Name: generating a &#34;humanized&#34; drosophila s2 cell line sensitive to pharmacological inhibition of kinesin-5
Uploaded: 2016-01-20T15:00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5 at JoVE.com

ברצוננו להודות לפטרישיה Wadsworth על המתנה של מבנה kinesin-5. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH (5 R01 GM107026) לTJM ועל ידי מענק מחקר מס &#39;5-FY13-205 מהמצעד הפרוטות קרן לTJM, כמו גם תמיכה מקרן צ&#39;רלס ה&#39; הוד, Inc, בוסטון, מסצ&#39;וסטס. לTJM

1. תאי transfecting S2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מ25 סנטימטר 2 בקבוק תרבית בעבר, להוסיף GFP-להביע טובולין α תאי S2 10 עד נפח סופי של 2 מיליליטר ב 100% confluency, ולאפשר להם חצי לדבוק בתחתית צלחת תרבית רקמת 35 מ&quot;מ ל כ 1 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה מהצלחת. Transfect 2 מיקרוגרם של Eg5-mCherry לבנות 11 עם 1 מיליליטר של התקשורת של שניידר בתוספת 10% FBS (המכונה להלן בתקשורת של שניידר) וTransfection מגיב, בעקבות הפרוטוקול של היצרן. לאטום את הצלחת עם Parafilm ו דגירה תאים ב 25 מעלות צלזיוס במשך 16-18 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של התקשורת של שניידר. חזור תאים 25 ° C חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3 לאחר transfection, להעביר 500 μl של תאי transfected לתוך צלחת תרבית רקמה חדשה 35 מ&quot;מ המכילה 1.5 מיליליטר של התקשורת של שניידר לאינדוקצית מבחן. לגרום לביטוי של Eg5-mCherry על ידי הוספת 4 CuSO </sub&gt; לריכוז סופי של 500 מיקרומטר. חותם את הצלחת בParafilm ולדגור על 25 מעלות CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslip כדי להפוך coverslips מצופה concanavalin, מספיק נפח פיפטה של concanavalin פתרון (0.5 מ&quot;ג / מיליליטר מומס בH 2 O) למעייל חומצה שטפה, להסיר את העודפים, ולאפשר את coverslip לייבוש באוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים coverslip מצופה concanavalin x 22 מ&quot;מ 22 מ&quot;מ בצלחת תרבית רקמת 35 מ&quot;מ נקייה, אז זרע 500 μl ב 100% confluency של התאים המושרה על coverslip ולאפשר לתאים לדבוק במשך שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבדוק לביטוי Eg5-mCherry, להרכיב את coverslip לתא ורד (או כלי הדמיה מתאימים) עם תקשורת להדמיה ב RT על מיקרוסקופ פלואורסצנטי. שימוש במקורות אור מתאימים ומערכות סינון לדמיין את התאים. לדוגמא, יש מיקרוסקופ השתמש במחקר זה מקור LED לבן אור וEGFP (FITC / Cy2) וDsRed (TRITC / Cy3) קוביות מסנן. Eg5-mCherry localizes לmicrotubules ומועשר Neaקטבי כישור r. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שווידאת כי התאים מביעים שתי Eg5-mCherry וGFP-α-טובולין, להעביר את שארית תאי transfected, uninduced לבקבוק תרבות 2 רקמה 25 סנטימטרים המכיל 4 מיליליטר של התקשורת של שניידר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף Blasticidin S HCL בריכוז סופי של 25 מיקרוגרם / מיליליטר לבקבוק של תאי transfected ולהמשיך פיצול בנוכחות של 25 מיקרוגרם / מיליליטר Blasticidin S HCl עד המוות של תאים מפסיק להיות בטוח כדי לבדוק ביטוי של Eg5-mCherry מעת לעת. דגירה שורות תאים ב 25 מעלות צלזיוס חממה. הערה: אחוז התאים לבטא עליות Eg5-mCherry לאורך זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שתאי transfected ביציבות, תמשיך לפצל בהעדר התרופה ולהקפיא 12 תאים לשימוש עתידי. </li></ol> הפרעת 2. RNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR להגביר אזור נ&quot;ב ~ 500 של Klp61F מcDNA (LD15641) באמצעות פריימר עם רצף הוסיף אמרגן T7 (רצף שנקבע