерильную 50 мл коническую пробирку. Следует отметить, что небольшие кусочки красной пульпе будут присутствовать на фильтре (фиг.2А). <ol><li> Если фильтр поднимается вверх, осторожно поднимите его немного, чтобы позволить жидкости стечь и поместите через фильтр обратно в 50 мл коническую трубку и продолжить, повторяя этот процесс по мере необходимости. Если обработки более 5 spleЭНС, это может быть необходимо разделить на две порции и использовать новый фильтр для каждой. </li></ol></li><li> Использование стопор часть 3 мл шприц аккуратно нажмите красную мякоть, содержащий оставшиеся клетки через сито (рис 2B). Убедитесь, что нажата как дно фильтра и стороны обеспечить, чтобы все красная пульпа прошла через фильтр (рис 2С). </li><li> Добавить 10 mlof PBS + 2% к ткани блюдо культуры и использовать это, чтобы мыть слайды, шприц пробку, и блюдо, чтобы восстановить оставшиеся клетки. Передайте это через ситечко же 70 мкм клеток в мл коническую трубку 50. Повторите этот шаг, если необходимо. </li><li> Центрифуга клеточной суспензии отфильтрованного при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° С. </li><li> Аккуратно перелить и отбросить супернатант, стараясь не нарушать осадок. Следовые количества PBS + 2% останется в трубке. Закрывают трубку и вылить осадок до тех пор, пока осадок полностью ресуспендировали. </li><li> Lyse красных кровяных клеток по объявлениемДин 2 мл ACK лизирующего буфера (0,15 М NH 4 Cl, 1 мМ КНСО 3, 0,1 мМ ЭДТА, рН 7,2, хранят при температуре 4 ° С) в селезенке в коническую пробирку и вращать и инвертировать трубку для того, чтобы все клетки вступают в контакт с буфером ACK. Аккуратно вихревой трубки в течение 1 мин при комнатной температуре. </li><li> Доведите объем клеточной суспензии до 50 мл PBS путем добавления + 2% трубки, чтобы нейтрализовать буфер ACK. Инвертировать трубки 10 раз и центрифуги в течение 5 мин при 300 х г при 4 ° С. После центрифугирования завершена, осадок должен быть белым (фиг.3). </li><li> Аккуратно перелить и отбросить супернатант, стараясь не нарушать осадок. Оставить следовые количества PBS + 2% в трубке, крышка трубки, и вылить осадок ресуспендируют его. </li><li> Добавьте 10 мл Т-клеток средах [10% FBS, 10 мМ HEPES (рН 7,0), 2 мМ GlutaMAX, 1 мМ пирувата натрия, 1 без незаменимых аминокислот, 1x пенициллина / стрептомицина и 50 мМ β-меркаптоэтанол] и, кроме того ресуспендируют осадок осторожнопипетки вверх и вниз. Затем Суспензию фильтруют через новый фильтр 70 мкм в новую 50 мл коническую пробирку. </li><li> Использование еще 5-10 мл клеточной сред Т для полоскания пробирку и передать это через фильтр 70 мкм в пробирку, содержащую остаток отфильтрованных клеток. Если обработка более двух селезенки, объем клеточных сред Т может быть увеличена до максимального извлечения. </li><li> Держите клетки на льду до готовый быть окрашены. Клетки должны быть подсчитаны и жизнеспособность обращались. <ol><li> Для подсчета клеток, объединить 3 мл клеток с 24 мл PBS + 2% и 3 мл 0,4% трипанового синего. Нагрузка 10 мл этого в каждой камере с Нейбауэра гемоцитометре. Жизнеспособность, по оценке трипанового синего, как правило, от 85-95%. </li></ol></li></ol> 2. Жизнеспособность и поверхности Окрашивание <ol><li> Гранул клетки центрифугированием в течение 10 мин при 300 х г при 4 ° С. Ресуспендируют клеток в Т-клеточной среде до концентрации 1 х 10 7 клеток / мл. TransfEr 2 миллиона клеток (100 мл) в лунку U-образным дном для культуры ткани 96-луночного