Name: bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink
Uploaded: 2016-04-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink at JoVE.com

Forfatterne takker finansiering af Defense Threat Reduction Agency (DTRA) under Space og Naval Warfare Systems center Stillehavet (SSC PACIFIC) kontrakt nr N6601-13-C-2027. Offentliggørelsen af ​​dette materiale udgør ikke godkendes af regeringen i de resultater eller konklusioner heri.

1. Hydrogel Bioink Formuleringer og forberedelse <ol><li> For at tilvejebringe vævsspecifikke biokemiske profiler, forberede vævsspecifik ECM fordøje løsninger som tidligere beskrevet for leveren. 20 Bemærk: I almindelighed vil denne ECM fordøjelse omfatte 40% af det endelige hydrogel bioink volumen, som anvendes. Flere hundrede milliliter ECM-fordøjelse opløsning kan fremstilles, alikvoteret og frosset ved -80 ° C til senere brug. </li><li> Før hydrogelformuleringen, opløse en fotoinitiat...

Der er flere, der er afgørende at overveje, når de forsøger at biofabricate 3-D væv konstruktioner, til eventuel brug i mennesker eller til in vitro-screening applikationer. Man anvender den passende cellulære bestanddele afgør ende potentielle funktionalitet, mens biofabrication selve enheden bestemmer den generelle metode til at nå enden konstruktionen. Den tredje komponent, er biomateriale, er lige så vigtigt, da det tjener dobbelte roller. Konkret skal biomateriale komponent være forenelig med båd...