בחומרי רשימה) להיותמשמש כתבנית לסינתזת dsRNA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את ארבע תגובות PCR, 50 μl כל, המכילות DNA של תבנית 100 ng, 25 מיקרומטר של כל צבע יסוד, מאגר מתאים, ופולימראז. הגדר את פרוטוקול ה- PCR על thermocycler על פי הפרוטוקול של היצרן של פולימראז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכה וארבע תגובות נקיות PCR באמצעות PCR לנקות ערכה על פי הפרוטוקול של היצרן. אחסן את התבנית נקייה ב -20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן RNA גדילים הכפול (dsRNA) מתבנית בעזרת ערכת שעתוק RNA T7, הבאים להוראות היצרן. מצפה ~ ריכוז 5-15 מ&quot;ג / מיליליטר של dsRNA. אחסן dsRNA ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למציאת Klp61F עם dsRNA, מאפשר לתאים S2 להביע Eg5-mCherry בconfluency 25% ללמחצה לדבוק בתחתית צלחת תרבית רקמת 35 מ&quot;מ לשעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה מהמנות ולהוסיף 5 מיקרוגרם של dsRNA נגד Klp61F (דרוזופילה kinesin-5) מדולל ל1 מיליליטר של שניידר סרום ללא &#39;תקשורת של. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על RT עבור שעה 1, ולאחר מכן להוסיף 1 מיליליטר של התקשורת של שניידר עם 10% FBS. דגירה תאים ב 25 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות לאחר טיפול dsRNA, לגרום לביטוי של Eg5-mCherry על ידי הוספת 4 CuSO לריכוז סופי של 500 מיקרומטר. דגירה תאים ב 25 מעלות צלזיוס במשך שעה עוד 24. </li></ol> 3. הדמיה של תא חי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 22 מ&quot;מ x 22 מ&quot;מ concanavalin coverslip מצופה לתוך צלחת תרבית רקמת 35 מ&quot;מ נקייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 500 μl של התאים שטופלו בdsRNA ומושרה O / N על coverslip המצופה concanavalin ולאפשר להם לדבוק כ 1 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את coverslip לתא ורד (או כלי מתאים) להדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את תאי mitotic להביע שתי Eg5-mCherry וGFP-α-טובולין. הערה: תאי mitotic להביע GFP-α-טובולין רק צריך צירים monopolar מאז Klp61F, אשר נדרש לדו-קוטבי ציר, הוא הפיל 10,13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף תמונות של צירים דו קוטביים (למשל, 1 מסגרת לדקה) זמן לשגות בתאים המבטאים את שני Eg5-mCherry וGFP-α-טובולין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד הדמיה, להסיר את המדיה מתא הוורד, ולהחליף אותו בתקשורת של שניידר מכילה STLC 1 מיקרומטר מעל 3 חילופים רצופים תקשורת (~ 5 מיליליטר סה&quot;כ) לתוך התא לדמיין קריסת ציר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכישלון התרופה ולהפוך את קריסת הציר, להסיר בזהירות את התקשורת המכילה STLC מתא הוורד, ולשטוף בתקשורת של שניידר 4x (סה&quot;כ 6-8 מיליליטר) לפני מילוי תא הוורד בפעם האחרונה עם תקשורת טרי. תמשיך הדמיה. </li></ol> Assay תיקון 4. שגיאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 22 מ&quot;מ x 22 מ&quot;מ concanavalin coverslips מצופה לתרבות מנות רקמה 35 מ&quot;מ נקיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 500 μl של תאים שטופלו בKlp61F dsRNA על coverslip המצופה concanavalin ולאפשר להם לדבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תאי adherאד, להוסיף 1.5 מיליליטר של התקשורת של שניידר לכל מנה להביא את הנפח הסופי עד 2 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעצור את התאים במיטוזה, להוסיף MG132 לריכוז סופי של 10 מיקרומטר לכל אחד מהכלים, ודגירה עבור שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף