Name: bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink
Uploaded: 2016-04-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink at JoVE.com

De auteurs dankbaar financiering door de Defense Threat Reduction Agency (DTRA) onder Space and Naval Warfare Systems Center Pacific (SSC PACIFIC) Contract No. N6601-13-C-2027 te erkennen. De publicatie van dit materiaal niet de goedkeuring door de regering van de bevindingen of conclusies hierin vormen.

1. Hydrogel Bioink formuleringen en Voorbereiding <ol><li> Om weefselspecifieke biochemische bieden bereiden weefselspecifieke ECM verteren oplossingen zoals eerder beschreven voor de lever. 20 Opmerking: In het algemeen zal deze ECM digest 40% van het uiteindelijke hydrogel bioink volume dat wordt gebruikt omvatten. Honderden ml ECM digest oplossing kan worden bereid, in porties verdeeld en ingevroren bij -80 ° C voor toekomstig gebruik. </li><li> Vóór formulering hydrogel lossen een foto-initiat...

Er zijn verschillende componenten die essentieel zijn om te overwegen wanneer u probeert om biofabricate 3-D weefsel constructies, voor eventuele toepassing bij de mens of voor in vitro screening toepassingen. Onder toepassing van de geschikte cellulaire componenten bepaalt het einde mogelijke functionaliteit, terwijl de biofabrication apparaat zelf bepaalt de algemene methode voor het bereiken van het einde construct. De derde component, het biomateriaal, is net zo belangrijk, omdat het dient dubbele rol. Spec...

