Name: whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea
Uploaded: 2016-01-01T15:00:00
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This work was supported in part by a grant from the Office of Naval Research (N000141310569). The Southern Illinois University School of Medicine Research Imaging Facility equipment was supported by the National Center for Research Resources-Health (S10RR027716).

Déclaration éthique: procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par l&#39;Institutional Animal Care et l&#39;utilisation Comité à l&#39;École de médecine de l&#39;Université Southern Illinois. 1. Extraction des temporelles Bones <ol><li> Identifier les os temporaux dans la base du crâne de la souris 13 et gratter les nerfs crâniens aide de pinces de modèle standard. </li><li> Placez la pince de modèle standard à la pointe de la capsule otique et a...

<ol>
	<li>Robles, L., Ruggero, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+the+mammalian+cochlea.">Mechanics of the mammalian cochlea.</a> Physiol Rev. 81 (3), 1305-1352 (2001).</li><li>Ehret, G., Frankenreiter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitattive+analysis+of+cochlear+structures+in+the+house+mouse+in+relation+to+mechanisms+of+acoustical+information+processing.">Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information processing.</a> J Comp Physiol. 122, 65-85 (1977).</li><li>Ou, H. C., Bohne, B. A., Harding, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+damage+in+the+C57BL/CBA+mouse+cochlea.">Noise damage in the C57BL/CBA mouse cochlea.</a> Hear Res. 145 (1-2), 111-122 (2000).</li><li>Engstrom, H., Ades, H. W., Andersson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structural pattern of the organ of Corti. A systematic mapping of sensory cells and neural elements. , (1966).</li><li>Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+Recordings+at+Afferent+Dendrites+Contacting+Cochlear+Inner+Hair+Cells:+Monitoring+Multivesicular+Release+at+a+Ribbon+Synapse.">Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse.</a> J Vis Exp. (48), e2442 (2011).</li><li>Bohne, B. A., Harding, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+and+analyzing+the+mouse+temporal+bone+to+identify+gross,+cellular+and+subcellular+pathology.">Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology.</a> Hear Res. 109 (1-2), 34-45 (1997).</li><li>Bohne, B. A., Harding, G. W., Ou, H. C., Willott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Mouse Auditory Research. , 171-187 (2001).</li><li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells.">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (2), 781-785 (2008).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+proliferation+of+postmitotic+cochlear+supporting+cells+by+acute+ablation+of+the+retinoblastoma+protein+in+neonatal+mice.">In vivo proliferation of postmitotic cochlear supporting cells by acute ablation of the retinoblastoma protein in neonatal mice.</a> J Neurosci. 30 (17), 5927-5936 (2010).</li><li>Steigelman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystin-1+Is+Required+for+Stereocilia+Structure+But+Not+for+Mechanotransduction+in+Inner+Ear+Hair+Cells.">Polycystin-1 Is Required for Stereocilia Structure But Not for Mechanotransduction in Inner Ear Hair Cells.</a> J Neurosci. 31 (34), 12241-12250 (2011).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+in+vivo+conversion+of+mouse+cochlear+pillar+and+Deiters'+cells+to+immature+hair+cells+by+Atoh1+ectopic+expression.">Age-dependent in vivo conversion of mouse cochlear pillar and Deiters' cells to immature hair cells by Atoh1 ectopic expression.</a> J Neurosci. 32 (19), 6600-6610 (2012).</li><li>Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+and+plasmid+electroporation+of+the+murine+organ+of+Corti.">Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti.</a> J Vis Exp. (36), e1685 (2010).</li><li>Burns, J. C., On, D., Baker, W., Collado, M. S., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over+half+the+hair+cells+in+the+mouse+utricle+first+appear+after+birth,+with+significant+numbers+originating+from+early+postnatal+mitotic+production+in+peripheral+and+striolar+growth+zones.">Over half the hair cells in the mouse utricle first appear after birth, with significant numbers originating from early postnatal mitotic production in peripheral and striolar growth zones.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 13 (5), 609-627 (2012).</li><li>Collado, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+postnatal+accumulation+of+junctional+E-cadherin+is+inversely+correlated+with+the+capacity+for+supporting+cells+to+convert+directly+into+sensory+hair+cells+in+mammalian+balance+organs.">The postnatal accumulation of junctional E-cadherin is inversely correlated with the capacity for supporting cells to convert directly into sensory hair cells in mammalian balance organs.</a> J Neurosci. 31 (33), 11855-11866 (2011).</li><li>Meyers, J. R., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape+change+controls+supporting+cell+proliferation+in+lesioned+mammalian+balance+epithelium.">Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium.</a> J Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).</li><li>Gratton, M. A., Rao, V. H., Meehan, D. T., Askew, C., Cosgrove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+dysregulation+in+the+stria+vascularis+of+mice+with+Alport+syndrome:+implications+for+capillary+basement+membrane+pathology.">Matrix metalloproteinase dysregulation in the stria vascularis of mice with Alport syndrome: implications for capillary basement membrane pathology.</a> Am J Pathol. 166 (5), 1465-1474 (2005).</li></ol>

