Name: an elisa based binding and competition method to rapidly determine ligand-receptor interactions
Uploaded: 2016-03-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An ELISA Based Binding and Competition Method to Rapidly Determine Ligand-receptor Interactions at JoVE.com

We thank Prof. J. Stelling (Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich and Swiss Institute for Bioinformatics, Basel, Switzerland) for his critical review of the manuscript.

1. إعداد الكاشف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد عازلة طلاء كربونات، ويحل 0.36 ز نا 2 CO 3 و 0.84 غرام NaHCO 3 في 100 مل من الماء المقطر. تصفية العقيمة المخزن المؤقت باستخدام فراغ مدفوعة 0.22 ميكرون polyethersulfone (PES) غشاء تصفية وتخزينها في RT حتى ا...

<ol>
	<li>Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+and+techniques+to+study+ligand-receptor+interactions+and+receptor+activation+by+TNF+superfamily+members.">Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members.</a> Methods in enzymology. 545, 103-125 (2014).</li><li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensor+analysis+of+anti-citrullinated+protein/peptide+antibody+affinity.">Biosensor analysis of anti-citrullinated protein/peptide antibody affinity.</a> Analytical biochemistry. 465, 96-101 (2014).</li><li>van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell-adhesion+molecule+interactions+using+surface+plasmon+resonance.">Analysis of cell-adhesion molecule interactions using surface plasmon resonance.</a> Curr Opin Immunol. 8, 257-261 (1996).</li><li>Egli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-28B+is+a+key+regulator+of+B-+and+T-cell+vaccine+responses+against+influenza.">IL-28B is a key regulator of B- and T-cell vaccine responses against influenza.</a> PLoS Pathog. 10, e1004556 (2014).</li><li>Rosenbluh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positively+charged+peptides+can+interact+with+each+other,+as+revealed+by+solid+phase+binding+assays.">Positively charged peptides can interact with each other, as revealed by solid phase binding assays.</a> Analytical biochemistry. 352, 157-168 (2006).</li><li>Goutelle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hill+equation:+a+review+of+its+capabilities+in+pharmacological+modelling.">The Hill equation: a review of its capabilities in pharmacological modelling.</a> Fundamental &amp; clinical pharmacology. 22, 633-648 (2008).</li><li>Levin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptides+derived+from+HIV-1+integrase+that+bind+Rev+stimulate+viral+genome+integration.">Peptides derived from HIV-1 integrase that bind Rev stimulate viral genome integration.</a> PLoS One. 4, e4155 (2009).</li><li>Egli, A., Santer, M. D., O'Shea, D., Tyrrell, D. L., Houghton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+the+interferon-lambda+family+on+the+innate+and+adaptive+immune+response+to+viral+infections.">The impact of the interferon-lambda family on the innate and adaptive immune response to viral infections.</a> Emerging infectious diseases. , e51 (2014).</li><li>Gad, H. H., Hamming, O. J., Hartmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+human+interferon+lambda+and+what+it+has+taught+us.">The structure of human interferon lambda and what it has taught us.</a> J Interferon Cytokine Res. 30, 565-571 (2010).</li><li>Folch, B., Rooman, M., Dehouck, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermostability+of+salt+bridges+versus+hydrophobic+interactions+in+proteins+probed+by+statistical+potentials.">Thermostability of salt bridges versus hydrophobic interactions in proteins probed by statistical potentials.</a> Journal of chemical information and modeling. 48, 119-127 (2008).</li><li>Yuzlenko, O., Lazaridis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+ionizable+amino+acid+side+chains+at+a+lipid+bilayer-water+interface.">Interactions between ionizable amino acid side chains at a lipid bilayer-water interface.</a> The journal of physical chemistry. B. 115, 13674-13684 (2011).</li><li>Tissot, A. C., Vuilleumier, S., Fersht, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+two+buried+salt+bridges+in+the+stability+and+folding+pathway+of+barnase.">Importance of two buried salt bridges in the stability and folding pathway of barnase.</a> Biochemistry. 35, 6786-6794 (1996).</li></ol>

إليسا هو المعيار وطريقة راسخة للعديد من المختبرات. لقد مزيد من التعديل وتحسين طريقة 5،7 المنشورة سابقا. ويبين أثبتت بروتوكول خطوة بخطوة كيف يمكن استخدامها في طريقة بسيطة لتحديد القيم K D التفاعلات يجند مستقبلات. بالإضافة إلى ذلك، IC50 من الببتيد الحجب الذي ي?...

