Name: bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink
Uploaded: 2016-04-21T14:00:00
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Los autores agradecen la financiación de la Agencia de Defensa de Reducción de Amenazas (DTRA) bajo Espacio y Sistemas de Guerra Naval Pacific Center (SSC Pacífico) Contrato No. N6601-13-C-2027. La publicación de este material no implica la aprobación por parte del gobierno de los resultados o las conclusiones de este documento.

1. hidrogel Bioink Formulaciones y Preparación <ol><li> Con el fin de proporcionar perfiles bioquímicos específicos de tejido, específico de tejido preparar ECM digerir soluciones como se describió anteriormente para el hígado. 20 Nota: En general, esta ECM digest comprenderá 40% del volumen bioink hidrogel final que se emplea. Varios cientos de mililitros de solución de ECM digesto se pueden preparar, alícuotas, y se congelaron a -80 ° C para uso futuro. </li><li> Antes de hidrogel formula...

Hay varios componentes que son críticos a considerar cuando se trata de construcciones de tejido biofabricate 3-D, para su posible uso en seres humanos o para aplicaciones de detección in vitro. El empleo de los componentes celulares apropiadas determina la funcionalidad potencial final, mientras que el dispositivo Biofabrication sí determina la metodología general para llegar al constructo final. El tercer componente, el biomaterial, es igualmente importante, ya que sirve el doble papel. Específicamente, ...

