Name: bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink
Uploaded: 2016-04-21T14:00:00
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Die Autoren danken Finanzierung durch die Defense Threat Reduction Agency (DTRA) unter Space and Naval Warfare Systems Center Pacific (SSC PACIFIC) Vertrag Nr N6601-13-C-2027. Die Veröffentlichung dieses Materials stellt keine Genehmigung durch die Regierung der Ergebnisse und Schlussfolgerungen hier.

1. Hydrogels Bioink Formulierungen und Vorbereitung <ol><li> Um Gewebe-spezifische biochemische Profile zur Verfügung zu stellen, werden die Lösungen gewebespezifische ECM verdauen , wie zuvor für Leber beschrieben. 20 Hinweis: In der Regel wird diese ECM-Digest 40% des endgültigen Hydrogels bioink Volumen umfassen wird, die verwendet wird. Mehrere Hundert Milliliter ECM digest Lösung kann bei -80 ° C für zukünftige Verwendung hergestellt, aliquotiert und eingefroren werden. </li><li> Stand d...

Es gibt mehrere Komponenten , die kritisch sind, die bei der 3-D - Gewebekonstrukte zu biofabricate versucht, für eine eventuelle Verwendung beim Menschen oder für in - vitro - Screening - Anwendungen. Unter Verwendung der geeigneten zellulären Komponenten bestimmt das Ende Potential Funktionalität, während die biofabrication Gerät selbst zum Erreichen des Endes Konstrukt die allgemeine Methode bestimmt. Die dritte Komponente, die Biomaterial, ist ebenso wichtig, da es eine Doppelrolle dient. Ins...