فهم شامل للمسارات إشارات يتطلب معرفة تفصيلية عن التفاعل يجند مستقبلات. معظم وسائل لتقييم تفاعل يجند خاص مع مستقبلات معينة لها مكلفة ومستهلكة للوقت والعمل مكثفة وتتطلب معدات وخبرات 1 محددة. توضح هذه المقالة بروتوكولين سريعة وموثوق بها نقطة بنقطة للتحقيق التفاعل يجند مستقبلات بناء على انزيم مرتبط المناعي فحص (ELISA): ومباشر يجند مستقبلات التفاعل فحص (جيش الرب للمقاومة) وجيش الرب للمقاومة المنافسة. إليسا هي تقنية حساسة للغاية ومحددة ومتاحة بسهولة، وتستخدم بشكل روتيني في مختبر تقريبا. إليسا لا يمكن أن يؤديها وتكييفها في الموضات المختلفة. يتم تحسين البروتوكولات المعروضة للتحقيق التفاعل بين إنترفيرون مختلفة امدا (INFLs) ومستقبلات بهم. جيش الرب للمقاومة المباشر يسمح لquantificatiعلى من يجند مستقبلات ملزمة فيما يتعلق تركيز يجند وبالتالي ينتج منحنى ملزم. باستخدام نموذج مناسب للتفاعل يجند مستقبلات، البيانات يمكن تحليلها لتقدير ثابت التفكك (K D). في بروتوكول المعروضة، يتم تطبيق هيل المعادلة التي يشيع استخدامها في تصميم نموذج ليجند مستقبلات ملزمة. رغم أن هناك طرقا أخرى مثل تكنولوجيا الرنين مأكل سطح 2،3 تسمح تحديد الانتماءات الملزمة بين اثنين من البروتينات، وهذه التكنولوجيا هي في كثير من الأحيان كثيفة العمالة، ومكلفة، وتتطلب معدات المختبرات الخاصة. جيش الرب للمقاومة المنافسة يمكن فحص الببتيد المثبطة: كميا ويجند مستقبلات ملزم فيما يتعلق تركيز الببتيد. هذا ينتج منحنى الاستجابة للجرعة واصفا تأثير كابح من الببتيد. البيانات يمكن تحليلها لتقدير نصف تركيز مثبط القصوى (IC 50 </فرعية&gt;) من الببتيد حظر. كلا البروتوكولين إليسا هي سهلة الاستخدام، ويمكن أن تتكيف مع مجموعة واسعة من الأسئلة البحثية. البروتينات المؤتلف من أي نوع يمكن استخدامها لتحديد موثوق وسريع الأجزاء التفاعل. وبالإضافة إلى ذلك، جيش الرب للمقاومة المنافسة يمكن استخدامها لتحديد مواقع التفاعل تنتقد بروابط ومستقبلات باستخدام منع الببتيدات، والتي صممت لتحاكي إما يجند أو مستقبلات. إذا أظهر الببتيد عرقلة وتثبيط فعالية ومحددة، الببتيد يحتل موقعا حاسما تفاعل يجند (إذا كان يقلد الببتيد مستقبلات) أو من يجند (إذا كان يقلد الببتيد يجند). يصف البروتوكول الأول تحديد K D قيمة INFLs مختلفة والوحيدات ألفا من المستقبلات الخاصة بهم، أي مستقبلات انترلوكين 28 (IL28RA) باستخدام جيش الرب للمقاومة المباشر. بعد ذلك، يوضح البروتوكول الثاني كيفية تحديد قدرة الببتيد 20 الأحماض الأمينية طويلا لتمنع التفاعلات INFL-IL28RA. تم تصميم الببتيد للتنافس مع IFNLs في موقع مستقبلات تجليدها وبالتالي يمكن فهم الجزيئي للتفاعل. وعلاوة على ذلك، وهذا الببتيد يمكن استخدامها لمنع IL28RA في تجارب في المختبر لتحديد تأثير ذلك على آثار يشير المصب 4.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="901">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp)</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">442404</td>
			<td style="width:359px;">ELISA plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Sodium carbonate (Na2CO3)</td>