STLC 1 מיקרומטר דגירה עבור שעה 1 כדי לאפשר ליצירת מונופולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את STLC על ידי שטיפת coverslips פי 3 עם 2 מיליליטר של התקשורת של שניידר הטרי בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה coverslips עם התקשורת של שניידר, בנוסף לכל תרופות תרופתיות (למשל, מעכבי קינאז אורורה) או DMSO כביקורת. הערה: ריכוזי מונעי להשתנות וריכוזים סופיים נכונים צריכים להיקבע על ידי הנסיין. פתרונות מניות נעשים בדרך כלל כזה שהמעכב מדולל 1: 1,000 לתקשורת. במקרה זה דילול 1: 1000 של DMSO (או ממס מתאים) משמש כשליטה ברכב. אנו משתמשים ב מעכב אורורה Binucleine 2 בריכוז סופי של 40 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן תאי T בנקודתי זמן שונהo לבחון את ההתקדמות של היווצרות ציר דו קוטבית ולהעריך מדינות מצורפים kinetochore. לתקן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהירות לשטוף את coverslips עם 2 מיליליטר של 1x BRB-80. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן תאים על ידי הוספת 2 מיליליטר של paraformaldehyde 10% בדילול מלא 1x BRB-80 במשך 10 דקות. paraformaldehyde Pipet זהירות במנדף כימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize תאים עם 2 מיליליטר של 1x PBS + 1% Triton-X במשך 8 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות 3x עם 2 מיליליטר של 1x PBS + 0.1% Triton-X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת coverslips תא-צד עם הפנים כלפי מעלה על גבי גיליון של Parafilm (השתמש סמן כדי לתייג Parafilm כראוי כדי לעקוב אחר השקופיות) בצלחת פטרי 150 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכסות את coverslips עם 150 סרום μl מבושל חמור (BDS) ולדגור על RT עבור שעה 1 לחסום נוגדן שאינו ספציפי מחייב. שימו לב: כאן, פרוטוקול הקיבעון ניתן לעצור המשיך להיות בשלב מאוחר יותר. ניתן לאחסן coverslips בתא לחות על 4 מעלות צלזיוס עד 24 שעות. כדי להפוך את תא הלחות, בשורה על שפת צלחת 150 מ&quot;מעם מעבדה רטובה לנגב ומכסה במכסת צלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בלוק, ודגירת coverslips עבור שעה 1 ב RT עם 150 μl של נוגדנים עיקריים מדולל כראוי בBDS להכתים לkinetochores וmicrotubules לריכוזים סופיים של 2 מיקרוגרם / מיליליטר (או על פי המלצות יצרן) ו 1 מיקרוגרם / מיליליטר, בהתאמה . שימו לב: כאן, פרוטוקול הקיבעון ניתן לעצור המשיך להיות בשלב מאוחר יותר. ניתן לאחסן coverslips בתא לחות על 4 מעלות צלזיוס עד 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף coverslips 3x עם 500 μl של 1x PBS + 0.1% Triton-X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה coverslips במשך 30-60 דקות ב RT עם נוגדני fluorophore מצומדות המתאימים המשניים המדולל בBDS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף coverslips 3x עם 500 μl של 1x PBS + 0.1% Triton-X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה coverslips עם 150 μl של ה- BDS המכיל 1 מיקרוגרם / מיליליטר DAPI ריכוז סופי למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף coverslips 2x עם 1x PBS + 0.1% Triton-X, והר גoverslips צד תא על שקופית 3x1 &quot;עם 8 μl של ההרכבה תקשורת. צבע הפינות עם לק כדי לשתק את coverslips על גבי שקופיות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי תמונה עם צירים דו קוטביים שמביעים Eg5-mCherry. קח סדרת Z בהיקף של 30 מטוסים במרווחים 0.2 מיקרומטר בכל הערוצים באמצעות מטרת 100X. לנתח בזהירות את kinetochores וmicrotubules כדי לקבוע את המדינות מצורפים (bioriented או קבצים מצורפים syntelic). </li></ol>