In de afgelopen jaren zijn verschillende technologieën beschikbaar komen die de behoefte aan alternatieve functionele organen en weefsels richt door te trachten vervaardigen of biofabricate, hen. Bioprinting heeft ontpopt als een van de meest veelbelovende van deze technologieën. Bioprinting kan worden gezien als een vorm van robotachtige additieve vervaardiging van biologische onderdelen, die kunnen worden gebruikt voor het in patroon levensvatbare orgelachtige of weefselachtige structuren op te bouwen of in 3 dimensies. 1 Meestal bioprinting gebruik van een 3-dimensionaal (3 D) drukinrichting die wordt bestuurd door een computer om cellen en biomaterialen in specifieke posities deponeren, waardoor recapituleren anatomisch lijkende fysiologische architecturen. 2 Deze inrichtingen druk een &quot;bioink&quot;, in de vorm van cel aggregaten nemen cellen ingekapseld in hydrogels of viskeuze vloeistoffen of cel geplaatste microdragers, en celvrije polymeren die mechanische structuur of handeling verschaffen celvrije placeholders. 3,4 Na de bioprinting proces kan de resulterende structuur worden gerijpt in functionele weefsel of orgaan structuren, en worden gebruikt voor het beoogde doel applicatie. 5,6 Tot op heden, een complete volledig functionele human-sized orgel niet is afgedrukt, maar blijft de belangrijkste doelstelling op lange termijn van bioprinting onderzoek en ontwikkeling. 2 echter kleinschalige &quot;organoïde&quot; weefselconstructen momenteel in een aantal toepassingen, waaronder pathologie modellering, geneesmiddelenontwikkeling en toxicologische screening uitgevoerd. Een van de belangrijkste obstakels dat onderzoekers hebben bij de toepassing bioprinting technologie is dat zeer weinig materialen zijn ontwikkeld voor de uitdrukkelijke bedoeling bioprinting. Om effectief te kunnen slagen in bioprinting, moet een biomateriaal voldoen 4 basisvereisten. Het biomateriaal moet 1) de passende mechanische eigenschappen afzetting mogelijk te maken (hetzij extrusie door een spuitmond van een gel of een inkjet als druppel), 2) het vermogen om zijn vorm als een component van een 3-D structuur na depositie houden, 3) de mogelijkheid voor handmatige instelling van de 2 voorgaande kenmerken, en 4) een cel vriendelijke en ondersteunende omgeving helemaal fasen van de bioprinting procedure. 7 Historisch gezien bioprinting werk is vaak geprobeerd om bestaande traditionele biomaterialen in bioprinting apparatuur worden zonder rekening te houden voor de verenigbaarheid ervan, in plaats van het ontwerpen van een biomateriaal om de eigenschappen die noodzakelijk zijn voor bioprinting en de daaropvolgende post-printing toepassingen. Verschillende bioinks zijn recentelijk ontwikkeld om betere interface met de afzetting en fabricage hardware. Standard hydrogel systemen vormen grote problemen, omdat zij over het algemeen bestaan ​​als hetzij voorloper vloeistof oplossingen met onvoldoende mechanische eigenschappen, of polymeriseren hydrogels die als ze worden geprint kunnen sproeiers verstopt raken of worden opengebroken op het extrusieproces. Ons team, evenals others, hebben verschillende hydrogel formuleringen om deze bioprinting problemen aan te pakken, zoals mobiele spheroïde afdrukken in hydrogel substraten, 5,8 cel en hydrogel filament extrusie uit microcapillaire buizen, 9-11 extrudeerbare hyaluronzuur (HA) -gold nanodeeltjes hydrogels met dynamische verknoping eigenschappen onderzocht , 12 temporele controle hydrogel stijfheid gebruik fotopolymeriseerbare gemethacryleerd HA en gelatine, 13 fibrinogeen trombine-gebaseerde verknoping, 14,15 ionenuitwisseling alginaat-collageen gels, 16 en recente snelle polymerisatie ultraviolet licht (UV) geïnitieerde verknoping, 17 Deze voorbeelden tonen de haalbaarheid van het genereren van materialen die effectief kan door bioprinted. Echter, naast integratie met hardware, succesvol genereren levensvatbare en functionele 3-D weefselconstructen moeten biomaterialen biochemische en mechanische signalen bevatten die helpen bij het handhaven cellulairelevensvatbaarheid en functie. Deze andere factoren, biochemische en mechanische profielen kunnen een significante invloed hebben op de succesvolle werking van bioprinted weefselconstructen hebben. Zowel de natieve cellen en extracellulaire matrix (ECM) verantwoordelijk voor het presenteren van een groot aantal signaalmoleculen, zoals groeifactoren en andere cytokines naar andere cellen. De combinatie van deze signalen varieert van weefsel tot weefsel, maar uiterst krachtig en invloedrijk bij het ​​reguleren cellen en weefsels gedrag. 18 Gebruikmakend weefselspecifiek ECM componenten van verschillende organen en uitvoeren als een hydrogel of als onderdeel van een hydrogel is verkend succes. 19-21 Deze benadering, die bestaat uit decellularizing een bepaald weefsel, verpulveren, en te lossen, kan worden gebruikt om weefsel-specifieke biochemische signalen produceren van elk weefsel en 3-D hydrogel constructen kunnen worden opgenomen. 22 DaarnaastHet is uitvoerig gedocumenteerd dat weefsels in het lichaam innemen uiteenlopende stijfheden. 23 Als zodanig is de mogelijkheid om af te stemmen de mechanische eigenschappen van biomaterialen, zoals elasticiteitsmodulus E &#39;of shear elasticiteitsmodulus G&#39;, is een nuttig hulpmiddel weefselmanipulatie . Zoals hierboven beschreven controle bioink mechanische eigenschappen maakt extruderen gebaseerde biofabrication met een zachte gel, die dan verder door secundaire crosslinking kan gemanipuleerd op een later tijdstip, waarop elasticiteitsmodulus niveaus kunnen worden bereikt die overeenkomen met dat van het doelorgaan. Bijvoorbeeld zou biomaterialen worden aangepast om een stijfheid van 5-10 kPa passen als een native lever 23 of pas een stijfheid van 10-15 kPa zoals natief hartweefsel, 24,25 theoretisch verhogen van het vermogen van deze organoids in functioneren op soortgelijke wijze als hun eigen weefsel tegenhangers. De invloed van de stijfheid van het milieu op cel fenotype heeft exp geweestlored afgelopen jaren, met name wat betreft stamcellen. Engler et al. Toonden aan dat substraat elasticiteit geholpen bij het ​​stimuleren mesenchymale stamcellen (MSC) naar lineages met weefsel elasticiteit als dat van het substraat. 25 Dit concept is verder onderzocht differentiatie in spieren, hartfunctie, lever fenotype, hematopoietische stamcel proliferatie en onderhoud van stamcellen therapeutisch potentieel. 24,26-29 Het kunnen afstemmen op een hydrogel verschillende elasticiteitsmoduli is een belangrijk kenmerk van een biomateriaal die wordt gebruikt om weefselconstructen biofabricate. 30 Hier beschrijven we een protocol dat een veelzijdige benadering in ons laboratorium een ​​hydrogel systeem extrusie kan worden bioprinted formuleren voorstelt, en 1 maat) bevatten biochemische profiel van een bepaald type weefsel en 2) bootsen de elastische modulus van deze weefseltype . Door het aanpakken van deze eisen, willen we provide een materiaal dat de fysiochemische en biologische eigenschappen van in vivo kan herhalen weefsel. 31 De modulaire hydrogel samengesteld dat hierin wordt beschreven maakt gebruik van een multi-verknopende benadering extrudeerbaar bioinks geven, en houdt een tweede verknoping te stabiliseren en verhoogt de stijfheid van de eindproducten verschillende weefseltypen passen. Biochemical maatwerk wordt voldaan door met behulp van weefsel-specifieke ECM componenten. Als een demonstratie, in dienst nemen we een lever-specifieke verscheidenheid van deze hydrogel systeem om functionele lever organoïde constructen Bioprint. De beschreven protocol maakt gebruik van een aangepaste 3-D bioprinting apparaat. In het algemeen kan dit protocol worden aangepast aan de meeste extrusie gebaseerde printers, printvereisten parameters variëren sterk voor alle typen inrichtingen en vereisen onderzoek door de gebruiker.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="903">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hyaluronic acid</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">53747</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Gelatin</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G6144</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">410896</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:340px;">Hyaluronic acid and gelatin hydrogel kit (HyStem-HP)</td>
			<td style="width:108px;">ESI-BIO</td>
			<td style="width:119px;">GS315</td>
			<td style="width:336px;">Kit contains the components Heprasil (thiolated and heparinized hyaluronic acid), Gelin-S (thiolated gelatin), and Extralink (PEGDA)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">PEG 8-Arm Alkyne, 10 kDa</td>
			<td style="width:108px;">Creative PEGWorks</td>
			<td>PSB-887</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Primary human hepatocytes</td>
			<td style="width:108px;">Triangle Research Labs</td>
			<td>HUCPM6</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Primary human liver stellate cells</td>
			<td style="width:108px;">ScienCell</td>
			<td style="width:119px;">5300</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Primary human Kupffer cells</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">HUKCCS</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hepatocyte Basal Media (HBM)</td>
			<td style="width:108px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-3199</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:340px;">Hepatocyte Media Supplement Kit</td>
			<td style="width:108px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-3198</td>
			<td style="width:336px;">HCM SingleQuot Kits (contains ascorbic acid, 0.5mL; bovine serum albumin [fatty acid free], 10 mL; gentamicin sulfate/amphotericin B, 0.5mL; hydrocortisone 21-hemisuccinate, 0.5 mL; insulin, 0.5 mL; human recombinant epidermal growth factor, 0.5 mL; transferring, 0.5 mL)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td style="width:336px;">Other manufacturers are ok.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Ammonium hydroxide</td>
			<td style="width:108px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A669</td>
			<td style="width:336px;">Other manufacturers are ok.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Fresh porcine cadaver tissue</td>
			<td style="width:108px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Lyophilizer</td>
			<td style="width:108px;">any</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Freezer mill</td>
			<td style="width:108px;">any</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:340px;">Bioprinter</td>
			<td style="width:108px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;">The bioprinter described herein was custom built in-house. In general, other devices are adequate provided they support computer controlled extrusion-based printing of hydrogel materials.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hanging drop cell culture plate</td>
			<td style="width:108px;">InSphero</td>
			<td>CS-06-001</td>
			<td style="width:336px;">InSphero GravityPlus 3D Culture Platform</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