			<td style="width:164px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">497-19-8</td>
			<td>For ELISA plate coating buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3)</td>
			<td style="width:164px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">144-55-8</td>
			<td>For ELISA plate coating buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A7030-100G</td>
			<td>5% BSA in PBS for Blocking</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">rhIL-28R&#945;/IFN&#955;R1</td>
			<td style="width:164px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:119px;">5260-MR</td>
			<td>Recombinant human interlukin-28 Receptor alpha</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">rhIL-29/IFN&#955;1</td>
			<td style="width:164px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:119px;">1598-IL/CF</td>
			<td>Recombinant human interlukin-29/Carrier free/C-terminal 10-His tag</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">rhIL-28A/IFN&#955;2</td>
			<td style="width:164px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:119px;">1587-IL/CF</td>
			<td>Recombinant human interlukin-28A/Carrier free/C-terminal 6-His tag</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">rhIL-28B/IFN&#955;3</td>
			<td style="width:164px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:119px;">5259-IL/CF</td>
			<td>Recombinant human interlukin-28B/Carrier free/C-terminal 6-His tag</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">6X His Monoclonal antibody (Mouse)</td>
			<td style="width:164px;">Clontech</td>
			<td style="width:119px;">631212</td>
			<td>Primary antiboy to capture His tagged Ligands</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Goat anti-Mouse igG (H+L)</td>
			<td style="width:164px;">Jackson Immuno Research</td>
			<td style="width:119px;">115-035-166</td>
			<td>Horseradish Peroxidase conjucated secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">BDoptEIA TMB reagent set</td>
			<td style="width:164px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">555214</td>
			<td>ELISA - TMB substrate solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Sulfuric acid (H2SO4)</td>
			<td style="width:164px;">Fulka</td>
			<td style="width:119px;">84720</td>
			<td>5N H2SO4 (Enzyme reaction stop solution)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Synergy/H1 - Microplate reader</td>
			<td style="width:164px;">BioTeK</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>ELISA plate reader</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an elisa based binding and competition method to rapidly determine ligand-receptor interactions