<html> Il ya plusieurs étapes cruciales pour la réussite de toute la dissection de montage et immunologique. Cependant, avant l&#39;une de ces méthodes sont exécutées, fixation appropriée du tissu cochléaire est nécessaire. Nous vous recommandons d&#39;utiliser le méthanol libre, ultra-pure, de qualité EM PFA. PFA fait à partir de poudre peut avoir des traces de méthanol et un pH instable qui diminue la qualité de l&#39;immunofluorescence. D&#39;autres groupes ont également montré que les dissections simil...

La cochlée en forme de spirale de l&#39;oreille interne, contenue dans l&#39;os temporal, abrite l&#39;organe de Corti, la sensibilité auditive organe final chez les mammifères. La cochlée est tonotopically organisé et souvent divisé en apicale, un milieu et basale tours correspondant à différentes régions de fréquence avec détection de son à haute fréquence dans la base et la détection de basse fréquence dans l&#39;apex 1. Les cellules ciliées, les cellules mécano de l&#39;organe de Corti, courent tout le long de la cochlée, qui est d&#39;environ 6 mm de long chez la souris 2,3. Ces cellules convertissent l&#39;énergie mécanique des ondes sonores, qui sont transmis à travers le labyrinthe membraneux rempli de fluide, en des signaux neuronaux qui sont traitées par les structures auditives centrales. La technique décrite ici concerne un procédé pour la préparation de supports entiers de l&#39;organe de Corti après calcification de la cochlée est complète (pour les échantillons allant de 1 semaine d&#39;âge et l&#39;âge adulte). Nous présentons également une méthode pour immunostaining le tout monté tissus cochléaire. Montures entières cochléaires sont cruciales pour la visualisation de toutes les cellules de cheveux et entourant les cellules de soutien dans leurs arrangements spatiaux naturelles et permettent l&#39;analyse en trois dimensions avec l&#39;utilisation de la microscopie confocale. Drs. Hans Engstrom et Harlow Ades décrits à l&#39;origine un ensemble de monter méthode de dissection cochléaire en 1966. Ils ont décrit une technique pour fixer rapidement et disséquer cochleae calcifiée immergée dans un liquide à partir d&#39;une variété de mammifères, la préservation de courts segments intacts de l&#39;organe de Corti pour analyse microscopique 4. La dissection, une cochlée de rat calcifiée non fixée a également été illustré dans une vidéo d&#39;instruction 5. Drs. Barbara Bohne et Gary Harding à l&#39;Université de Washington ont fait plusieurs modifications importantes à cette méthode. Dans leur version de la méthode de montage toute cochléaire, l&#39;os temporal était adoucie, noyée dans le plastique, et cinq demi-tours ou dix quarts de tours étaient dissectionTed 6,7. Dr Charles Liberman et ses collègues de Eaton Peabody laboratoires, Massachusetts Eye and Ear Infirmary, modifiés cette technique afin que le plastique intégration n&#39;a pas été nécessaire 8. Une modification supplémentaire de la technique a eu lieu dans le laboratoire du Dr Jian Zuo recherche de l&#39;Hôpital pour enfants St. Jude 9-12 qui a informé la méthode de dissection présenté ici. On utilise une stratégie différente pour avoir accès à l&#39;organe de Corti et que Bohne Liberman, ce qui permet l&#39;isolement de toutes les apical, au milieu et à tour de rôle de base. Ainsi le tissu disséqué est plus grande et moins susceptibles d&#39;être perdus ou endommagés pendant les processus de dissection ou immunocoloration. De plus, le procédé actuel facilite la mesure de la distance à partir de l&#39;extrémité apicale ou basale crochet pour identifier une région de fréquence. Bien que de nombreux laboratoires effectuent un marquage de tissu cochléaire, on ne sait pas où cette méthode est originaire. En conséquence, il existe plusieurs recettes pour bloquer Buffers et incubation des anticorps tampons qui peuvent affecter la performance des anticorps primaires individuels. Ici, nous présentons une méthode pour immunocoloration avec des anticorps marqués par fluorescence qui est applicable à des anticorps les plus couramment utilisés dans le domaine auditif. La forme complexe de la cochlée, la structure délicate de l&#39;organe de Corti, et enrobage osseuse constituent un défi pour l&#39;analyse histologique et biochimique. Une variété de techniques sont actuellement utilisés dans le domaine de l&#39;audition de surmonter ces caractéristiques difficiles et visualiser les cellules à l&#39;intérieur de l&#39;organe de Corti, chaque technique avec ses propres avantages et inconvénients. Le protocole présenté ici permet pour toute la dissection de montage de la cochlée de souris adulte et, avec une légère modification, peut potentiellement être utilisé pour examiner les structures critiques au sein de la cochlée d&#39;une variété d&#39;autres organismes modèles utilisés dans le domaine.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1074">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:377px;">Standard&#160; pattern forceps</td>
