Name: bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink
Uploaded: 2016-04-21T14:00:00
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Gli autori ringraziano finanziamento da parte della Defense Threat Reduction Agency (DTRA) in Space and Naval Warfare Systems Center Pacific (SSC Pacifico) contratto n N6601-13-C-2027. La pubblicazione di questo materiale non costituisce approvazione da parte del governo dei risultati o le conclusioni nel presente documento.

1. idrogel Bioink formulazioni e Preparazione <ol><li> Al fine di fornire profili biochimici tessuto-specifici, preparare tessuto-specifica ECM digerire soluzioni come descritto in precedenza per il fegato. 20 Nota: In generale, questo ECM digest comprenderà 40% del volume bioink idrogel finale che viene impiegato. Diverse centinaia di millilitri di soluzione ECM digest possono essere preparati, aliquotati e congelati a -80 ° C per un uso futuro. </li><li> Prima di idrogel formulazione, sciogliere ...

Ci sono diverse componenti che sono fondamentali per prendere in considerazione quando si cerca di biofabricate 3-D costrutti di tessuto, per l&#39;uso eventuale negli esseri umani o per applicazioni di screening in vitro. Impiegando i componenti cellulari appropriati determina il potenziale funzionalità end, mentre il dispositivo biofabrication si determina la metodologia generale per raggiungere il costrutto finale. Il terzo componente, il biomateriale, è altrettanto importante, in quanto serve un doppio ru...