A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and reliable point-by-point protocols of enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for the investigation of ligand-receptor interactions: the direct ligand-receptor interaction assay (LRA) and the competition LRA. As a case study, the ELISA based analysis of the interaction between different lambda interferons (IFNLs) and the alpha subunit of their receptor (IL28RA) is presented: the direct LRA is used for the determination of dissociation constants (KD values) between receptor and IFN ligands, and the competition LRA for the determination of the inhibitory capacity of an oligopeptide, which was designed to compete with the IFNLs at their receptor binding site. Analytical steps to estimate KD and half maximal inhibitory concentration (IC50) values are described. Finally, the discussion highlights advantages and disadvantages of the presented method and how the results enable a better molecular understanding of ligand-receptor interactions.

تم تحديد ثوابت التفكك بين INFL1-3 وعلى مستقبلات ألفا فرعية IL28RA باستخدام جيش الرب للمقاومة المباشر. وتظهر النتائج في الشكل (3): يتم رسم جزء من مواقع الربط المحتلة ضد لوغاريتم تركيز الإنترفيرون منها. ويظهر المؤامرة سكاتشارد البيانات في أسفل الزا?...

Watch this Scientific Journal Video about An ELISA Based Binding and Competition Method to Rapidly Determine Ligand-receptor Interactions at JoVE.com

An ELISA Based Binding and Competition Method to Rapidly Determine Ligand-receptor Interactions

The presented protocols describe two enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based techniques for the rapid investigation of ligand-receptor interactions: The first assay allows the determination of dissociation constant between ligand and receptor. The second assay enables a rapid screening of blocking peptides for ligand-receptor interactions.

إليسا القائم وتجليد وأسلوب المنافسة لتحديد بسرعة التفاعلات يجند مستقبلات

A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations

ابفيف تعمل مقياس التناضح نانولتر رواية للتحقيقات الجليد بروتين ملزمة

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition ...

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

تحديد الطائرات الملزمة للجليد من البروتينات المضادة للتجمد من قبل تقارب طائرة الجليد القائم على الفلورسينس

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

كتلة الطيفية المداخل لدراسة بنية البروتين والتفاعلات في مساحيق المجففة بالتبريد

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

A 'Plug and Play' Method to Create Water-dispersible Nanoassemblies Containing an Amphiphilic Polymer, Organic Dyes and Upconverting Nanoparticles

A الأسلوب &#39;التوصيل والتشغيل&#39; لإنشاء Nanoassemblies التشتت المياه التي تحتوي على محبة للجهتين البوليمر، الأصباغ العضوية وتحويله النانوية

In this protocol, we first describe a procedure to synthesize lanthanide doped upconverting nanoparticles (UCNPs). We then demonstrate how to generate ...

Cooling Rate Dependent Ellipsometry Measurements to Determine the Dynamics of Thin Glassy Films

تبريد أسعار التابعة القياسات Ellipsometry لتحديد ديناميات رقيقة زجاجية أفلام

This report aims to fully describe the experimental technique of using ellipsometry for cooling rate dependent Tg (CR-Tg) experiments. These measurements ...

Anionic Polymerization of an Amphiphilic Copolymer for Preparation of Block Copolymer Micelles Stabilized by &#960;-&#960; Stacking Interactions

Anionic Polymerization of an Amphiphilic Copolymer for Preparation of Block Copolymer Micelles Stabilized by ÃƒÆ’Ã‚ÂÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬-ÃƒÆ’Ã‚ÂÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ Stacking Interactions

أنيونية البلمرة من كوبوليمر محبة للجهتين لإعداد كتلة كوبوليمر المذيلات استقرت بواسطة تفاعلات التراص π-π

In this study, an amphiphilic copolymer that includes a core-forming block with phenyl groups was synthesized by living anionic polymerization of phenyl ...

An Aptamer-based Sensor for Unchelated Gadolinium(III)

An Aptamer-based Sensor for Unchelated GadoliniumIII

والاستشعار القائمة على أبتمر لUnchelated الجادولينيوم (III)

A method for determining the presence of unchelated trivalent gadolinium ion (Gd3+) in aqueous solution is demonstrated. Gd3+ is often present in samples ...

Phthalic Acid Ester-Binding DNA Aptamer Selection, Characterization, and Application to an Electrochemical Aptasensor

اختيار ابتمر الحمض النووي ملزم إستر حامض فثاليك وتوصيف وتطبيق أبتاسينسور الكهروكيميائية

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the ...

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

الحمض النووي-المغناطيسي الجسيمات ربط التحليل بتشتت الضوء الديناميكي والغرواني الكهربي

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

An Efficient Sample Preparation Method to Enhance Carbohydrate Ion Signals in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry

أسلوب إعداد نموذج فعال لتعزيز الإشارات أيون الكربوهيدرات في مصفوفة-بمساعدة الليزر الامتزاز/التأين الكتلي

Sample preparation is a critical process in mass spectrometry (MS) analysis of carbohydrates. Although matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) ...