планшета. </li><li> Центрифуга 96-луночный планшет в течение 10 мин при 300 х г при 4 ° С. </li><li> Удалить супернатант из каждой лунки, щелкая жидкости в луночного планшета в раковину (клеточный осадок останется в скважине) и вытирать тарелку на чистым бумажным полотенцем. Промыть клетки путем ресуспендирования их в 200 мкл PBS с последующим центрифугированием при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° С. Выполните все моет этот путь, если не указано иное. Примечание: Не используйте PBS + 2%, как это будет влиять на фиксируемой PI пятно. </li><li> Удалить супернатант, щелкая тарелку и добавить 100 мл свежеприготовленного коммерческой пятно (например, поправимо Red Dead пятно клеток) в каждую лунку. <ol><li> Сделать пятно путем разбавления химически активного красителя 1:10 маточного раствора в ДМСО с последующим разбавлением 1:10 в ФБС. Инкубируйте планшет при 4 ° С в течение 30 мин в защищенном от света. </li></ol></li><li> Центрифуга рпоздно в течение 10 мин при 300 х г при 4 ° С. В этот момент вперед, выполнять всю работу с пластиной с тканевой культуры капот свет. </li><li> Удалить супернатант, щелкая пластину, а затем добавить 100 мл раствора блока Fc. Сделайте блок решение Fc путем разбавления Fc блок исходного раствора 1: 100 в PBS. </li><li> Развести антитела, которые будут использоваться для окрашивания поверхности (например, анти-CD4 или анти-CD8) в PBS и добавляют 100 мл в каждую лунку. Инкубируйте 96-луночного планшета в течение 30 мин при 4 ° С в защищенном от света. Примечание: Поверхностные пятна антитела должны быть оттитрованы для оптимальной производительности. Обычно используют в разведении 1: 400, в соответствии с протоколом производителя: 200 или 1. </li></ol> 3. внутриклеточное окрашивание для гистона H3 <ol><li> После инкубации поверхностного пятна, промыть клетки дважды в PBS. </li><li> После последней промывки, добавьте 100 мкл 4% параформальдегида в каждую лунку. Инкубируйте 96-луночного планшета в течение 5 мин при комнатной температуре. Сделайте 4% параформальдегида по dilutING 16% параформальдегида в PBS. Сделать это свежий. </li><li> Вымойте клетки дважды в PBS. </li><li> Сделайте решение Пермь / блок (акции Пермь решение PBS + 2% + 0,02% Тритон Х-100, магазин на 4 ° C) путем объединения 2 мл нормальной сыворотки кролика за 100 мл раствора Пермского края. Сделайте достаточно для 60 мл / образец. </li><li> Добавить 40 мл / Пермь блок для каждого образца хорошо и хорошо перемешать, осторожно пипеткой вверх и вниз, осторожно, чтобы не сделать пузыри. Инкубируют планшет при комнатной температуре в течение 45 мин в темноте. Сохранить оставшиеся Пермь / блок для шага 3.6. </li><li> Развести флуоресцентно сопряженную гистонов H3K4me1 антитела в Пермь / Блок решения защищены в шаге 3.5 и добавить 10 мкл этого раствора в каждую лунку. Смешать, осторожно пипеткой вверх и вниз. Инкубируйте 96-луночного планшета в темноте в течение 1 ч при 4 ° С. Примечание: Используйте антитела, конъюгированного H3K4me1 помощью сопряжения комплект R-фикоэритрин в соответствии с инструкциями изготовителя. </li><li> Вымойте клетки дважды в PBS + 2%. </li><li> Ресуспендируют клеток в 200мкл PBS + 2% и передать образцы для FACS труб для проточной цитометрии. Образцы можно хранить при температуре 4 ° С в темноте. Для получения оптимальных результатов анализа проб в течение двух дней. По одному окрашенные образцы могут быть использованы в качестве проточной цитометрии управления компенсации. </li></ol>

