Name: bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink
Uploaded: 2016-04-21T14:00:00
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Os autores agradecem o financiamento pela Agência de Redução de defesa contra ameaças (DTRA) sob Space and Naval Warfare Center Sistemas Pacífico (SSC Pacífico) Contrato nº N6601-13-C-2027. A publicação deste material não constitui uma aprovação pelo governo dos achados ou conclusões aqui.

1. Formulações de hidrogel Bioink e Preparação <ol><li> A fim de proporcionar perfis bioquímicos específicos do tecido, preparar-tecido específico ECM digerir soluções como previamente descrito para o fígado. 20 Nota: Em geral, este ECM Digest irá compreender 40% do volume bioink hidrogel final que é empregue. Várias centenas de mililitros de solução de ECM digestão pode ser preparado, aliquotas, e congelado a -80 ° C para uso futuro. </li><li> Antes da formulação de hidrogel, diss...

Existem vários componentes que são essenciais para considerar quando se tenta biofabricate 3-D construções de tecido, para eventual utilização em humanos ou para aplicações de rastreio in vitro. Empregando os componentes celulares adequadas determina o fim funcionalidade potencial, enquanto o próprio dispositivo biofabrication determina a metodologia geral para atingir a construção final. O terceiro componente, o biomaterial, é igualmente importante, uma vez que serve duplo papel. Especificamente, o...