Negli ultimi anni, una varietà di tecnologie sono diventate disponibili che risponde alla necessità di fonti alternative di organi funzionali e tessuti cercando di fabbricare o biofabricate, li. Bioprinting è emerso come uno dei più promettenti di queste tecnologie. Bioprinting può essere pensato come una forma di robotica additivo fabbricazione di parti biologiche, che può essere utilizzato per costruire o modello praticabile strutture organo-simili o tessuto-come in 3 dimensioni. 1 Nella maggior parte dei casi, bioprinting impiega un 3-dimensionale (3 -D) dispositivo di stampa che è diretta da un computer per depositare cellule e biomateriali in posizioni precise, riassumendo così anatomicamente imitano architetture fisiologici. 2 Questi dispositivi stampare una &quot;bioink&quot;, che può assumere la forma di aggregati di cellule, cellule incapsulate in idrogel o fluidi viscosi, o microcarriers cellulari testa di serie, così come i polimeri privi di cellule che forniscono struttura meccanica o agire come PLA cell-freeceholders. 3,4 A seguito del processo bioprinting, la struttura risultante può essere maturata in strutture tessuto o organo funzionale, e utilizzati per la sua applicazione finale previsto. 5,6 Fino ad oggi, un organo completo a misura d&#39;uomo completamente funzionale non è stato stampato, ma rimane l&#39;obiettivo principale a lungo termine della bioprinting ricerca e sviluppo. 2 Tuttavia, su piccola scala &quot;organoide&quot; costrutti di tessuto sono attualmente in corso di attuazione in una serie di applicazioni, tra cui la modellazione patologia, lo sviluppo di farmaci, e lo screening tossicologico. Uno dei principali ostacoli che i ricercatori hanno incontrato nell&#39;applicazione della tecnologia bioprinting è che ben pochi materiali sono stati sviluppati per l&#39;esplicito scopo di bioprinting. Per avere successo in modo efficace in bioprinting, un biomateriale deve soddisfare 4 requisiti fondamentali. Il biomateriale deve avere 1) le proprietà meccaniche appropriate per consentire la deposizione (sia estrusione attraverso un ugello come un gel o un inkjet come una gocciolina), 2) la capacità di mantenere la sua forma come componente di una struttura 3-D dopo la deposizione, 3) la capacità di controllo utente delle 2 caratteristiche precedenti, e 4) ambiente amichevole e solidale una cella a tutti fasi della procedura bioprinting. 7 Storicamente, bioprinting lavoro è spesso cercato di impiegare biomateriali tradizionali esistenti in dispositivi bioprinting senza considerazione per la loro compatibilità, invece di progettare un biomateriale per avere le proprietà necessarie per bioprinting e successive applicazioni di post-stampa. Una varietà di bioinks sono stati sviluppati di recente per migliore interfaccia con l&#39;hardware deposizione e di fabbricazione. sistemi di idrogel standard pongono notevoli problemi perché esistono in generale sia come precursore di soluzioni fluide con insufficienti caratteristiche meccaniche, o idrogel polimerizzati che se stampati possono ostruire gli ugelli o diventano rotto sul processo di estrusione. La nostra squadra, così come OtheRS, hanno esplorato varie formulazioni idrogel per affrontare questi problemi, tra cui la stampa bioprinting sferoide cella in substrati idrogel, 5,8 cellulare e idrogel filamento di estrusione da tubi microcapillari, 9-11 estrudibili acido ialuronico (HA) idrogel nanoparticelle -Gold con proprietà di reticolazione dinamiche , 12 controllo temporale della rigidità idrogel usando fotopolimerizzabile metacrilato HA e la gelatina, 13 reticolazione a base di fibrinogeno-trombina, 14,15 a scambio ionico gel alginato-collagene, 16 e recentemente rapida polimerizzazione luce ultravioletta (UV) reticolazione iniziati con, 17 Questi esempi dimostrano la fattibilità di materiali che generano che può venire bioprinted efficace. Tuttavia, in aggiunta all&#39;integrazione con hardware, per generare successo costrutti tissutali vitali e funzionali 3-D, biomateriali devono contenere segnali biochimici e meccanici che aiuti nel mantenimento cellularevitalità e funzionalità. Questi fattori aggiuntivi, profili biochimici e meccanici, possono avere un&#39;influenza significativa sulla funzione di successo di costrutti di tessuto bioprinted. Sia le cellule e la matrice extracellulare nativa (ECM) sono responsabili di presentare una vasta gamma di molecole di segnalazione come fattori di crescita e altre citochine ad altre celle. La combinazione di questi segnali varia da tessuto a tessuto, ma può essere estremamente potente e influente nella regolazione del comportamento delle cellule e dei tessuti. 18 Impiegando componenti ECM tessuto-specifici da organi diversi e attuazione come idrogel o come parte di un idrogel è stata esplorata con successo. 19-21 Questo approccio, che comprende decellularizing un determinato tessuto, polverizzazione, e dissolverla, può essere utilizzato per produrre segnali biochimici tessuto-specifici da qualsiasi tessuto e possono essere incorporati in 3-D costrutti idrogel. 22 Inoltre,è ampiamente documentato che i tessuti del corpo occupano una vasta gamma di impedenze. 23 Pertanto, la possibilità di regolare le proprietà meccaniche dei biomateriali, quali il modulo elastico E &#39;o tranciare modulo elastico G&#39;, è uno strumento utile in ingegneria tissutale . Come descritto sopra, il controllo bioink proprietà meccaniche consente biofabrication estrusione-basato usando gel morbido, che può poi ulteriormente manipolato da reticolazione secondaria in un momento successivo, in cui i livelli di modulo elastico possono essere raggiunti che corrisponde a quella del tipo organo bersaglio. Ad esempio, biomateriali possono essere personalizzati per abbinare una rigidità di 5-10 kPa come un fegato nativo, 23 o abbinare una rigidità di 10-15 kPa come tessuto cardiaco nativo, 24,25 in teoria aumentare la capacità di questi organoidi di funzionare in un modo simile alle loro controparti tessuto nativo. L&#39;influenza della rigidità dell&#39;ambiente sul fenotipo cellulare è stato explored negli ultimi anni, in particolare rispetto alle cellule staminali. Engler et al. Hanno dimostrato che l&#39;elasticità del substrato aiutato a guidare le cellule staminali mesenchimali (MSC) verso linee con elasticità dei tessuti corrispondente a quello del substrato. 