<ol>
	<li>Cheeseman, I. M., Desai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+kinetochore-microtubule+interface.">Molecular architecture of the kinetochore-microtubule interface.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 33-46 (2008).</li><li>Maresca, T. J., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Welcome+to+a+new+kind+of+tension:+translating+kinetochore+mechanics+into+a+wait-anaphase+signal.">Welcome to a new kind of tension: translating kinetochore mechanics into a wait-anaphase signal.</a> J Cell Sci. 123, 825-835 (2010).</li><li>Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+kinetochore+tracking+reveals+error-prone+homologous+chromosome+biorientation+in+mammalian+oocytes.">Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes.</a> Cell. 146, 568-581 (2011).</li><li>Cimini, D., Wan, X., Hirel, C. B., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora+kinase+promotes+turnover+of+kinetochore+microtubules+to+reduce+chromosome+segregation+errors.">Aurora kinase promotes turnover of kinetochore microtubules to reduce chromosome segregation errors.</a> Curr Biol. 16, 1711-1718 (2006).</li><li>Lampson, M. A., Renduchitala, K., Khodjakov, A., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correcting+improper+chromosome-spindle+attachments+during+cell+division.">Correcting improper chromosome-spindle attachments during cell division.</a> Nat Cell Biol. 6, 232-237 (2004).</li><li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster.">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).</li><li>Learman, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NSC+622124+inhibits+human+Eg5+and+other+kinesins+via+interaction+with+the+conserved+microtubule-binding+site.">NSC 622124 inhibits human Eg5 and other kinesins via interaction with the conserved microtubule-binding site.</a> Biochemistry. 48, 1754-1762 (2009).</li><li>Liu, L., Parameswaran, S., Liu, J., Kim, S., Wojcik, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop+5-directed+compounds+inhibit+chimeric+kinesin-5+motors:+implications+for+conserved+allosteric+mechanisms.">Loop 5-directed compounds inhibit chimeric kinesin-5 motors: implications for conserved allosteric mechanisms.</a> J Biol Chem. 286, 6201-6210 (2011).</li><li>Maliga, Z., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+and+mutational+analysis+of+allosteric+Eg5+inhibition+by+monastrol.">Small-molecule and mutational analysis of allosteric Eg5 inhibition by monastrol.</a> BMC Chem Biol. 6, 2 (2006).</li><li>Goshima, G., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+microtubule-based+motor+proteins+in+mitosis:+comprehensive+RNAi+analysis+in+the+Drosophila+S2+cell+line.">The roles of microtubule-based motor proteins in mitosis: comprehensive RNAi analysis in the Drosophila S2 cell line.</a> J Cell Biol. 162, 1003-1016 (2003).</li><li>Salemi, J. D., McGilvray, P. T., Maresca, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Drosophila+cell-based+error+correction+assay.">Development of a Drosophila cell-based error correction assay.</a> Front Oncol. 3, 187 (2013).</li><li>Rogers, S. L., Rogers, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Drosophila+S2+cells+and+their+use+for+RNAi-mediated+loss-of-function+studies+and+immunofluorescence+microscopy.">Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy.</a> Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).</li><li>Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+microtubule-sliding+motors+position+mitotic+centrosomes+in+Drosophila+early+embryos.">Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos.</a> Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).</li><li>Kollu, S., Bakhoum, S. F., Compton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+microtubule+dynamics+and+sliding+during+bipolar+spindle+formation+in+mammalian+cells.">Interplay of microtubule dynamics and sliding during bipolar spindle formation in mammalian cells.</a> Curr Biol. 19, 2108-2113 (2009).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346, 1258096 (2014).</li><li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering.">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157, 1262-1278 (2014).</li><li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology.">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nat Methods. 10, 957-963 (2013).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