Nos últimos anos, uma grande variedade de tecnologias tornaram-se disponíveis, que aborda a necessidade de fontes alternativas de órgãos e tecidos funcionais através pretende fabricar, ou biofabricate, eles. Bioprinting emergiu como um dos mais promissores destas tecnologias. Bioprinting pode ser pensado como uma forma de fabrico aditivo robótico de partes biológicas, que podem ser usados ​​para construir ou de padrão viável estruturas de órgãos ou de tipo de tecido, como em 3 dimensões. 1 Na maior parte dos casos, bioprinting emprega um 3-dimensional (3 D) do dispositivo de impressão que é dirigido por um computador para depositar as células e biomateriais em posições precisas, recapitulando assim anatomicamente-imitando arquitecturas fisiológicas. 2 Estes dispositivos de impressão de um &quot;bioink&quot;, que podem assumir a forma de agregados de células, as células encapsuladas em hidrogéis ou fluidos viscosos, ou microtransportadores de células-semeado, bem como polímeros isentos de células que fornecem a estrutura mecânica ou agir como PLA isento de célulasceholders. 3,4 Na sequência do processo bioprinting, a estrutura resultante pode ser amadurecido em tecidos ou órgãos estruturas funcionais, e utilizado para a sua aplicação final pretendida. 5,6 Até à data, um órgão de tamanho humano totalmente funcional completa não foi impressa, mas continua a ser o principal objetivo de longo prazo de bioprinting pesquisa e desenvolvimento. 2 no entanto, em pequena escala &quot;organï¿½de&quot; construções de tecido estão actualmente a ser implementado em uma série de aplicações, incluindo modelagem de patologia, desenvolvimento de medicamentos e rastreio de toxicologia. Um dos principais obstáculos que os pesquisadores têm encontrado na aplicação de tecnologia bioprinting é que muito poucos materiais foram desenvolvidos para o propósito explícito de bioprinting. Para ter sucesso efetivamente em bioprinting, um biomaterial deve cumprir 4 requisitos básicos. O biomaterial tem de ter: 1) as propriedades mecânicas apropriadas para permitir a deposição (seja extrusão através de um bocal como um gel ou um inkjet como uma gota), 2) a capacidade de manter a sua forma como um componente de uma estrutura 3-D após a deposição, 3) a capacidade de controle do usuário sobre os 2 características anteriores, e 4) ambiente amigável e de suporte de uma célula em tudo as fases do processo bioprinting. 7 Historicamente, bioprinting trabalho tem muitas vezes tentou empregar biomateriais tradicionais existentes em dispositivos bioprinting sem consideração a sua compatibilidade, em vez de projetar um biomaterial para ter as propriedades necessárias para bioprinting e aplicações pós-impressão subseqüentes. Uma variedade de bioinks têm sido desenvolvidas recentemente para melhor interface com o equipamento de fabricação e deposição. sistemas de hidrogel padrão representar problemas significativos porque geralmente existem como um ou outro precursor de soluções de fluidos com propriedades mecânicas insuficientes, ou hidrogéis polimerizados que se impressos podem entupir bicos ou tornar-se dividido sobre o processo de extrusão. A nossa equipa, bem como others, têm explorado várias formulações de hidrogel para resolver estes problemas bioprinting, incluindo impressão esferóide célula em substratos de hidrogel, 5,8 celular e filamentos de hidrogel de extrusão de tubos microcapilares, 9-11 extrudable ácido hialurônico (AH) hidrogéis de nanopartículas -Gold com propriedades de reticulação dinâmicos , 12 controlo temporal da rigidez hidrogel utilizando fotopolimerizável metacrilado HA e gelatina, 13 de reticulação à base de fibrinogênio-trombina, 14,15 géis de alginato-colágeno troca iônica, 16 e recentemente rápida polimerização por luz ultravioleta (UV) reticulação -initiated, 17 Estes exemplos demonstram a viabilidade de materiais que geram que pode por bioprinted eficazmente. No entanto, para além de integração com o hardware, com sucesso para gerar construções de tecido 3-D viáveis ​​e funcionais, biomateriais deve conter sinais bioquímicos e mecânicos que ajuda na manutenção celularviabilidade e função. Estes factores adicionais, perfis bioquímicos e mecânicos, pode ter uma influência significativa sobre a função bem sucedida de construções de tecido bioprinted. Ambas as células e a matriz extracelular nativa (ECM) são responsáveis ​​por apresentar uma vasta gama de moléculas de sinalização, tais como factores de crescimento e outras citoquinas a outras células. A combinação destes sinais varia de tecido para tecido, mas pode ser extremamente potente e influente na regulação do comportamento celular e tecidual. 18 Empregando componentes ECM específicos de tecidos a partir de diferentes órgãos e execução como um hidrogel ou como parte de um hidrogel tem sido explorada com sucesso. 19-21 Esta abordagem, que é composta de descelularizante um dado tecido, pulverizando-o, e dissolvendo-o, pode ser utilizado para produzir sinais bioquímicos específicos de tecido a partir de qualquer tecido e pode ser incorporada em 3-D construções de hidrogel 22. Além disso,é amplamente documentado que os tecidos do corpo ocupam uma grande variedade de rigidezes 23 como tal., a capacidade para sintonizar as propriedades mecânicas de biomateriais, tais como o módulo de elasticidade E &#39;ou módulo de cisalhamento G elástica&#39;, é uma ferramenta útil em engenharia de tecidos . Como descrito acima, o controlo de propriedades mecânicas bioink permite biofabrication à base de extrusão usando um gel suave, o que pode, em seguida, ainda manipulado por reticulação secundário, a um ponto mais tarde, altura em que os níveis do módulo de elasticidade pode ser alcançada que coincidir com o tipo de órgão-alvo. Por exemplo, biomateriais pode ser personalizado para corresponder a uma rigidez de 5-10 kPa como um fígado nativo, 23, ou coincidir com uma rigidez de 10-15 kPa como o tecido cardíaco nativo, 24,25, em teoria, aumentar a capacidade destes para funcionar em Organóides um modo semelhante aos seus homólogos tecido nativo. A influência da rigidez do ambiente no fenótipo da célula tem sido explored nos últimos anos, particularmente em relação às células-tronco. Engler et ai. Demonstrou que a elasticidade do substrato auxiliado na condução células estaminais mesenquimais (MSC) no sentido de linhagens com a elasticidade do tecido correspondente ao do substrato. 