Name: whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea
Uploaded: 2016-01-01T15:00:00
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This work was supported in part by a grant from the Office of Naval Research (N000141310569). The Southern Illinois University School of Medicine Research Imaging Facility equipment was supported by the National Center for Research Resources-Health (S10RR027716).

Declaración de Ética: Procedimientos que involucran sujetos animales han sido aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo en la Facultad de Medicina de la Universidad del Sur de Illinois. 1. Extracción de Huesos temporales <ol><li> Identificar los temporales en la base del cráneo del ratón 13 y raspar los nervios craneales utilizando fórceps patrón estándar. </li><li> Coloque fórceps patrón estándar en la punta de la cápsula ótica y con el pulgar ...

<ol>
	<li>Robles, L., Ruggero, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+the+mammalian+cochlea.">Mechanics of the mammalian cochlea.</a> Physiol Rev. 81 (3), 1305-1352 (2001).</li><li>Ehret, G., Frankenreiter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitattive+analysis+of+cochlear+structures+in+the+house+mouse+in+relation+to+mechanisms+of+acoustical+information+processing.">Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information processing.</a> J Comp Physiol. 122, 65-85 (1977).</li><li>Ou, H. C., Bohne, B. A., Harding, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+damage+in+the+C57BL/CBA+mouse+cochlea.">Noise damage in the C57BL/CBA mouse cochlea.</a> Hear Res. 145 (1-2), 111-122 (2000).</li><li>Engstrom, H., Ades, H. W., Andersson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structural pattern of the organ of Corti. A systematic mapping of sensory cells and neural elements. , (1966).</li><li>Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+Recordings+at+Afferent+Dendrites+Contacting+Cochlear+Inner+Hair+Cells:+Monitoring+Multivesicular+Release+at+a+Ribbon+Synapse.">Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse.</a> J Vis Exp. (48), e2442 (2011).</li><li>Bohne, B. A., Harding, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+and+analyzing+the+mouse+temporal+bone+to+identify+gross,+cellular+and+subcellular+pathology.">Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology.</a> Hear Res. 109 (1-2), 34-45 (1997).</li><li>Bohne, B. A., Harding, G. W., Ou, H. C., Willott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Mouse Auditory Research. , 171-187 (2001).</li><li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells.">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (2), 781-785 (2008).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+proliferation+of+postmitotic+cochlear+supporting+cells+by+acute+ablation+of+the+retinoblastoma+protein+in+neonatal+mice.">In vivo proliferation of postmitotic cochlear supporting cells by acute ablation of the retinoblastoma protein in neonatal mice.</a> J Neurosci. 30 (17), 5927-5936 (2010).</li><li>Steigelman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystin-1+Is+Required+for+Stereocilia+Structure+But+Not+for+Mechanotransduction+in+Inner+Ear+Hair+Cells.">Polycystin-1 Is Required for Stereocilia Structure But Not for Mechanotransduction in Inner Ear Hair Cells.</a> J Neurosci. 31 (34), 12241-12250 (2011).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+in+vivo+conversion+of+mouse+cochlear+pillar+and+Deiters'+cells+to+immature+hair+cells+by+Atoh1+ectopic+expression.">Age-dependent in vivo conversion of mouse cochlear pillar and Deiters' cells to immature hair cells by Atoh1 ectopic expression.</a> J Neurosci. 32 (19), 6600-6610 (2012).</li><li>Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+and+plasmid+electroporation+of+the+murine+organ+of+Corti.">Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti.</a> J Vis Exp. (36), e1685 (2010).</li><li>Burns, J. C., On, D., Baker, W., Collado, M. S., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over+half+the+hair+cells+in+the+mouse+utricle+first+appear+after+birth,+with+significant+numbers+originating+from+early+postnatal+mitotic+production+in+peripheral+and+striolar+growth+zones.">Over half the hair cells in the mouse utricle first appear after birth, with significant numbers originating from early postnatal mitotic production in peripheral and striolar growth zones.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 13 (5), 609-627 (2012).</li><li>Collado, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+postnatal+accumulation+of+junctional+E-cadherin+is+inversely+correlated+with+the+capacity+for+supporting+cells+to+convert+directly+into+sensory+hair+cells+in+mammalian+balance+organs.">The postnatal accumulation of junctional E-cadherin is inversely correlated with the capacity for supporting cells to convert directly into sensory hair cells in mammalian balance organs.</a> J Neurosci. 31 (33), 11855-11866 (2011).</li><li>Meyers, J. R., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape+change+controls+supporting+cell+proliferation+in+lesioned+mammalian+balance+epithelium.">Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium.</a> J Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).</li><li>Gratton, M. A., Rao, V. H., Meehan, D. T., Askew, C., Cosgrove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+dysregulation+in+the+stria+vascularis+of+mice+with+Alport+syndrome:+implications+for+capillary+basement+membrane+pathology.">Matrix metalloproteinase dysregulation in the stria vascularis of mice with Alport syndrome: implications for capillary basement membrane pathology.</a> Am J Pathol. 166 (5), 1465-1474 (2005).</li></ol>

<html> Hay varios pasos críticos para el éxito de la disección de todo el montaje y la inmunotinción. Sin embargo antes de que cualquiera de estos métodos se llevan a cabo, se requiere la fijación adecuada del tejido coclear. Recomendamos el uso de metanol libre, ultra-pura, EM grado PFA. PFA hecha de polvo puede tener trazas de metanol y un pH inestable que disminuye la calidad de inmunofluorescencia. Otros grupos también han demostrado que las disecciones similares son posibles utilizando fijadores que no contie...