			<td style="width:139px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:163px;">11000-12</td>
			<td style="width:395px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">10.5 cm fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-11</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>AVSS2000</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;">16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>18814</td>
			<td style="width:395px;">TOXIC --wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS pH 7.4&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP118-500</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">end-over-end tube rotator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-450-127</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 mm petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-202-037</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">activated charcoal</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC134372500</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">stereo dissection microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #4 jeweler&#39;s forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11241-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5 jeweler&#39;s forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2.5 mm Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15001-08</td>
			<td>curved&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mm Vannas-Tubingen spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15003-08</td>
			<td>straight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">48 well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772-52</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8 well chamber slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1256518</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-500</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA, fraction V</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1605</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NGS</td>
			<td>Vector labs</td>
			<td>S-1000</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NHS</td>
			<td>Vector labs</td>
			<td>S-2000</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3D rotator</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>R3D-710</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Western blot incubation box XL</td>
			<td>Licor</td>
			<td>929-97401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;">Prolong gold antifade mounting media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36930</td>
			<td style="width:395px;">can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost Plus Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">coverslips 22 x 22 x 1</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-548-B</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">clear nail polish</td>
			<td>Local drug store</td>
			<td></td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cardboard slide folder</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-587-10</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">plastic slide box</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-448-10</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

Nous présentons une méthode pour isoler l&#39;organe de Corti que trois tours intactes cochléaires (de sommet, milieu, et la base) à partir de tissu cochléaire qui est calcifiée, avec des étapes de dissection clés présentés dans la figure 1. Pendant la première semaine postnatale du développement, la calcification de la cochlée de souris est incomplète et une méthode de dissection plus simple peut être utilisé 13. En utilisant...

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Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Nous présentons une méthode pour isoler l&#39;organe de Corti adulte que trois tours intactes cochléaires (APEX, milieu, et de la base). Nous démontrons également une procédure pour immunocoloration avec des anticorps marqués par fluorescence. Ensemble, ces techniques permettent l&#39;étude des cellules ciliées, cellules de soutien, et d&#39;autres types de cellules trouvées dans la cochlée.

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The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

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