25 Este conceito tem sido explorada para a diferenciação no músculo, a função cardíaca, fenótipo hepática, a proliferação de células-tronco hematopoiéticas e manutenção do potencial terapêutico das células estaminais. 24,26-29 ser capaz de sintonizar um hidrogel de diferentes módulos de elasticidade é uma característica importante de um biomaterial que vai ser utilizado para biofabricate construções de tecido 30. Descrevemos aqui um protocolo que representa uma abordagem versátil utilizado no nosso laboratório para formular um sistema de hidrogel que pode ser de extrusão bioprinted e personalizado para 1) contêm o perfil bioquímico de um tipo de tecido particular, e 2) imitar o módulo de elasticidade desse tipo de tecido . Ao abordar esses requisitos, pretendemos provide um material que pode recapitular as características físico-químicas e biológicas do tecido in vivo. 31 O sistema composto hidrogel modular aqui descrito tira vantagem de uma abordagem de reticulação multi-para se obter bioinks extrudiveis, e permite uma reticulação secundária para estabilizar e aumenta a rigidez da produtos finais para corresponder a uma gama de tipos de tecidos. personalização bioquímica é cumprida usando componentes da matriz extracelular de tecidos específicos. Como uma demonstração, nós empregamos uma variedade específica de fígado deste sistema hidrogel para bioprint fígado funcional construções organï¿½de. O protocolo descrito usa um personalizado 3-D dispositivo bioprinting. Em geral, este protocolo pode ser adaptado para a maioria das impressoras de extrusão, os parâmetros de impressão específicas variar drasticamente para cada tipo de dispositivo e exigir testes pelo utilizador.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="903">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hyaluronic acid</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">53747</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Gelatin</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G6144</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">410896</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:340px;">Hyaluronic acid and gelatin hydrogel kit (HyStem-HP)</td>
			<td style="width:108px;">ESI-BIO</td>
			<td style="width:119px;">GS315</td>
			<td style="width:336px;">Kit contains the components Heprasil (thiolated and heparinized hyaluronic acid), Gelin-S (thiolated gelatin), and Extralink (PEGDA)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">PEG 8-Arm Alkyne, 10 kDa</td>
			<td style="width:108px;">Creative PEGWorks</td>
			<td>PSB-887</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Primary human hepatocytes</td>
			<td style="width:108px;">Triangle Research Labs</td>
			<td>HUCPM6</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Primary human liver stellate cells</td>
			<td style="width:108px;">ScienCell</td>
			<td style="width:119px;">5300</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Primary human Kupffer cells</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">HUKCCS</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hepatocyte Basal Media (HBM)</td>
			<td style="width:108px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-3199</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:340px;">Hepatocyte Media Supplement Kit</td>
			<td style="width:108px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-3198</td>
			<td style="width:336px;">HCM SingleQuot Kits (contains ascorbic acid, 0.5mL; bovine serum albumin [fatty acid free], 10 mL; gentamicin sulfate/amphotericin B, 0.5mL; hydrocortisone 21-hemisuccinate, 0.5 mL; insulin, 0.5 mL; human recombinant epidermal growth factor, 0.5 mL; transferring, 0.5 mL)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td style="width:336px;">Other manufacturers are ok.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Ammonium hydroxide</td>
			<td style="width:108px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A669</td>
			<td style="width:336px;">Other manufacturers are ok.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Fresh porcine cadaver tissue</td>
			<td style="width:108px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Lyophilizer</td>
			<td style="width:108px;">any</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Freezer mill</td>
			<td style="width:108px;">any</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:340px;">Bioprinter</td>
			<td style="width:108px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;">The bioprinter described herein was custom built in-house. In general, other devices are adequate provided they support computer controlled extrusion-based printing of hydrogel materials.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hanging drop cell culture plate</td>
			<td style="width:108px;">InSphero</td>
			<td>CS-06-001</td>
			<td style="width:336px;">InSphero GravityPlus 3D Culture Platform</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

Quando os processos acima descritos são seguidos correctamente, hidrogeles devem conter um perfil bioquímico específico para o tipo de tecido alvo, 20 para permitir um elevado grau de controlo sobre bioprinting e módulo de elasticidade final, e 34 suportam células viáveis ​​funcionais em construções de tecido. hidrogel Personalização Para melhor fígado nativo mímico...

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Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting celularizado Constrói Usando um específico do tecido Hidrogel Bioink

Nós descrevemos um conjunto de protocolos que, juntos, oferecem uma bioink hidrogel que imita o tecido com o qual construções de tecido 3-D funcionais e viáveis ​​podem ser bioprinted para uso em aplicações in vitro de rastreio.

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

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