In den letzten Jahren wurde eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung stehen, die die Notwendigkeit für alternative Quellen von funktionellen Organe und Gewebe durch den Versuch, die Herstellung oder biofabricate Adressen, ihnen. Bioprinting als eines der vielversprechendsten dieser Technologien entstanden. Bioprinting kann als eine Form der Herstellung von biologischen Teilen robotic additive gedacht werden, die verwendet werden zur Erstellung oder Muster tragfähige organartige oder gewebeähnlichen Strukturen in drei Dimensionen. 1 In den meisten Fällen verwendet Bioprinting eine 3-dimensionale (3 -D) Druckgerät , das von einem Computer gerichtet ist , Zellen und Biomaterialien in genaue Positionen zu deponieren, damit rekapituliert anatomisch imitiert physiologischen Architekturen. 2 Diese Geräte besitzen einen &quot;bioink&quot; drucken, die die Form von Zellaggregaten erfolgen kann, in Hydrogele eingekapselten Zellen oder viskose Flüssigkeiten oder Zell ausgesät Microcarriern sowie zellfreie Polymere, die mechanische Struktur oder als zellfreie pla liefernceholders. 3,4 Nach dem Bioprinting Verfahren kann die resultierende Struktur in funktionelle Gewebe oder Organstrukturen gereift werden, und für die beabsichtigte Endanwendung verwendet. 5,6 Bis heute eine vollständige voll funktionsfähige menschliche Größe Orgel wurde nicht gedruckt, aber es bleibt die primäre langfristige Ziel von Bioprinting Forschung und Entwicklung. 2 jedoch kleine &quot;organoide&quot; Gewebekonstrukte sind derzeit in einer Reihe von Anwendungen implementiert werden, einschließlich der Pathologie Modellierung, Entwicklung von Arzneimitteln und Toxikologie - Screening. Eine der wichtigsten Hürden, die Forscher bei der Anwendung Bioprinting Technologie begegnet ist, dass nur sehr wenige Materialien für den ausdrücklichen Zweck der Bioprinting entwickelt. Um effektiv in Bioprinting erfolgreich zu sein, muss ein Biomaterial 4 grundlegende Anforderungen erfüllen. Das Biomaterial muss 1) die entsprechenden mechanischen Eigenschaften zu haben Abscheidung zu ermöglichen (es durch eine Düse als Gel Extrusion oder ein inkjet als Tröpfchen), 2) die Fähigkeit, seine Form als Bestandteil eines 3-D-Struktur nach der Abscheidung zu halten, 3) die Fähigkeit zur Benutzersteuerung der 2 vor Eigenschaften, und 4) eine Zelle freundlich und unterstützenden Umgebung überhaupt Phasen des Bioprinting Verfahren. 7 Historisch Bioprinting Arbeit versucht hat , oft bestehenden traditionellen Biomaterialien in Bioprinting Geräte ohne Rücksicht auf ihre Kompatibilität zu verwenden, anstatt ein Biomaterial von der Gestaltung der notwendigen Eigenschaften für Bioprinting und anschließende Post-Druckanwendungen zu haben. Eine Vielzahl von bioinks wurden vor kurzem eine bessere Schnittstelle mit der Abscheidung und Fertigung Hardware entwickelt. Standard-Hydrogel-Systeme stellen erhebliche Probleme, da sie in der Regel entweder als Vorläufer Fluidlösungen mit unzureichenden mechanischen Eigenschaften bestehen, oder polymerisiert Hydrogele, die auf den Extrusionsprozess Düsen oder werden verstopfen aufgebrochen, wenn gedruckt werden. Unser Team, sowie others wurden verschiedene Hydrogel - Formulierungen untersucht , diese Bioprinting Probleme, einschließlich Zell - Sphäroiden Druck in Hydrogel - Substrate, 5,8 - Zelle und Hydrogel Filamentextrusion von Mikrokapillarröhrchen, 9-11 extrudierbaren Hyaluronsäure (HA) -gold Nanopartikel Hydrogele mit dynamischen Vernetzungseigenschaften zu adressieren 12 zeitliche Steuerung des Hydrogels Steifigkeits photopolymerisierbaren Verwendung methacrylierte HA und Gelatine, 13 Fibrinogen-Thrombin-basierten Vernetzung 14,15 Ionenaustausch Alginat-Kollagengele, 16 und kürzlich schnelle polymerisierenden ultraviolettem Licht (UV) initiierten Vernetzung 17 Diese Beispiele demonstrieren die Durchführbarkeit der Erzeugung von Materialien, die effektiv bioprinted durch kann. Doch neben der Integration mit Hardware, um erfolgreich zu generieren tragfähige und funktionelle 3-D-Gewebekonstrukte müssen Biomaterialien enthalten biochemische und mechanische Signale, dass die Hilfe bei der Aufrechterhaltung der zellulärenLebensfähigkeit und Funktion. Diese zusätzlichen Faktoren, biochemische und mechanische Profile können einen wesentlichen Einfluss auf die erfolgreiche Funktion von bioprinted Gewebekonstrukte. Beide Zellen und die native extrazelluläre Matrix (ECM) sind verantwortlich für eine Vielzahl von Signalmolekülen, wie beispielsweise Wachstumsfaktoren und anderen Cytokinen auf andere Zellen zu präsentieren. Die Kombination dieser Signale variiert von Gewebe zu Gewebe, kann aber bei der Regulierung der Zell - und Gewebeverhalten extrem potent und einflussreich. 18 gewebsspezifische ECM Komponenten aus verschiedenen Organen und Umsetzung als Hydrogel oder als Teil eines Hydrogels erforscht worden Einsatz mit Erfolg. 19-21 Dieser Ansatz, der von Dezellularisieren einer gegebenen Gewebe besteht, Pulverisieren, und es löst, können gewebespezifische biochemische Signale von jedem Gewebe zu erzeugen , und kann in 3-D - Hydrogel - Konstrukte eingebaut werden. 22 verwendet werden , Zusätzlich,es wird allgemein dokumentiert , dass Gewebe in dem Körper eine Vielzahl von Steifigkeiten besetzen. 23 als solche, die Fähigkeit , die mechanischen Eigenschaften von Biomaterialien, wie beispielsweise Elastizitätsmodul E &#39;oder Scherelastizitätsmodul G&#39;, abzustimmen ist ein nützliches Werkzeug in Tissue Engineering . Wie oben beschrieben, ermöglicht die Kontrolle über bioink mechanischen Eigenschaften für die Extrusion basierte biofabrication ein weiches Gel, das durch sekundäre Vernetzung zu einem späteren Zeitpunkt dann weiter manipuliert werden kann, an dem Elastizitätsmodul Niveaus erreicht werden kann, dass die von dem Zielorgan Typ entsprechen. Zum Beispiel könnte Biomaterialien angepasst werden wie eine native Leber eine Steifigkeit von 5-10 kPa entsprechen, 23 oder eine Steifigkeit von 10 bis 15 kPa wie native Herzgewebe entsprechen, 24,25 in der Theorie Erhöhung der Fähigkeit dieser Organoiden funktionieren in eine ähnliche Art und Weise in ihre Heimat Gewebe Pendants. Der Einfluss von Umwelt Steifigkeit auf Zell-Phänotyp wurde explored in den letzten Jahren, insbesondere im Hinblick auf Stammzellen. Engler et al. Zeigten , dass die Substrat - Elastizitätsantriebs mesenchymalen Stammzellen Aided (MSC) in Richtung Abstammungslinien mit Gewebeelastizität der des Substrats übereinstimmt. 