I de senere år har en række forskellige teknologier bliver tilgængelige, der omhandler behovet for alternative funktionelle organer og væv ved at søge at fremstille, eller biofabricate, dem. Bioprinting har vist sig som en af ​​de mest lovende af disse teknologier. Bioprinting kan opfattes som en form for robot additiv fremstilling af biologiske dele, der kan bruges til at opbygge eller mønster levedygtig organ-lignende eller væv-lignende strukturer i 3 dimensioner. 1 I de fleste tilfælde bioprinting anvender en 3-dimensional (3 -D) udskrivning enhed, der er instrueret af en computer til at deponere celler og biomaterialer i præcise positioner og dermed den gentog anatomisk efterligne fysiologiske arkitekturer. 2 Disse enheder udskrive en &quot;bioink&quot;, der kan tage form af celle aggregater, celler indkapslet i hydrogeler eller viskose fluider eller celle-seedede mikrobærere samt cellefrie polymerer, der giver mekaniske struktur eller fungerer som cellefri placeholders. 3,4 Efter bioprinting proces, kan den resulterende struktur modnet i funktionelle væv eller organ strukturer, og anvendes til det tilsigtede endelige ansøgning. 5,6 Til dato, et komplet fuldt funktionelt menneske-størrelse organ ikke er blevet udskrevet, men det er stadig den primære langsigtede mål om bioprinting forskning og udvikling. 2 er dog i mindre målestok &quot;organoide&quot; væv konstruktioner er i øjeblikket ved at blive gennemført i en række applikationer, herunder patologi modellering, udvikling af lægemidler, og toksikologi screening. En af de vigtigste forhindringer, forskere har været forbundet med anvendelsen bioprinting teknologi er, at meget få materialer er blevet udviklet til det udtrykkelige formål bioprinting. For effektivt at lykkes bioprinting, skal et biomateriale opfylde 4 grundlæggende krav. Den biomateriale skal have 1) de relevante mekaniske egenskaber til at tillade aflejring (det være sig ekstrudering gennem en dyse som en gel eller en inkjet som en dråbe), 2) evnen til at holde sin form som en komponent af en 3-D struktur efter aflejring, 3) evnen til brugerstyring af de 2 tidligere karakteristika, og 4) en celle venlige og støttende miljø overhovedet faser af bioprinting procedure. 7 Historisk, bioprinting arbejde har ofte forsøgt at ansætte de eksisterende traditionelle biomaterialer i bioprinting enheder uden hensyn til deres forenelighed, i stedet for at designe et biomateriale at have de egenskaber, der er nødvendige for bioprinting og efterfølgende post-udskrivning applikationer. En række bioinks er blevet udviklet for nylig til en bedre grænseflade med aflejring og fabrikation hardware. Standard hydrogel systemer udgør væsentlige problemer, fordi de generelt eksistere som enten forløber flydende løsninger med utilstrækkelige mekaniske egenskaber, eller polymeriserede hydrogeler at hvis udskrevne kan tilstoppe dyserne eller bliver brudt op på ekstruderingsprocessen. Vores team, samt others, har udforsket forskellige hydrogel formuleringer til at løse disse bioprinting problemer, herunder celle klumpformet udskrivning i hydrogel substrater, 5,8 celle og filament hydrogel ekstrudering fra mikrokapillære rør, 9-11 ekstruderbare hyaluronsyre (HA) -guld nanopartikler hydrogeler med dynamiske tværbindingsegenskaberne , 12 tidsmæssige styring hydrogel stivhed under anvendelse fotopolymeriserbar methacryleret HA og gelatine, 13 fibrinogen-thrombin-baseret tværbinding, 14,15 ionbytning alginat-collagen-geler, 16 og for nylig hurtig polymeriserende ultraviolet lys (UV) -initiated tværbinding, 17 Disse eksempler viser muligheden for at generere materialer, der kan ved bioprinted effektivt. Men udover integration med hardware, at kunne generere levedygtige og funktionelle 3-D vævskonstruktioner skal biomaterialer indeholde biokemiske og mekaniske signaler at støtte i at opretholde cellulærlevedygtighed og funktion. Disse yderligere faktorer, biokemiske og mekaniske profiler, kan have en betydelig indflydelse på den vellykkede funktion bioprinted væv konstruktioner. Både celler og det native ekstracellulære matrix (ECM) er ansvarlige for at præsentere en bred vifte af signalmolekyler såsom vækstfaktorer og andre cytokiner til andre celler. Kombinationen af disse signaler varierer fra væv til væv, men kan være yderst potent og indflydelsesrige i reguleringen celler og væv opførsel. 18 Anvender vævsspecifikke ECM komponenter fra forskellige organer og gennemføre en hydrogel eller som del af en hydrogel er blevet udforsket med succes. 19-21 Denne fremgangsmåde, som består af decellularizing et givet væv, pulverisering det, og opløse den, kan anvendes til fremstilling af vævsspecifikke biokemiske signaler fra enhver væv og kan inkorporeres i 3-D hydrogel konstruktioner. 22 Derudoverdet er almindeligt dokumenteret, at væv i kroppen indtager en lang række stivheder. 23 Som sådan evnen til at tune de mekaniske egenskaber af biomaterialer, såsom elasticitetsmodul E &#39;eller snitte elasticitetsmodul G&#39;, er et nyttigt redskab til vævsmanipulering . Som beskrevet ovenfor, kontrol over bioink mekaniske egenskaber muliggør ekstrudering-baserede biofabrication med en blød gel, som derefter yderligere manipuleret af sekundær tværbinding på et senere tidspunkt, på hvilket elasticitetsmodul niveauer kan opnås, at den svarer til målorganet type. For eksempel kunne biomaterialer tilpasses til at matche en stivhed på 5-10 kPa ligesom en nativ lever, 23 eller matche en stivhed på 10-15 kPa ligesom nativ hjertevæv, 24,25 i teorien øge evnen af disse organoids til at fungere i en måde svarende til deres oprindelige væv modstykker. Indflydelsen af ​​miljømæssige stivhed på celle fænotype har været explored i de senere år, især med hensyn til stamceller. Engler et al. Viste, at substratet elasticitet hjulpet i kørsel mesenkymale stamceller (MSC) i retning slægter med væv elasticitet som matcher det af substratet. 25 Dette koncept er blevet yderligere undersøgt for differentiering til muskel, hjertefunktion, lever fænotype, hæmatopoietisk stamcelleproliferation og vedligeholdelse af stamcelle terapeutisk potentiale. 24,26-29 at kunne tune en hydrogel til forskellige elasticitetsmoduler er et vigtigt træk ved et biomateriale, der skal bruges til at biofabricate vævskonstruktioner. 30 Her beskriver vi en protokol, der repræsenterer en alsidig fremgangsmåde, der anvendes i vores laboratorium til at formulere en hydrogel, der kan ekstrudering bioprinted, og tilpasset for at 1) indeholder den biokemiske profil af en bestemt vævstype og 2) efterligner elasticitetsmodulet af denne vævstype . Ved at tage disse krav, vi sigter mod at provide et materiale, der kan rekapitulere de fysisk-kemiske og biologiske karakteristika af in vivo væv. 31. Det modulære hydrogel sammensat system beskrevet heri udnytter en multi-tværbinding tilgang til opnåelse ekstruderbare bioinks, og tillader en sekundær krydsbinding for at stabilisere og øger stivheden af slutprodukter til at matche en række vævstyper. Biokemisk tilpasning opfyldes ved hjælp af vævsspecifikke ECM komponenter. Som en demonstration, beskæftiger vi en lever-specifik række denne hydrogelsystem at bioprint funktionel lever organoide konstruktioner. Den beskrevne protokol bruger et tilpasset 3-D bioprinting enhed. Generelt kan denne protokol tilpasses til de fleste ekstrudering-baserede printere, specifikke udskrivning parametre varierer voldsomt for hver type enhed og kræver test af brugeren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="903">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hyaluronic acid</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">53747</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Gelatin</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G6144</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">410896</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:340px;">Hyaluronic acid and gelatin hydrogel kit (HyStem-HP)</td>
			<td style="width:108px;">ESI-BIO</td>
			<td style="width:119px;">GS315</td>
			<td style="width:336px;">Kit contains the components Heprasil (thiolated and heparinized hyaluronic acid), Gelin-S (thiolated gelatin), and Extralink (PEGDA)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">PEG 8-Arm Alkyne, 10 kDa</td>
			<td style="width:108px;">Creative PEGWorks</td>
			<td>PSB-887</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Primary human hepatocytes</td>
			<td style="width:108px;">Triangle Research Labs</td>
			<td>HUCPM6</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Primary human liver stellate cells</td>
			<td style="width:108px;">ScienCell</td>
			<td style="width:119px;">5300</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Primary human Kupffer cells</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">HUKCCS</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hepatocyte Basal Media (HBM)</td>
			<td style="width:108px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-3199</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:340px;">Hepatocyte Media Supplement Kit</td>
			<td style="width:108px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-3198</td>
			<td style="width:336px;">HCM SingleQuot Kits (contains ascorbic acid, 0.5mL; bovine serum albumin [fatty acid free], 10 mL; gentamicin sulfate/amphotericin B, 0.5mL; hydrocortisone 21-hemisuccinate, 0.5 mL; insulin, 0.5 mL; human recombinant epidermal growth factor, 0.5 mL; transferring, 0.5 mL)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td style="width:336px;">Other manufacturers are ok.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Ammonium hydroxide</td>
			<td style="width:108px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A669</td>
			<td style="width:336px;">Other manufacturers are ok.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Fresh porcine cadaver tissue</td>
			<td style="width:108px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Lyophilizer</td>
			<td style="width:108px;">any</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Freezer mill</td>
			<td style="width:108px;">any</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:340px;">Bioprinter</td>
			<td style="width:108px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;">The bioprinter described herein was custom built in-house. In general, other devices are adequate provided they support computer controlled extrusion-based printing of hydrogel materials.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hanging drop cell culture plate</td>
			<td style="width:108px;">InSphero</td>
			<td>CS-06-001</td>
			<td style="width:336px;">InSphero GravityPlus 3D Culture Platform</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