<ol>
	<li>Bravo-Ferrada, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+surface+damage+on+cell+envelope+assesed+by+afm+and+flow+cytometry+of+lactobacillus+plantarum+exposed+to+ethanol+and+dehydration.">Study of surface damage on cell envelope assesed by afm and flow cytometry of lactobacillus plantarum exposed to ethanol and dehydration.</a> J Appl Microbiol. , (2015).</li><li>Agola, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Bead-Based+Flow+Cytometry+for+Assaying+Rab7+GTPase+Interaction+with+the+Rab-Interacting+Lysosomal+Protein+(RILP)+Effector+Protein.">Quantitative Bead-Based Flow Cytometry for Assaying Rab7 GTPase Interaction with the Rab-Interacting Lysosomal Protein (RILP) Effector Protein.</a> Methods Mol Biol. 1298, 331-354 (2015).</li><li>Toh, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+flow+cytometry+to+analyze+intracellular+location+and+trafficking+of+cargo+in+cell+populations.">Application of flow cytometry to analyze intracellular location and trafficking of cargo in cell populations.</a> Methods Mol Biol. 1270, 227-238 (2015).</li><li>Rawlings, J. S., Gatzka, M., Thomas, P. G., Ihle, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+condensation+via+the+condensin+II+complex+is+required+for+peripheral+T-cell+quiescence.">Chromatin condensation via the condensin II complex is required for peripheral T-cell quiescence.</a> EMBO J. 30, 263-276 (2011).</li><li>Lee, M. D., Bingham, K. N., Mitchell, T. Y., Meredith, J. L., Rawlings, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+mobilization+is+both+required+and+sufficient+for+initiating+chromatin+decondensation+during+activation+of+peripheral+T-cells.">Calcium mobilization is both required and sufficient for initiating chromatin decondensation during activation of peripheral T-cells.</a> Mol Immunol. 63, 540-549 (2015).</li><li>Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamental immunology. , (2013).</li><li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling+in+lymphocyte+activation+and+disease.">Calcium signalling in lymphocyte activation and disease.</a> Nat Rev Immunol. 7, 690-702 (2007).</li><li>Isakov, N., Altman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C(theta)+in+T+cell+activation.">Protein kinase C(theta) in T cell activation.</a> Annu Rev Immunol. 20, 761-794 (2002).</li><li>Macian, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NFAT+proteins:+key+regulators+of+T-cell+development+and+function.">NFAT proteins: key regulators of T-cell development and function.</a> Nat Rev Immunol. 5, 472-484 (2005).</li><li>Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+by+calcium,+calcineurin+and+NFAT.">Transcriptional regulation by calcium, calcineurin and NFAT.</a> Genes Dev. 17, 2205-2232 (2003).</li><li>Rawlings, J. S., Rosler, K. M., Harrison, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK/STAT+signaling+pathway.">The JAK/STAT signaling pathway.</a> J Cell Sci. 117, 1281-1283 (2004).</li><li>Ihle, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STATs:+signal+transducers+and+activators+of+transcription.">STATs: signal transducers and activators of transcription.</a> Cell. 84, 331-334 (1996).</li><li>Moriggl, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stat5+is+required+for+IL-2-induced+cell+cycle+progression+of+peripheral+T+cells.">Stat5 is required for IL-2-induced cell cycle progression of peripheral T cells.</a> Immunity. 10, 249-259 (1999).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+and+their+function.">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li></ol>