25 dieses Konzept weiter zur Differenzierung in Muskel untersucht worden ist, die Herzfunktion, Leber Phänotyp, hämatopoetische Stammzellproliferation und Wartung der Stammzell therapeutisches Potential. 24,26-29 ein Hydrogel zu unterschiedlichen Elastizitätsmoduln abzustimmen In der Lage ist ein wichtiges Merkmal eines Biomaterials , das Gewebekonstrukte werden verwendet wird biofabricate. 30 Hier beschreiben wir ein Protokoll, das einen vielseitigen Ansatz in unserem Labor für eine Hydrogel-System zu formulieren, die Extrusions bioprinted werden kann und angepasst auf 1) enthalten, die biochemische Profil eines bestimmten Typs Gewebe und 2) ahmen den Elastizitätsmodul dieser Gewebeart . Durch diese Anforderungen adressieren, wollen wir provide ein Material, das die physikalisch - chemischen und biologischen Eigenschaften von in vivo Gewebe rekapitulieren kann. 31. Das modulare Hydrogel beschrieben Verbundsystem nimmt hier den Vorteil eines Mehrvernetzungs Ansatz extrudierbaren bioinks zu ergeben, und ermöglicht eine Nachvernetzung zu stabilisieren und erhöht die Steifigkeit der Endprodukte eine Reihe von Gewebetypen zu entsprechen. Biochemische Anpassung wird durch die Verwendung gewebespezifischer ECM-Komponenten erfüllt. Als Demonstration, beschäftigen wir eine leberspezifische Vielfalt dieses Hydrogelsystem funktionelle Leber organoiden Konstrukte Bioprint. Das Protokoll beschrieben verwendet eine benutzerdefinierte 3-D Bioprinting Gerät. Im Allgemeinen kann dieses Protokoll zu den meisten Extrusionsbasierte Drucker, bestimmte Druckparameter variiert durch den Benutzer für jeden Gerätetyp und erfordern Tests drastisch angepasst werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="903">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hyaluronic acid</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">53747</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Gelatin</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G6144</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">410896</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:340px;">Hyaluronic acid and gelatin hydrogel kit (HyStem-HP)</td>
			<td style="width:108px;">ESI-BIO</td>
			<td style="width:119px;">GS315</td>
			<td style="width:336px;">Kit contains the components Heprasil (thiolated and heparinized hyaluronic acid), Gelin-S (thiolated gelatin), and Extralink (PEGDA)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">PEG 8-Arm Alkyne, 10 kDa</td>
			<td style="width:108px;">Creative PEGWorks</td>
			<td>PSB-887</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Primary human hepatocytes</td>
			<td style="width:108px;">Triangle Research Labs</td>
			<td>HUCPM6</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Primary human liver stellate cells</td>
			<td style="width:108px;">ScienCell</td>
			<td style="width:119px;">5300</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Primary human Kupffer cells</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">HUKCCS</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hepatocyte Basal Media (HBM)</td>
			<td style="width:108px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-3199</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:340px;">Hepatocyte Media Supplement Kit</td>
			<td style="width:108px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-3198</td>
			<td style="width:336px;">HCM SingleQuot Kits (contains ascorbic acid, 0.5mL; bovine serum albumin [fatty acid free], 10 mL; gentamicin sulfate/amphotericin B, 0.5mL; hydrocortisone 21-hemisuccinate, 0.5 mL; insulin, 0.5 mL; human recombinant epidermal growth factor, 0.5 mL; transferring, 0.5 mL)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td style="width:336px;">Other manufacturers are ok.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Ammonium hydroxide</td>
			<td style="width:108px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A669</td>
			<td style="width:336px;">Other manufacturers are ok.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Fresh porcine cadaver tissue</td>
			<td style="width:108px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Lyophilizer</td>
			<td style="width:108px;">any</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Freezer mill</td>
			<td style="width:108px;">any</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:340px;">Bioprinter</td>
			<td style="width:108px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;">The bioprinter described herein was custom built in-house. In general, other devices are adequate provided they support computer controlled extrusion-based printing of hydrogel materials.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hanging drop cell culture plate</td>
			<td style="width:108px;">InSphero</td>
			<td>CS-06-001</td>
			<td style="width:336px;">InSphero GravityPlus 3D Culture Platform</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

Wenn die oben beschriebenen Verfahren korrekt befolgt werden, Hydrogele ein biochemisches Profil spezifisch auf die Zielgewebetyp enthalten sollte, damit 20 für einen hohen Grad an Kontrolle über Bioprinting und letzten Elastizitätsmodul, 34 und lebensfähigen funktionellen Zellen in Gewebekonstrukten unterstützen. Hydrogele Customization Um am besten imitieren nativen Leber, d...

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Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting cellularized Konstruiert unter Verwendung eines gewebespezifischen Hydrogel Bioink

Wir beschreiben eine Reihe von Protokollen , die zusammen stellen eine gewebe nachahmt Hydrogel bioink mit dem funktionelle und tragfähige 3-D Gewebekonstrukte zur Verwendung in in vitro - Screening - Anwendungen bioprinted werden kann.

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

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