Når de ovenfor beskrevne procedurer følges korrekt, bør hydrogeler indeholde en biokemisk profil specifikt til målet vævstype, 20 giver mulighed for en høj grad af kontrol over bioprinting og endelig elasticitetsmodul, 34 og understøtte levedygtige funktionelle celler i vævskonstruktioner. hydrogel Tilpasning For bedst efterligner native leveren blev hydrogel bioink suppler...

Watch this Scientific Journal Video about Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink at JoVE.com

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting Cellularized Konstruerer Ved hjælp af en Tissue-specifik Hydrogel Bioink

Vi beskriver et sæt protokoller, som tilsammen giver et væv-efterlignende hydrogel bioink med hvilke funktionelle og levedygtige 3-D vævskonstruktioner kan bioprinted til anvendelse i in vitro-screening applikationer.

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

Syntese af en Intein-medieret Kunstig Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

Levedygtighed Bioprinted Cellular Konstruktioner Ved hjælp af en tre Dispenser kartesiske Printer

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting af brusk og huden væv analoger udnytter en roman passiv blanding enhed teknik for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

Pancreasvæv-afledte ekstracellulære matrix Bioink til udskrivning 3D celle-lastet pancreas væv konstruktioner

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Protokoller af 3D Bioprinting af gelatine Methacryloyl hydrogel baserede Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

Using Multilayered Hydrogel Bioink in Three-Dimensional Bioprinting for Homogeneous Cell Distribution

Brug af multilayered Hydrogel Bioink i tredimensionel bioprint til homogen cellefordeling

During the extrusion-based three-dimensional bioprinting process, liquid-like bioinks with low viscosity can protect cells from membrane damage induced by ...

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

3D Bioprinting af Murine Kortikale Astrocytter til Engineering Neural-lignende Væv

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...

Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering

Forberedelse og karakterisering af grafenbaseret 3D biohybrid hydrogel bioink til perifer neuroengineering

Peripheral neuropathies can occur as a result of axonal damage, and occasionally due to demyelinating diseases. Peripheral nerve damage is a global ...

Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting

Gelatine methacryloyl granulære hydrogelstilladser: Mikrogelfabrikation med høj kapacitet, frysetørring, kemisk samling og 3D-bioprint

The emergence of granular hydrogel scaffolds (GHS), fabricated via assembling hydrogel microparticles (HMPs), has enabled microporous scaffold formation ...

Phototunable Bioprinted Hydrogels to Probe Cellular Responses to ECM Stiffening

3D Bioprinting Phototunable Hydrogels to Study Fibroblast Activation

Understanding Chronic Lung Diseases Using 3D Printed Phototunable Hydrogels (Video) | JoVE

3D Bioprinting Phototunable Hydrogels til undersøgelse af fibroblastaktivering

Phototunable hydrogels can transform spatially and temporally in response to light exposure. Incorporating these types of biomaterials in cell-culture ...