חזותי תיקון שגיאות היא טכניקה רבת ערך כדי ללמוד את הצעדים כרוכים בתהליך תאי חשוב ומורכב זו. לשם כך, קבצים מצורפים שגויים נוצרים באמצעות מעכבים הפיכים, ותיקון שגיאות נצפה על כישלון של התרופה. assay זה היה במקור פותח באמצעות תאים בתרבית רקמת יונקים 5. עם זאת נוכחותם של מספר הגדול של kinetochores בסוגים רבים של תאי יונקים מודל מציבה אתגר בהתבוננות אירועי תיקון שגיאות בודדים. תאי תסיסנית S2 יש כמה כמו 4 זוגות של kinetochores, מה שהופך אותם שורת תאים עדיפה יותר להתבוננות תיקון שגיאות. עם זאת, חסרון עיקרי הוא שמעכבים רבים אינם יעילים בתאי תסיסנית S2. לפיכך, את היכולת ליצור שורת תאי תסיסנית S2 אנושית להביע kinesin-5 אנושיים מספקת כלי רב ערך כדי ללמוד תיקון שגיאות. למרות שתאי תסיסנית S2 יכולים להיותשורת תאים טובה יותר ללמוד תיקון שגיאות, השלבים המרובים הכרוכים בהשגת שורת התאים ודריסת גנים חיוניים מציבה כמה אתגרים לטכניקה זו. לדוגמא, יעילות transfection יכולה להיות נמוכה למדי. אם פחות מ -20% מהתאים המבטאים את Eg5-mCherry, transfection יש לחזור כתהליך הבחירה ייקח זמן רב יותר. כמו כן, אחוז תאי המבטאים שני חלבוני הניאון עלול להפחית לאורך זמן. זה ניתן להתגבר על ידי פיצול תאים בנוכחות Blasticidin S HCl וhygromycin B כדי לבחור עבור תאים לבטא Eg5-mCherry וGFP-α-טובולין, בהתאמה. כמו כן, חשוב לשים לב שיש לי תאי תסיסנית S2 orthologues לחלבונים רבים ואנושיים; לכן, זה קריטי, כדי לייעל את התנאים למציאת החלבונים אנדוגניים. תנאי מציאה אופטימליים עשויים להשתנות בסך של dsRNA ומשך טיפול. בהתחשב בהופעתה והשיפור המהיר של CRISPR-Cas9 Technologies 15-17, דור של שורת תאי תסיסנית עם גן Klp61F הוחלף על ידי Eg5 אדם מציג חלופה רבת עוצמה שהיה להתגבר על המגבלות של transfection וגישת מציאה. העבודה שלנו מוכיחה כי לטוס לאדם החלפת גן צריך להיות אפשרות מעשית במקרה זה למרות שהחומרים כימיים הדרושים כדי לעשות זאת בתאי תסיסנית S2 כרגע בשלבי פיתוח. הליך זה אינו מוגבל לEg5, אבל יכול להיות מיושם ללמוד את הפונקציה של חלבונים אחרים בעלי עניין. אם באמצעות מעכבים שהעבר הוקם כדי להיות יעיל בתאי תסיסנית S2, פרוטוקול זה יכול להיות שונה כדי ללמוד את ההשפעה הישירה של מעכבים בתאים חיים חששות לגבי השפעות היעד בלי. שורת התאים הופקה באמצעות פרוטוקול זה יכול לשמש גם בהקרנת תפוקה גבוהה מנתח לזהות תרופות פוטנציאליות מיקוד חלבונים מעורבים בתיקון שגיאות.

