Name: bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink
Uploaded: 2016-04-21T14:00:00
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Les auteurs remercient le financement par l&#39;Agence de réduction de la menace de la Défense (DTRA) sous l&#39;espace et Naval Warfare Systems Pacific Center (SSC PACIFIQUE) Marché n ° N6601-13-C-2027. La publication de ce document ne constitue pas une approbation par le gouvernement des constatations ou conclusions des présentes.

1. hydrogels Bioink Formulations et préparation <ol><li> Afin de fournir des profils biochimiques spécifiques aux tissus, la préparation spécifique d&#39; un tissu d&#39;ECM des solutions de digestion comme décrit précédemment pour le foie. 20 Remarque: En général, cette digestion ECM comprendra 40% du volume de bioink d&#39;hydrogel final qui est utilisé. Plusieurs centaines de millilitres de solution ECM digest peuvent être préparés, aliquotés et congelés à -80 ° C pour une utilisa...

Il y a plusieurs éléments qui sont essentiels à considérer lors de la tentative de biofabricate constructions de tissu 3-D, pour une éventuelle utilisation chez les humains ou pour des applications in vitro de dépistage. En utilisant les composants cellulaires appropriés détermine la fonctionnalité potentielle d&#39;extrémité, tandis que le dispositif de biofabrication lui-même détermine la méthodologie générale pour parvenir à la construction finale. La troisième composante, le biomatériau, ...