La cóclea en forma de espiral del oído interno, contenida dentro del hueso temporal, alberga el órgano de Corti, el órgano final sensorial auditiva en mamíferos. La cóclea está tonotópicamente organizado y comúnmente dividido en apical, media y basal turnos correspondientes a diferentes regiones de frecuencia con detección de sonido de alta frecuencia en la base y detección de baja frecuencia en el vértice 1. Las células ciliadas, las células mechanosensory del órgano de Corti, corren a lo largo de la cóclea, que es de aproximadamente 6 mm de largo en ratones 2,3. Estas células convierten la energía mecánica de las ondas de sonido, que se transmiten a través del laberinto membranoso lleno de líquido, en señales neurales que son procesados ​​por las estructuras auditivas centrales. La técnica descrita aquí proporciona un método para preparar preparaciones completas de órgano de Corti después de la calcificación de la cóclea es completa (para las muestras que van desde una semana de edad hasta la edad adulta). También presentamos un método para immunostacaniza todo ello montado tejido coclear. Preparaciones completas cocleares son cruciales para la visualización de todas las células del cabello y que rodea las células de apoyo en sus disposiciones espaciales naturales y permiten el análisis en tres dimensiones con el uso de la microscopía confocal. Drs. Hans Engstrom y Harlow Ades describen originalmente montar todo un método de disección coclear en 1966. Se detallan a una técnica para fijar rápidamente y diseccionar cochleae calcificado sumergido en líquido de una variedad de mamíferos, conservando intactas segmentos cortos del órgano de Corti para el análisis microscópico 4. La disección de un sin fijar, cóclea rata calcificada también se ha ilustrado en un video instructivo 5. Drs. Barbara Bohne y Gary Harding de la Universidad de Washington hicieron varias modificaciones importantes a este método. En su versión del método de montaje en toda coclear, el hueso temporal fue descalcificada, incrustado en plástico y cinco medias vueltas o diez cuartos de vueltas fueron disecciónted 6,7. Dr. Charles Liberman y sus colegas de Eaton Peabody laboratorios, Massachusetts ojo y Ear Infirmary, modificaron esta técnica por lo que no se requiere que la incrustación de plástico 8. Además modificación de la técnica se produjo en el laboratorio del Dr. Jian Zuo en el Hospital de Investigación Infantil St. Jude 9-12 que informó al método de disección que aquí se presenta. Utilizamos una estrategia diferente para acceder al órgano de Corti que Bohne y Liberman, que permite el aislamiento de apical completa, media y vueltas basales. Así, el tejido diseccionado es más grande y menos probabilidades de ser perdido o dañado durante el proceso de disección o de inmunotinción. Además, el método actual facilita la medición de la distancia desde la punta apical o basal gancho para identificar una región de frecuencia. Aunque muchos laboratorios realizan inmunotinción del tejido coclear, no está claro dónde se originó este método. Como resultado de ello hay varias recetas para el bloqueo de buffers y tampones de incubación de anticuerpos que pueden afectar el desempeño de los anticuerpos primarios individuales. A continuación, presentamos un método para inmunotinción con anticuerpos marcados con fluorescencia que es aplicable a los anticuerpos más comúnmente utilizados en el campo auditivo. La forma compleja de la cóclea, delicada estructura del órgano de Corti, y encajamiento ósea proporcionan un desafío para el análisis histológico y bioquímico. Una variedad de técnicas se utilizan actualmente en el campo de audición para superar estas características difíciles y visualizar las células dentro del órgano de Corti, cada técnica con sus propias ventajas y desventajas. El protocolo que aquí se presenta permite la disección para el conjunto de montaje de la cóclea del ratón adulto y, con una ligera modificación, potencialmente se puede utilizar para examinar las estructuras críticas dentro de las cócleas de una variedad de otros organismos modelo utilizados en el campo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1074">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:377px;">Standard&#160; pattern forceps</td>
			<td style="width:139px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:163px;">11000-12</td>
			<td style="width:395px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">10.5 cm fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-11</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>AVSS2000</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;">16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>18814</td>
			<td style="width:395px;">TOXIC --wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS pH 7.4&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP118-500</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">end-over-end tube rotator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-450-127</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 mm petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-202-037</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">activated charcoal</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC134372500</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">stereo dissection microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #4 jeweler&#39;s forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11241-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5 jeweler&#39;s forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2.5 mm Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15001-08</td>
			<td>curved&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mm Vannas-Tubingen spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15003-08</td>
			<td>straight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">48 well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772-52</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8 well chamber slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1256518</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-500</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA, fraction V</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1605</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NGS</td>
			<td>Vector labs</td>
			<td>S-1000</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NHS</td>
			<td>Vector labs</td>
			<td>S-2000</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3D rotator</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>R3D-710</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Western blot incubation box XL</td>
			<td>Licor</td>
			<td>929-97401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;">Prolong gold antifade mounting media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36930</td>
			<td style="width:395px;">can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost Plus Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">coverslips 22 x 22 x 1</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-548-B</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">clear nail polish</td>
			<td>Local drug store</td>
			<td></td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cardboard slide folder</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-587-10</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">plastic slide box</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-448-10</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

Se presenta un método para aislar el órgano de Corti como tres vueltas intactas cocleares (ápice, medio y base) a partir de tejido coclear que está calcificada, con escalones de disección clave presentados en la Figura 1. Durante la primera semana postnatal del desarrollo, la calcificación de la cóclea del ratón es incompleta y un método de disección más simple puede ser utilizado 13. Utilizando el método de disección neonatal tod...

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Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Se presenta un método para aislar el órgano de Corti adultos como tres vueltas intactas cocleares (ápice, medio y de base). También demostramos un procedimiento de inmunotinción con anticuerpos marcados con fluorescencia. En conjunto, estas técnicas permiten el estudio de las células ciliadas, células de soporte, y otros tipos de células que se encuentra en la cóclea.

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