הפרדה שווה של הגנום בעת חלוקת תא דורשת אינטראקציות נכונות בין microtubules DNA והציר המשוכפל. Microtubules אינטראקציה פיזי עם הכרומוזומים באמצעות הרכב של חלבונים שמרכיב בcentromeres הידוע כkinetochore 1. הפצה נכונה של הכרומוזומים דורשת שkinetochores אחותם bioriented, שבו כל אחות קשורה microtubules מקורם קטבי ציר הפוכים. microtubule Kinetochore (KT-MT) קבצים מצורפים שאינם בקונפורמציה bioriented הם ערערו במהירות וביעילות כדי לספק את ההזדמנות להקים biorientation בתהליך המכונה תיקון שגיאות. Assay תיקון שגיאות שהוקם בעבר בתאי יונקים 5 דורש הרכבת צירים monopolar באמצעות מעכבי מולקולה קטנים הפיכים נגד Eg5 (kinesin-5). הטיפול התרופתי מייצר שפע של קבצים מצורפים syntelic שגויים שבבוטkinetochores אחות h לצרף לאותו מוט הציר. כישלון הבא של התרופה מאפשר להדמיה של תהליך תיקון השגיאות. Assay תיקון שגיאות יכול להיעשות בנוכחות של מעכבי מולקולה קטנים או knockdowns ללמוד את התרומה של חלבוני מועמד לתיקון קבצים מצורפים KT-MT שגויים. היכולת לדמיין תיקון שגיאות בתאים חיים היא כלי רב עוצמה כדי להבין את המנגנון המולקולרי מעורב בתהליך מורכב זה עוד יותר. עם זאת, המספר הגדול של כרומוזומים קיימים ברוב שורות תאים מציב אתגר בהתבוננות קבצים מצורפים KT-MT בודדים. תאי תסיסנית S2 יהיו אידיאליים ליישום assay תיקון שגיאות כפי שהם מכילים כמה כמו 4 כרומוזומים 6, אבל מעכבי מולקולה קטנים של kinesin 5 כגון S-trityl-L-ציסטאין (STLC) וmonastrol 7-9 אינו משפיע על הרכבה ציר או kinesin-5 תפקוד מוטורי בתאי תסיסנית. לכן אנו generaטד שורת תאי תסיסנית S2 להביע kinesin-5 האדם תחת אמרגן מושרה שהוא רגיש לkinesin-5 מעכבים. פרוטוקול זה מתאר כיצד מציאה homologue תסיסנית kinesin-5 אנדוגני, Klp61F, ולהשתמש בקו זה התא בassay תיקון שגיאות מבוססי התאים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="826">
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:221px;">Effectine Transfection Reagent</td>
			<td style="width:184px;">Qiagen</td>
			<td style="width:167px;">301425</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:221px;">Klp61F cDNA</td>
			<td style="width:184px;">Drosophila Genomic Resource Center</td>
			<td style="width:167px;">13690</td>
			<td style="width:255px;">Gene Name LD15641</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Schneider&#8217;s Media</td>
			<td style="width:184px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:167px;">21720-024</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:221px;">Fetal Bovine Serum, certified</td>
			<td style="width:184px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:167px;">10082-147</td>
			<td style="width:255px;">Heat Inactivated, US origin</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:221px;">Copper (II) Sulfate (CuSO4)</td>
			<td style="width:184px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">C8027-500G</td>
			<td style="width:255px;">500mM stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">S-trityl-l-cysteine</td>
			<td style="width:184px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">164739-5G</td>
			<td style="width:255px;">1mM stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Blasticidin HCl</td>
			<td style="width:184px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:167px;">R21001</td>
			<td style="width:255px;">5mg/ml stock in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:221px;">Hygromycin B</td>
			<td style="width:184px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:167px;">10687010</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:221px;">T7 Large scale RNA Production System</td>
			<td style="width:184px;">Promega</td>
			<td style="width:167px;">P1320</td>
			<td style="width:255px;">The approximate dsRNA concentration from each reaction is about 5-15&#181;g/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:221px;">Klp61F RNAi F primer</td>
			<td style="width:184px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:255px;">TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:221px;">Klp61F RNAi R primer</td>
			<td style="width:184px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:255px;">TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:221px;">PCR clean-up kit</td>
			<td style="width:184px;">Mo Bio Laboratories, Inc</td>
			<td style="width:167px;">1250</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:221px;">Concanavalin A</td>
			<td style="width:184px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">C5275</td>
			<td style="width:255px;">0.5mg/ml solution made by dissolving in 1xPBS.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:221px;">Boiled Donkey Serum</td>
			<td style="width:184px;">Jackson ImmunoResearch Labs</td>
			<td style="width:167px;">017-000-121</td>
			<td style="width:255px;">5% stock solution in 1X PHEM buffer, bring solution up to boil. Stored in 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:221px;">Mounting Media</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:255px;">20mM Tris pH 8.0,&#160; 0.5% N-propyl gallate, 90% Glycerol. Stored in 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">1x BRB-80</td>
			<td dir="LTR" style="width:184px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:255px;">80 mM PIPES pH 6.9; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:221px;">White Light Source</td>
			<td>Lumencor Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:221px;">ET EGFP Filter Cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td align="right">49002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:221px;">DSRed Filter Cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td align="right">49005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:221px;">anti-NDC80 antibody&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made by the Maresca Lab</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:221px;">DM1&#945; (anti-&#945;-tubulin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:221px;">anti-CID antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab10887</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating a &#34;humanized&#34; drosophila s2 cell line sensitive to pharmacological inhibition of kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper distribution of the genetic material requires that sister kinetochores on every chromosome become bioriented by attaching to microtubules from opposite spindle poles before progressing into anaphase. However, erroneous, non-bioriented attachment states are common and cellular pathways exist to both detect and correct such attachments during cell division. The process by which improper kinetochore-microtubule interactions are destabilized is referred to as error correction. To study error correction in living cells, incorrect attachments are purposely generated via chemical inhibition of kinesin-5 motor, which leads to monopolar spindle assembly, and the transition from mal-orientation to biorientation is observed following drug washout. The large number of chromosomes in many model tissue culture cell types poses a challenge in observing individual error correction events. Drosophila S2 cells are better subjects for such studies as they possess as few as 4 pairs of chromosomes. However, small molecule kinesin-5 inhibitors are ineffective against Drosophila kinesin-5 (Klp61F). Here we describe how to build a Drosophila cell line that effectively replaces Klp61F with human kinesin-5, which renders the cells sensitive to pharmacological inhibition of the motor and suitable for use in the cell-based error correction assay.