Wanneer de bovenbeschreven procedures correct worden gevolgd, hydrogels een biochemisch profiel specifiek het doelweefsel, behelzen, 20 zorgen voor een hoge mate van controle over bioprinting en laatste elasticiteitsmodulus, 34 en steunen functionele levensvatbare cellen in weefselconstructen. hydrogel Customization Om zo goed mogelijk na te bootsen natieve lever, werd de hydrogel ...

Watch this Scientific Journal Video about Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink at JoVE.com

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting Cellularized Construeert met een tissue-specifieke Hydrogel Bioink

We beschrijven een reeks protocollen die samen een weefsel nabootsen hydrogel bioink waarmee functionele en levensvatbare 3-D weefsel constructen kunnen worden bioprinted voor gebruik in in vitro screening toepassingen.

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

Synthese van een inteïne gemedieerde Kunstmatige Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

Levensvatbaarheid van Bioprinted Cellular constructen met behulp van een drie Dispenser cartesiaanse Printer

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting van kraakbeen en huid weefsel analogen met behulp van een roman passief mengen eenheid techniek voor Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

Pancreatic weefsel-afgeleide extracellulaire matrix Bioink voor het afdrukken van 3D Cell-beladen alvleesklier weefsel constructies

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Protocollen van 3D Bioprinting van gelatine Methacryloyl hydrogel gebaseerde Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

Using Multilayered Hydrogel Bioink in Three-Dimensional Bioprinting for Homogeneous Cell Distribution

Met behulp van meerlaagse Hydrogel Bioink in driedimensionale bioprinting voor homogene celdistributie

During the extrusion-based three-dimensional bioprinting process, liquid-like bioinks with low viscosity can protect cells from membrane damage induced by ...

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

3D Bioprinting van Murine Cortiical Astrocytes voor Engineering Neural-Like Tissue

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...

Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering

Voorbereiding en karakterisering van op grafeen gebaseerde 3D biohybride hydrogel bioink voor perifere neuro-engineering

Peripheral neuropathies can occur as a result of axonal damage, and occasionally due to demyelinating diseases. Peripheral nerve damage is a global ...

Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting

Gelatine Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, en 3D Bioprinting

The emergence of granular hydrogel scaffolds (GHS), fabricated via assembling hydrogel microparticles (HMPs), has enabled microporous scaffold formation ...

Phototunable Bioprinted Hydrogels to Probe Cellular Responses to ECM Stiffening

3D Bioprinting Phototunable Hydrogels to Study Fibroblast Activation

Understanding Chronic Lung Diseases Using 3D Printed Phototunable Hydrogels (Video) | JoVE

3D-bioprinting Phototunable Hydrogels om de activering van fibroblasten te bestuderen

Phototunable hydrogels can transform spatially and temporally in response to light exposure. Incorporating these types of biomaterials in cell-culture ...