Au cours des dernières années, une variété de technologies sont devenues disponibles qui répond au besoin de sources alternatives d&#39;organes et de tissus fonctionnels en cherchant à fabriquer, ou biofabricate, eux. Bioprinting a émergé comme l&#39;un des plus prometteurs de ces technologies. Bioprinting peut être considéré comme une forme de robotique additif fabrication de pièces biologiques, qui peut être utilisé pour construire ou modèle viable structures d&#39; organes similaires ou tissus comme en 3 dimensions. 1 Dans la plupart des cas, bioprinting emploie 3 dimensions (3 -D) de dispositif d&#39;impression qui est dirigée par un ordinateur pour déposer des cellules et des biomatériaux dans des positions précises, récapitulant ainsi anatomiquement imitant les architectures physiologiques. 2 Ces dispositifs impriment un &quot;bioink&quot;, qui peut prendre la forme d&#39;agrégats de cellules, cellules encapsulées dans des hydrogels ou des fluides visqueux ou des microsupports de cellules ensemencées, ainsi que des polymères exempts de cellules qui fournissent une structure mécanique ou d&#39;agir comme pla acellulaireceholders. 3,4 Après le processus de bioprinting, la structure résultante peut être mûri dans des structures de tissus ou d&#39; organes fonctionnels, et utilisés pour son application finale prévue. 5,6 A ce jour, une application totalement fonctionnelle organe humain de taille complète n&#39;a pas été imprimé, mais il reste le principal objectif à long terme de bioprinting recherche et développement. 2 Toutefois, à petite échelle constructions de tissu &quot;organoïdes&quot; sont actuellement mises en œuvre dans un certain nombre d&#39;applications, y compris la modélisation de la pathologie, le développement de médicaments, et le dépistage de la toxicologie. L&#39;un des principaux obstacles que les chercheurs ont rencontrées dans l&#39;application de la technologie de bioprinting est que très peu de matériaux ont été développés dans le but explicite de bioprinting. Pour réussir efficacement à bioprinting, un biomatériau doit répondre à 4 exigences de base. Le biomatériau doit avoir 1) les propriétés mécaniques appropriées pour permettre le dépôt (que ce soit l&#39;extrusion à travers une buse sous forme de gel ou d&#39;un inkjet comme une gouttelette), 2) la capacité de tenir sa forme en tant que composante d&#39;une structure 3-D après le dépôt, 3) la capacité de contrôle de l&#39;utilisateur des 2 caractéristiques antérieures, et 4) une cellule environnement amical et solidaire du tout phases de la procédure de bioprinting. 7 Historiquement, bioprinting travail a souvent essayé d&#39;employer biomatériaux traditionnelles existantes dans les dispositifs de bioprinting sans tenir compte de leur compatibilité, au lieu de concevoir un biomatériau pour avoir les propriétés nécessaires pour bioprinting et les applications post-impression ultérieures. Une variété de bioinks ont été développés récemment pour améliorer l&#39;interface avec le matériel de dépôt et la fabrication. systèmes d&#39;hydrogel standard posent des problèmes importants car ils existent généralement soit comme précurseur des solutions fluides avec des propriétés mécaniques insuffisantes, ou hydrogels polymérisés que si imprimés peuvent obstruer les buses ou deviennent rompu sur le processus d&#39;extrusion. Notre équipe, ainsi que others, ont exploré diverses formulations d&#39; hydrogel pour résoudre ces problèmes bioprinting, y compris l&#39; impression sphéroïde cellulaire dans des substrats d&#39;hydrogel, 5,8 cellulaire et hydrogel filament extrusion de tubes microcapillaires, 9-11 extrudables acide hyaluronique (HA) -Gold hydrogels de nanoparticules ayant des propriétés dynamiques de réticulation , 12 contrôle temporel de la rigidité d&#39;hydrogel en utilisant photopolymérisable méthacrylatée HA et de la gélatine, 13 réticulation à base de fibrinogène-thrombine, 14,15 échange ionique gels d&#39;alginate-collagène, 16 et récemment polymérisation rapide de la lumière ultraviolette (UV) réticulation -initiated, 17 Ces exemples démontrent la faisabilité des matériaux générant qui peuvent par bioprinted efficacement. Cependant, en plus de l&#39;intégration avec le matériel, afin de générer avec succès des constructions viables et fonctionnelles des tissus en 3-D, les biomatériaux doivent contenir les indices biochimiques et mécaniques qui aident à maintenir cellulairela viabilité et la fonction. Ces facteurs supplémentaires, profils biochimiques et mécaniques, peuvent avoir une influence significative sur la fonction réussie des constructions de tissu bioprinted. Les deux cellules et la matrice extracellulaire native (ECM) sont chargés de présenter une large gamme de molécules de signalisation telles que des facteurs de croissance et d&#39;autres cytokines à d&#39;autres cellules. La combinaison de ces signaux varie d&#39; un tissu à l&#39;autre , mais il peut être extrêmement puissant et influent dans la régulation du comportement cellulaire et tissulaire. 18 En utilisant des composants ECM spécifiques de tissus provenant de différents organes et la mise en oeuvre comme un hydrogel ou dans le cadre d&#39;un hydrogel a été explorée avec succès. 19-21 Cette approche, qui est constituée d&#39;un tissu donné décellularisation, la pulvérisation, et le dissoudre, peut être utilisé pour produire des signaux biochimiques spécifiques aux tissus de tous les tissus et peuvent être incorporés dans les trois dimensions des constructions d&#39;hydrogel. 22 De plus,il est largement documenté que les tissus dans le corps occupent une large gamme de raideurs. 23 Par conséquent, la possibilité de régler les propriétés mécaniques des biomatériaux, tels que le module d&#39; élasticité E &#39;ou module élastique de cisaillement G&#39; est un outil utile dans l&#39; ingénierie tissulaire . Comme décrit ci-dessus, le contrôle des propriétés mécaniques bioink permet biofabrication à base extrusion utilisant un gel mou, qui peut alors en outre manipulé par réticulation secondaire à un stade ultérieur, à quels niveaux de module élastique peuvent être atteints qui correspondent à celle du type d&#39;organe cible. Par exemple, les biomatériaux peuvent être personnalisés pour correspondre à une rigidité de 5-10 kPa comme un foie natif, 23 ou correspondre à une rigidité de 10-15 kPa comme tissu cardiaque native, 24,25 en théorie augmenter la capacité de ces organites à fonctionner d&#39;une manière similaire à celle de leurs homologues natifs de tissus. L&#39;influence de la rigidité de l&#39;environnement sur le phénotype cellulaire a été explored au cours des dernières années, en particulier en ce qui concerne les cellules souches. Engler et al. , Ont démontré que le substrat élasticité assistée dans la conduite des cellules souches mésenchymateuses (MSC) vers lignages avec l&#39; élasticité des tissus correspondant à celle du substrat. 