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Мы разработали протокол, позволяющий для оценки конденсации хроматина в Т-клетках. Он основан на простом наблюдении, что гистона H3 антитела не могут получить доступ к их эпитопы легко в наивных клеток, но при активации Т-клеток, эти антитела же способностью связываться с их эпитопов. Сравнивая МФО гистона H3 окрашивание между группами лечения, относительная степень конденсации или деконденсации может быть определена. Мы использовали этот протокол для определения относительного положения конденсации во время развития тимоцитов и во время активации Т-клеток 4. Мы также использовали этот протокол для изучения механизмов, которые управляют процессом деконденсацию 5. Этот протокол основан на использовании антитела гистона H3 для обнаружения состояния хроматина конденсации. Поскольку не существует никакого глобального изменения модификации гистонов во время активации Т-клеток 4, мы можем использовать антитела H3K4me1 оценить хроматинаСтатус в этом протоколе. Мы использовали антитела против поднятые неизмененном гистона H3; Тем не менее, было произведено сигнала значительно слабее в целом. По нашему опыту, антитела, против модифицированной гистона H3 работать лучше в иммунофлюоресценции и проточной цитометрии анализов, в то время как антитела против неизмененном гистона H3 работать лучше в вестерн-блоттинга. Следует отметить, что можно также использовать антитела против поднятые другими белками гистоновых, хотя мы не пытались его. В антител шаги Пермь / Блок и гистона H3 являются наиболее важных шагов в протоколе. Количество раствора Пермь / Блок используется должен быть оптимизирован каждый раз акции Пермь решение сделано. Это может быть сделано путем сравнения эффективности различных разведений маточного раствора. Типичный эксперимент заключается в сравнении хроматина статус в наивных Т-клеток в тех активирована в течение 3 часов (рисунок 4). Надо выбрать разведение, которое производит наибольшее изменение в МФО в течениепериод времени, анализировали. Исходный раствор можно развести в PBS + 2%, чтобы уменьшить Пермь / Block силы сначала ресуспендирования клеток в целых 100 мл PBS + 2% после шага 3.4, а затем добавить Пермь / блок в шаге 3.5. Аналогичный эксперимент пилот должен быть использован для тестирования различных разведений в флуоресцентно сопряженного гистона H3 антитела каждый раз новая партия антитела надписью. Эти шаги особенно важны для успешного обнаружения различий конденсации начале в активации Т-клеток (например, в течение 3 часов активации). Иногда есть клетки, которые не получают проницаемыми и, таким образом, не будет пятно с антителом гистона H3. Это может произойти, если клетки не ресуспендировали хорошо при добавлении Пермь / Блокировать или если Пермь / Блок не достаточно сильны. Эти клетки появится в событиях прижатых к оси при визуализации гистограмму окрашивания гистонов H3. Так как эти события будут исказить общую МФО, эти события могут быть исключены из анализа, Гатинаг нормальное распределение гистона H3 позитивными клетками. Дополнительная помощь может быть найдено в руководстве Устранение неполадок (Таблица 1). Включение фиксируемой мертвой пятно клеток позволяет для оценки жизнеспособности клеток в анализе. Это абсолютно необходимо при манипулировании активацию Т-клеток, поскольку некоторые раздражители могут вызывать гибель клеток. В таком случае, антитело гистона H3 могут связываться гистонов в мертвых клеток иначе, чем живых клеток, что приводит к ошибочной интерпретации результатов. Этот протокол предназначен для использования в формате 96-луночного планшета, что позволяет высокую пропускную способность анализ хроматина статуса. Селезенки от 6-8-недельных самок мышей, как правило, дают 60-90 миллионов клеток, используя протокол. Поскольку протокол окрашивания требует 2 миллионов клеток на образец, можно легко анализе несколько групп лечения и временные точки в трех экземплярах с одной селезенки на одном 96-луночного планшета. Можно рerform протокол с меньшим клеток на образец; Однако, из-за количества шагов центрифугированием и присущего потери клеток на каждом из этих этапов, это не желательно, чтобы снизить количество клеток намного. Мы успешно завершили протокол с 1 млн клеток на образец. Мы использовали этот протокол для изучения состояния хроматина в CD4 + Т-хелперов и CD8 + цитотоксических Т-клеток. Это стало возможным потому, что протокол включает в себя стандартную окрашивания поверхности. Протокол может быть легко адаптирован для изучения хроматина в других субпопуляций лимфоцитов с использованием антител против населения конкретной поверхностных маркеров. Этот протокол также может быть легко адаптированы к другим типам клеток, пока антител, распознающих соответствующие поверхностных маркеров доступны и соответствующих условий фиксации / проницаемости известны.