Klp61F נדרש כדי ליצור צירים דו קוטביים. Kinesin-5 האנושי, Eg5, יכול להציל את הפונקציה של Klp61F בתאי תסיסנית S2 (איור 1 א ו- D). עם תוספת של מעכב 5 kinesin (STLC), רמות microtubule הקשורים לירידה המוטורית (איור 1 ו- E), וקריסת הציר, וכתוצאה מכך מונופול (איור 1 ג וF) בתאים חסרי Klp61F אנדוגני על RNAi המוצלח (סרט נוסף 1). ראוי לציין כי צירים דו קוטביים יקרסו על תוספת של STLC בתאים אנושי S2 כי kinesin-5 פעילות אינה נדרשת לשמור על דו-קוטבי ציר בתאים אנושיים. פער זה עשוי להיות מעניין תוצאה מהבדלים בחפיפת microtubule interpolar ו / או יציבות במערכות מודל שני 14. ניתן Reve (איור 2 א ו- E) Kinesin-5 עיכוב<html> rsed על ידי שטיפה את התרופה וההתאוששות של ציר דו קוטבי ניתן בעקבות לאורך זמן. עם הסרת המעכב (איור 2 ו- F), Eg5-mCherry מחדש מקורבים עם microtubules כמרכיב ציר דו קוטבי (איור 2C ו- G), ותאים יכולים להתקדם לanaphase דו קוטבית (איור 2 ד ו H, סרט נוסף 2 ). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53594/53594fig1.jpg" /> איור 1. תוספת של STLC 1 מיקרומטר מוביל לצירי monopolar בתאי תסיסנית S2. נציג תמונות מהזמן לשגות הדמיה של תא תסיסנית S2 להביע Eg5-mCherry (AC) וה- GFP-α-טובולין (DF) בתוספת של 1 מיקרומטר STLC. Eg5 המעכב נוסף בבית 3 דקות. בר סולם = 5 מיקרומטר. חותמת = דקות: שניות.<html> &quot;Target =&quot; _ w.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig1large.jpg blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53594/53594fig2.jpg" /> איור 2. רפורמות ציר דו קוטביות עם הסרת STLC. נציג תמונות מהזמן לשגות הדמיה של תא תסיסנית 2 להביע Eg5-mCherry (AD) וה- GFP-α-טובולין (EH) במהלך ניסוי כישלון STLC. STLC היה דהוי ב5 דקות. רפורמות ציר דו קוטביות בתוך שעה 1 של הסרת STLC. בר סולם = 5 מיקרומטר. חותמת: דקות:. שניות <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="סרט 1" src="/files/ftp_upload/53594/53594mov1.jpg" /> &quot;Target =&quot; _ ww.jove.com/files/ftp_upload/53594/addin.mov blank &quot;&gt; סרט נוסף 1. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד). הדמיה הקרינה Widefield של דוגמא מייצגת של תא תסיסנית S2 להביע Eg5-mCherry ( משמאל) וה- GFP-α-טובולין (מימין). STLC 1 מיקרומטר התווסף ב -2 דקות, וצורות ציר מונופול בתוך 10 דקות לאחר תוספת של המעכב. תמונות נרכשו כל 1 דקות ושיחקו בקצב של 10 פריימים לשנייה. בר סולם = 5 מיקרומטר. <img alt="סרט 2" src="/files/ftp_upload/53594/53594mov2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53594/washout.mov" target="_blank">סרט נוסף 2. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).</a> הדמיה הקרינה Widefield של דוגמא מייצגת של תא תסיסנית S2 להביע Eg5-mCherry (משמאל) וה- GFP-α-טובולין (מימין). ומדיה המכילה STLC 1 מיקרומטר הוסרהלשטוף ב5 דקות. רפורמות ציר דו קוטביות בתוך שעה 1 של הסרת המעכב. תמונות נרכשו כל 1 דקות ושיחקו בקצב של 10 פריימים לשניה. בר סולם = 5 מיקרומטר.