25 Ce concept a été étudiée plus à la différenciation en muscle, la fonction cardiaque, phénotype hépatique, souche hématopoïétique prolifération cellulaire et le maintien du potentiel thérapeutique des cellules souches. 24,26-29 Etre capable de régler un hydrogel à différents modules d&#39; élasticité est une caractéristique importante d&#39;un biomatériau qui sera utilisé pour biofabricate constructions de tissu. 30 Nous décrivons ici un protocole qui représente une approche polyvalente utilisée dans notre laboratoire pour formuler un système d&#39;hydrogel qui peut être extrusion bioprinted et adapté à 1) contiennent le profil biochimique d&#39;un type de tissu particulier et 2) mimer le module d&#39;élasticité de ce type tissulaire . En répondant à ces exigences, nous visons à pournir un matériau qui peut récapituler les caractéristiques physico - chimiques et biologiques in vivo des tissus. 31 Le système composite d&#39;hydrogel modulaire décrit ici tire profit d&#39;une approche multi-réticulation pour donner bioinks extrudables et permet une réticulation secondaire pour stabiliser et augmente la rigidité de la les produits finis pour correspondre à une variété de types de tissus. personnalisation Biochemical est remplie en utilisant des composants ECM spécifiques de tissus. En guise de démonstration, nous employons une variété de ce système d&#39;hydrogel spécifique du foie à BioPrint foie fonctionnelle des constructions organoïdes. Le protocole décrit utilise un dispositif de bioprinting 3-D personnalisé. En général, ce protocole peut être adapté à la plupart des imprimantes à base extrusion, les paramètres d&#39;impression spécifiques varient considérablement pour chaque type d&#39;appareil et nécessitent des tests par l&#39;utilisateur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="903">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hyaluronic acid</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">53747</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Gelatin</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G6144</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">410896</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:340px;">Hyaluronic acid and gelatin hydrogel kit (HyStem-HP)</td>
			<td style="width:108px;">ESI-BIO</td>
			<td style="width:119px;">GS315</td>
			<td style="width:336px;">Kit contains the components Heprasil (thiolated and heparinized hyaluronic acid), Gelin-S (thiolated gelatin), and Extralink (PEGDA)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">PEG 8-Arm Alkyne, 10 kDa</td>
			<td style="width:108px;">Creative PEGWorks</td>
			<td>PSB-887</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Primary human hepatocytes</td>
			<td style="width:108px;">Triangle Research Labs</td>
			<td>HUCPM6</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Primary human liver stellate cells</td>
			<td style="width:108px;">ScienCell</td>
			<td style="width:119px;">5300</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Primary human Kupffer cells</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">HUKCCS</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hepatocyte Basal Media (HBM)</td>
			<td style="width:108px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-3199</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:340px;">Hepatocyte Media Supplement Kit</td>
			<td style="width:108px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-3198</td>
			<td style="width:336px;">HCM SingleQuot Kits (contains ascorbic acid, 0.5mL; bovine serum albumin [fatty acid free], 10 mL; gentamicin sulfate/amphotericin B, 0.5mL; hydrocortisone 21-hemisuccinate, 0.5 mL; insulin, 0.5 mL; human recombinant epidermal growth factor, 0.5 mL; transferring, 0.5 mL)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td style="width:336px;">Other manufacturers are ok.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Ammonium hydroxide</td>
			<td style="width:108px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A669</td>
			<td style="width:336px;">Other manufacturers are ok.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Fresh porcine cadaver tissue</td>
			<td style="width:108px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Lyophilizer</td>
			<td style="width:108px;">any</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Freezer mill</td>
			<td style="width:108px;">any</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:340px;">Bioprinter</td>
			<td style="width:108px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;">The bioprinter described herein was custom built in-house. In general, other devices are adequate provided they support computer controlled extrusion-based printing of hydrogel materials.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hanging drop cell culture plate</td>
			<td style="width:108px;">InSphero</td>
			<td>CS-06-001</td>
			<td style="width:336px;">InSphero GravityPlus 3D Culture Platform</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

Lorsque les procédures décrites ci - dessus sont suivies correctement, les hydrogels doivent contenir un profil biochimique spécifique au type de tissu cible, 20 permettent un degré élevé de contrôle sur bioprinting et module d&#39; élasticité finale, 34 et soutenir des cellules fonctionnelles viables dans des constructions de tissus. Hydrogel Personnalisation Pour mieux f...

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Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting cellularisées Constructs Utilisation d&#39;un spécifique de tissu Hydrogel Bioink

Nous décrivons un ensemble de protocoles qui fournissent ensemble un hydrogel bioink de tissus imitant avec lesquels des constructions fonctionnelles et viables 3-D tissus peuvent être bioprinted pour une utilisation dans des applications in vitro de dépistage.

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

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