25 Questo concetto è stato ulteriormente esplorato per la differenziazione in muscolo, la funzione cardiaca, fenotipo fegato, staminali ematopoietiche proliferazione cellulare e manutenzione di potenziale terapeutico delle cellule staminali. 24,26-29 Essendo in grado di sintonizzare un idrogel di diversi moduli di elasticità è una caratteristica importante di un biomateriale che verrà utilizzato per biofabricate costrutti tissutali. 30 Qui si descrive un protocollo che rappresenta un approccio versatile utilizzato nel nostro laboratorio per formulare un sistema idrogel che può essere estruso bioprinted e personalizzata per 1) contenere il profilo biochimico di un particolare tipo di tessuto e 2) mimare il modulo elastico di tale tipo di tessuto . Affrontando questi requisiti, ci proponiamo di provide un materiale che può riassumere le caratteristiche fisico-chimiche e biologiche di in vivo tessuto. 31 Il sistema composito idrogel modulare descritta sfrutta un approccio multi-reticolazione per produrre bioinks estrudibili, e permette una reticolazione secondaria per stabilizzare e aumenta la rigidità della prodotti finali per abbinare una vasta gamma di tipi di tessuto. personalizzazione biochimica viene soddisfatta utilizzando componenti ECM tessuto-specifici. A dimostrazione, ci avvaliamo di una varietà specifica di fegato di questo sistema idrogel per Bioprint fegato funzionale costrutti organoide. Il protocollo descritto utilizza un dispositivo bioprinting 3-D personalizzato. In generale, questo protocollo può essere adattato alla maggior parte delle stampanti estrusione-based, parametri di stampa specifici variano notevolmente per ciascun tipo di dispositivo e richiedono test dall&#39;utente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="903">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hyaluronic acid</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">53747</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Gelatin</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G6144</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">410896</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:340px;">Hyaluronic acid and gelatin hydrogel kit (HyStem-HP)</td>
			<td style="width:108px;">ESI-BIO</td>
			<td style="width:119px;">GS315</td>
			<td style="width:336px;">Kit contains the components Heprasil (thiolated and heparinized hyaluronic acid), Gelin-S (thiolated gelatin), and Extralink (PEGDA)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">PEG 8-Arm Alkyne, 10 kDa</td>
			<td style="width:108px;">Creative PEGWorks</td>
			<td>PSB-887</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Primary human hepatocytes</td>
			<td style="width:108px;">Triangle Research Labs</td>
			<td>HUCPM6</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Primary human liver stellate cells</td>
			<td style="width:108px;">ScienCell</td>
			<td style="width:119px;">5300</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Primary human Kupffer cells</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">HUKCCS</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hepatocyte Basal Media (HBM)</td>
			<td style="width:108px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-3199</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:340px;">Hepatocyte Media Supplement Kit</td>
			<td style="width:108px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-3198</td>
			<td style="width:336px;">HCM SingleQuot Kits (contains ascorbic acid, 0.5mL; bovine serum albumin [fatty acid free], 10 mL; gentamicin sulfate/amphotericin B, 0.5mL; hydrocortisone 21-hemisuccinate, 0.5 mL; insulin, 0.5 mL; human recombinant epidermal growth factor, 0.5 mL; transferring, 0.5 mL)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td style="width:336px;">Other manufacturers are ok.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Ammonium hydroxide</td>
			<td style="width:108px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A669</td>
			<td style="width:336px;">Other manufacturers are ok.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Fresh porcine cadaver tissue</td>
			<td style="width:108px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Lyophilizer</td>
			<td style="width:108px;">any</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Freezer mill</td>
			<td style="width:108px;">any</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:340px;">Bioprinter</td>
			<td style="width:108px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;">The bioprinter described herein was custom built in-house. In general, other devices are adequate provided they support computer controlled extrusion-based printing of hydrogel materials.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hanging drop cell culture plate</td>
			<td style="width:108px;">InSphero</td>
			<td>CS-06-001</td>
			<td style="width:336px;">InSphero GravityPlus 3D Culture Platform</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

Quando le procedure sopra descritte vengono seguite correttamente, idrogel dovrebbero contenere un profilo biochimico specifico per il tipo di tessuto bersaglio, 20 permettono un elevato grado di controllo su bioprinting e modulo elastico finale, 34 e supportano cellule vitali funzionali nei costrutti tissutali. idrogel Personalizzazione Per meglio fegato nativo mimica, la bioink i...

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Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting Cellularized Costruisce Utilizzando un tessuto-specifici idrogel Bioink

Descriviamo un insieme di protocolli che, insieme, forniscono un bioink idrogel tessuto-mimando con le quali costrutti di tessuto 3-D funzionali e vitali possono essere bioprinted per l&#39;utilizzo in applicazioni di screening in vitro.

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

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