Проточная цитометрия является технологией на основе лазера разработана для анализа нескольких физических и флуоресцентных параметров в клеточных популяций. Эта технология работает взвешенных клеток в потоке жидкости встречи лазер, захватывающие маркеры люминесцентные или внутри клеток. Эти маркеры затем излучают свет, который обнаруживается и количественно фотоэлектронных умножителей. В то время как поток цитометрии традиционно используются для идентификации популяций клеток, она доказала, что является полезным при изучении технологии массив клеток свойств, включая целостности мембраны клеток, белок-белковых взаимодействий и торговли белка 1-3. Мы разработали протокол, позволяющий эта технология будет использоваться для обнаружения состояния хроматина в Т-клетках, как они приводятся в действие в пробирке 4. Мы также использовали этот протокол для изучения механизма активации, вызванной хроматина деконденсации Т-клеток 5. Т-клеток activatioп и пролиферации являются критическими для правильного иммунного ответа. Т-клетки, определенное подмножество лимфоцитов в пределах иммунной системы, которые необходимы для правильного иммунного ответа и развитию иммунологической памяти. Активация инициируется, когда антиген представлен в контексте главного комплекса совместимости с Т-клеточный рецептор (TCR), расположенной на поверхности внеклеточного покоящихся Т-клеток (обзор 6). Это вызывает ряд динамических и высоко упорядоченных молекулярных событий в Т-клетках, кульминацией к увеличению концентрации внутриклеточного Ca2 + 7 и ядерной транслокации факторов транскрипции, необходимых для активации (обзор 8-10). После активации Т-клеток, усиления способности реагировать на интерлейкин-2 (IL-2), мощный фактор роста, который использует JAK (Янус киназы) / STAT (Сигнал датчика и активатора транскрипции) путь ездить клональную пролиферацию активированных Т клетки 11. Вкратце, ИЛ-2 стимуляцииРезультаты в фосфорилирования STAT белков, в семье скрытых цитозольными транскрипционных факторов. После того, как фосфорилируется, STAT белки димеризуются, перемещается в ядро ​​и диск экспрессию генов, включая тех, кто участвует в прогрессии клеточного цикла. В Т-клеток, IL-2 сигналы через STAT5, который необходим для T клеточной пролиферации 12,13. Для достижения клональной экспансии активированных Т-клеток, те клетки, которые не испытали антиген-TCR взаимодействие (наивные Т-клетки), должны иметь механизм, чтобы игнорировать мощные эффекты IL-2. Это достигается с помощью регулирования хроматина статуса. Наивные Т-клетки обладают конденсированного хроматина, который запрещает участие STAT5-ДНК в ответ на IL-2 стимуляции. После активации хроматина decondenses и STAT5 можете получить доступ к промоутеров генов-мишеней, что позволяет клональную пролиферацию 4. Интересно, что это изменение статуса хроматина не зависит от эпигенетических изменений гистона Proteiнс (для обзора см 14), как мы не наблюдали глобальное изменение в модификации гистонов во время активации Т-клеток. 4 При выполнении этих исследований, мы обнаружили, что антитела, против белков гистонов также имел трудности с доступом их эпитопы в нативных клеток, но при активации может более легко связать их эпитопы 4. Таким образом, связывание антитела с гистонов служит для считывания состояния конденсация хроматина. Здесь мы приводим метод использовать проточной цитометрии для обнаружения флуоресцентно конъюгированных антител гистона H3, чтобы оценить статус хроматина в Т-клетках. Конденсации хроматина в популяции клеток измеряют как средней интенсивности цветения (MFI) окрашивания гистона H3. В контексте активизации Т-клеток, МФО гистона H3 окрашивания увеличивается, что свидетельствует о деконденсацию хроматина. В дополнение к измерению состояния хроматина с помощью внутриклеточного окрашивания гистонов H3, этот протокол также incorporaTES поверхности окрашивания и поправимо пятно для живых клеток, позволяя анализ субпопуляций клеток.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:584px;" width="585">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">100mm tissue culture dish</td>
			<td style="width:83px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Precleaned frosted microscope slides</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sterile cell strainer, 70mm nylon mesh</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">3mL syringe, Luer-Lok tip</td>
			<td style="width:83px;">BD</td>
			<td>309585</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Falcon 50mL polypropylene conical tube</td>
			<td style="width:83px;">Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">LIVE/DEAD fixable red dead cell stain kit</td>
			<td style="width:83px;">Life Technologies</td>
			<td>L23102</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies sells versions of this kit with different colors</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Fc Block</td>
			<td style="width:83px;">BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">16% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:83px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Normal rabbit serum</td>
			<td style="width:83px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">R9133</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Anti-H3K4me1 antibody</td>
			<td style="width:83px;">Abcam</td>
			<td>ab8895</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">R-Phycoerythrin conjugation kit</td>
			<td style="width:83px;">Abcam</td>
			<td>ab102919</td>
			<td style="width:167px;">Alternatively, the LYNX rapid RPE kit from AbD Serotec can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of flow cytometry to assess the state of chromatin in t cells