Watch this Scientific Journal Video about Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5 at JoVE.com

Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

יצירה &quot;אנושי&quot;<em&gt; דרוזופילה</em&gt; S2 שורת תאים רגיש לתרופתי עיכוב של Kinesin-5

This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined.

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

Research

JoVE Journal

Biology

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

התקן Gradient מניבות Microfluidic עבור ביולוגיה של התא

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Neurocircuit מבחני עבור התקפים של אפילפסיה של מוטאנטים תסיסנית</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay

רעילות נייד של Nanogenomedicine בקו MCF-7 נייד: assay MTT

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

הכנת תסיסנית תאים S2 עבור במיקרוסקופ אור

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

מבחני גנטית תרופתי ו פונקציונלית לתפעל התחדשות של Planarian Japonica Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

השירות של שלב ספציפי אמצע לסוף<em&gt; דרוזופילה</em&gt; בידוד זקיק

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

שיטת Quantitation רגישה וספציפית לקביעת חלבון-C שרירן לב סרום הכבילה ידי Immunoassay Electrochemiluminescence

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

אברון תחבורה בתרבית<em&gt; דרוזופילה</em&gt; תאים: תא קו S2 ויסודי נוירונים.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

אסטרטגיה בקנה מידה גדולה Metabolomics רגיש, כמותי

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

אקס תרבות Vivo של דרוזופילה גלמי אשך וציסטות נבט אונליין רווק בן: Dissection, הדמיה, ותרופתי טיפול

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...