Во надлежащего иммунного ответа, покоящиеся Т-клетки активируются при презентации антигена, чтобы их антиген-специфического рецептора Т-клеток. Это приводит к клональной пролиферацией только тех Т-клеток, несущих рецептор, который распознает антиген. Хроматина деконденсация является отличительной чертой активации Т-клеток и необходим для Т-клетки, чтобы приобрести способность к пролиферации после антигенной участия. Это изменение в конденсации хроматина могут быть обнаружены с помощью антител, против гистоновых белков. Эти антитела не могут связываться с их эпитопов в наивных Т-клеток, а также они могут в активированных Т-клеток. Мы опишем, как одновременно окрасить Т-клеточные маркеры конкретных поверхности, жизнеспособность трек с фиксируемой мертвой пятно клеток и измерить состояние хроматина с помощью внутриклеточного окрашивания гистона H3 белков. Окрашенные клетки анализировали с помощью проточной цитометрии и хроматина состояния конденсации определяется как интенсивность флуоресценции среднее (MFI) от пятна гистона H3. ХроматВ течение деконденсации активации Т-клеток, как показано, с увеличением MFI

Лимфоциты из C57B / 6 мыши были обработаны в суспензии отдельных клеток в соответствии с протоколом и подсчитывали с помощью стандартной гемоцитометра. Клетки высевали в трех повторах в 2 × 10 6 / мл в Т-клеточных сред в 15 мл конические пробирки и не лечить, или стимулировали 1 мг / мл растворимого антитела против CD3 (клон 4C11) в течение 3 ч при 37 ° С в стандартный тканевой культуры инкубатор. Мертвые клетки окрашивали и затем клетки затем окрашивали с использованием поверхности FITC-CD8 и CD4 APC-антител в соответствии с протоколом. Гистонов доступность анализировали с помощью проточной цитометрии (рис 4). В обоих наивных клеток CD4 + и CD8 + Т-средняя интенсивность флуоресценции (MFI) является низкой, означающий конденсированного хроматина состояние. В-клетки активируются анти-CD3 антитела значительно возрастает MFI (р &lt;0,001, Стьюдента), что указывает хроматина имеет деконденсированных. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig1.jpg" /> Рисунок 1. Методика обработки селезенки в суспензии отдельных клеток с использованием матового стекла микроскопа. (А) Селезенка прижимается к матовым поверхностям двух предметных стеклах. (B) слайды перемещаются вперед и назад, друг против друга, выпускающих лимфоцитов в 100 мм чашки Петри, пока остатки селезенки не белые. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53533/53533fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a> <img alt="фигура 2" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig2.jpg" /> Рисунок 2. Использование шприца пробку нажать оставшиеся красный мякоть через сито 70 мм клеток. (А), оставшиеся после селезенки Мякоть красная я<html> ы перерабатывают в суспензии отдельных клеток и пропускают через сито 70 мм клеток. (B) стопорный участок из 3 мл шприц используется для плавно нажмите оставаясь красной пульпе через ячейки сетчатого фильтра. (С) После использования шприц, не должно быть практически не красная пульпа остается в ячейки фильтра. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53533/53533fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig3.jpg" /> Рисунок 3. ACK лизиса эритроцитов. (А) Центрифугирование суспензии отдельных клеток, генерируемого из одного селезенки мыши до ACK лизис. (B) После ACK лизиса эритроцитов, клеточный осадок должен быть белым.получить = &quot;_blank&quot;&gt; Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. <img alt="Рисунок 4" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig4.jpg" /> Рисунок 4. Представитель результаты протокола. Схема (А) Память используется для анализа состояния хроматина в CD4 + Т-лимфоцитов. (В и С) Т-клетки не лечить или активированный 1 мг / мл растворимых анти-CD3 антител в течение 3 ч (в трех экземплярах). Затем клетки анализировали с помощью проточной цитометрии для определения конденсации хроматина в CD4 + клетки (B) и CD8 + клеток (С). Данные средства ± стандартное отклонение средней интенсивности флуоресценции окрашивания H3K4me1. * р &lt;0,001 (t-тест Стьюдента) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53533/53533fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите час</a>прежде чем, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. <img alt="Таблица 1" src="/files/ftp_upload/53533/53533table1.jpg" /> Таблица 1:. Поиск и устранение неисправностей Краткий справочник по общим вопросам и возможных решений.

Watch this Scientific Journal Video about The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells at JoVE.com

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

Использование проточной цитометрии для оценки состояния хроматина в Т-клетках

Проточная цитометрия может быть использован для оценки состояния хроматина в Т-клетках. Этот протокол позволяет ученым интерпретировать доказательства хроматина деконденсации течение активации Т-клеток свидетельствует увеличение в средней интенсивности цветения (MFI) флуоресцентных антител гистона H3

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Количественная оценка иммунных клеток в поврежденный спинной ткани шнура с помощью проточной цитометрии: Роман Используйте для метода очистки сотовый

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Человек In Vitro Борьбе как инструмент для скрининга Признание ранней стадии иммунного дисбаланса

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Флуоресценция активированных сортировки клеток для очистки плазмоцитов дендритных клеток из костного мозга мыши

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Оценка сетчатке микроглии фагоцитарной функции<em&gt; В Vivo</em&gt; С использованием анализа проточной цитометрии на основе

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Развитие стволовых клеток, полученных из антиген-специфических регуляторных Т-клеток против аутоиммунитета

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Измерение Т-клетки с помощью визуализации аллореактивности проточной цитометрии

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Изоляции и в пробирке культуры мышиных и человека альвеолярные макрофаги

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

Высок объём измерение плазматической мембраны запечатывания эффективность в клетках млекопитающих

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Многоцветная потока на основе цитометрии количественная оценка митохондрии и лизосом в Т-клеток

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Подготовка цельного костного мозга для анализа массовой цитометрии нейтрофил-линейных клеток

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...