En los últimos años, una variedad de tecnologías se han convertido en disponibles que aborda la necesidad de fuentes alternativas de órganos y tejidos funcionales mediante la búsqueda de fabricar, o biofabricate, ellos. Bioprinting ha surgido como uno de los más prometedores de estas tecnologías. Bioprinting se puede considerar como una forma de fabricación aditiva robótico de partes biológicas, que se puede utilizar para construir o modelo viable estructuras de órganos similares o similar a un tejido en 3 dimensiones. 1 En la mayoría de los casos, bioprinting emplea un 3 dimensiones (3 -D) dispositivo de impresión que está dirigido por un ordenador para depositar las células y biomateriales en posiciones precisas, recapitulando lo tanto anatómica que imitan arquitecturas fisiológicas. 2 Estos dispositivos de impresión de un &quot;bioink&quot;, que puede tomar la forma de agregados de células, las células encapsuladas en hidrogeles o fluidos viscosos, o microportadores sembrado de células, así como polímeros libres de células que proporcionan estructura mecánica o actuar como pla libre de células3,4. ceholders Siguiendo el proceso bioprinting, la estructura resultante puede ser madurados en las estructuras de tejidos u órganos funcionales, y se utilizan para su aplicación final previsto. 5,6 Hasta la fecha, un órgano de tamaño humano completamente funcional completa no se ha impreso, pero sigue siendo el principal objetivo a largo plazo de bioprinting investigación y desarrollo. 2 sin embargo, a pequeña escala &quot;organoides&quot; construcciones de tejido actualmente están siendo implementados en una serie de aplicaciones, incluyendo el modelado patología, desarrollo de fármacos, y la investigación de la toxicología. Uno de los principales obstáculos que los investigadores han encontrado en la aplicación de tecnología bioprinting es que muy pocos materiales han sido desarrollados con el propósito explícito de bioprinting. Para tener éxito con eficacia en bioprinting, un biomaterial debe cumplir 4 requisitos básicos. El biomaterial debe tener 1) las propiedades mecánicas adecuadas para permitir la deposición (sea extrusión a través de una boquilla como un gel o un inkjet como una gota), 2) la capacidad para mantener su forma como un componente de una estructura 3-D después de la deposición, 3) la capacidad de control de los usuarios de las 2 características anteriores, y 4) el medio ambiente amistoso y de apoyo una célula en absoluto fases del procedimiento. bioprinting 7 Históricamente, el trabajo bioprinting menudo ha tratado de emplear biomateriales tradicionales existentes en dispositivos bioprinting sin tener en cuenta su compatibilidad, en lugar de diseñar un biomaterial que tienen las propiedades necesarias para bioprinting y aplicaciones de post-impresión posteriores. Una variedad de bioinks se han desarrollado recientemente para mejor interfaz con el hardware de deposición y fabricación. sistemas de hidrogel estándar plantean problemas significativos debido a que generalmente existen como sea precursor de soluciones de fluidos con propiedades mecánicas insuficientes, o hidrogeles polimerizados que si imprimen pueden obstruir las boquillas o se rompan suba sobre el proceso de extrusión. Nuestro equipo, así como otheRS, han explorado diversas formulaciones de hidrogel para hacer frente a estos problemas bioprinting, incluyendo la impresión de esferoides de células en sustratos de hidrogel, 5,8 celular y el filamento de hidrogel de extrusión de tubos microcapillary, 9-11 extruibles ácido hialurónico (HA) hidrogeles de nanopartículas con propiedades de reticulación -Gold dinámicos , 12 de control temporal de la rigidez de hidrogel utilizando fotopolimerizable metacrilado HA y gelatina, 13 de reticulación basado en fibrinógeno-trombina, 14,15 geles de alginato-colágeno de intercambio iónico, 16 y recientemente rápida polimerización de luz ultravioleta (UV) de reticulación -initiated, 17 Estos ejemplos demuestran la viabilidad de los materiales de generación que puede ser bioprinted eficacia. Sin embargo, además de la integración con el hardware, para generar con éxito construcciones de tejido viable y funcional 3-D, los biomateriales deben contener señales bioquímicas y mecánicas que ayuda en el mantenimiento celularviabilidad y función. Estos factores adicionales, perfiles bioquímicos y mecánicos, pueden tener una influencia significativa en la función exitosa de construcciones de tejido bioprinted. Tanto las células y la matriz extracelular nativa (ECM) son responsables de presentar una amplia gama de moléculas de señalización, tales como factores de crecimiento y otras citoquinas a otras células. La combinación de estas señales varía de un tejido a otro, pero puede ser extremadamente potente e influyente en la regulación del comportamiento de células y tejidos. 18 El empleo de componentes de ECM específicos de tejido de diferentes órganos y la aplicación como un hidrogel o como parte de un hidrogel ha sido explorado con éxito. 19-21 Este enfoque, que se compone de decellularizing un tejido dado, pulverizando, y disolviéndolo, se puede utilizar para producir señales bioquímicas específicas de tejido de cualquier tejido y pueden incorporarse en construcciones de hidrogel 3-D. 22 Adicionalmente,es ampliamente documentado que los tejidos del cuerpo ocupan una amplia gama de rigideces. 23 Como tal, la capacidad de sintonizar las propiedades mecánicas de los biomateriales, tales como el módulo de elasticidad E &#39;o cizallamiento módulo elástico G&#39;, es una herramienta útil en la ingeniería de tejidos . Como se describió anteriormente, el control sobre las propiedades mecánicas bioink permite Biofabrication basado en extrusión usando un gel suave, que puede entonces manipulado adicionalmente por reticulación secundaria en un momento posterior, en la que los niveles de módulo de elasticidad se pueden lograr que coincide con la del tipo de órgano diana. Por ejemplo, los biomateriales se pueden personalizar para que coincida con una rigidez de 5 a 10 kPa como un hígado nativo, 23 o que coincida con una rigidez de 10 a 15 kPa como tejido cardíaco nativo, 24,25, en teoría, el aumento de la capacidad de estos organoides para funcionar en de manera similar a sus contrapartes tejido nativo. La influencia de la rigidez del medio ambiente en el fenotipo celular se ha explored en los últimos años, en particular con respecto a las células madre. Engler et al. Demostraron que la elasticidad de sustrato con la ayuda en la conducción de las células madre mesenquimales (MSC) hacia linajes con la elasticidad del tejido equivalente a la de sustrato. 25 Este concepto ha sido explorado adicionalmente para la diferenciación en músculo, la función cardíaca, el fenotipo del hígado, la proliferación de células madre hematopoyéticas , y el mantenimiento de células madre potencial terapéutico. 24,26-29 ser capaz de sintonizar un hidrogel a diferentes módulos de elasticidad es una característica importante de un biomaterial que se utiliza para biofabricate construcciones de tejido. 30 Aquí se describe un protocolo que representa un enfoque versátil que se utiliza en nuestro laboratorio para formular un sistema de hidrogel que se puede extrusión bioprinted, y personalizar para 1) contener el perfil bioquímico de un tipo de tejido particular, y 2) imitan el módulo elástico de ese tipo de tejido . Al abordar estos requisitos, nuestro objetivo es provide un material que puede recapitular las características fisicoquímicas y biológicas de in vivo de tejidos. 31 El sistema compuesto de hidrogel modular descrito en el presente documento se aprovecha de un enfoque de reticulación múltiples para producir bioinks extruibles, y permite una reticulación secundaria para estabilizar y aumenta la rigidez de la productos finales para que coincida con una gama de tipos de tejidos. personalización bioquímica se cumple mediante el uso de componentes de ECM específicos de tejido. Como demostración, empleamos una variedad específica del hígado de este sistema de hidrogel de Bioprint hígado funcional construcciones organoides. El protocolo descrito utiliza un dispositivo bioprinting 3-D personalizado. En general, este protocolo se puede adaptar a la mayoría de las impresoras de base de extrusión, los parámetros de impresión específicas varían dramáticamente para cada tipo de dispositivo y requieren pruebas por el usuario.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="903">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hyaluronic acid</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">53747</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Gelatin</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G6144</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">410896</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:340px;">Hyaluronic acid and gelatin hydrogel kit (HyStem-HP)</td>
			<td style="width:108px;">ESI-BIO</td>
			<td style="width:119px;">GS315</td>
			<td style="width:336px;">Kit contains the components Heprasil (thiolated and heparinized hyaluronic acid), Gelin-S (thiolated gelatin), and Extralink (PEGDA)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">PEG 8-Arm Alkyne, 10 kDa</td>
			<td style="width:108px;">Creative PEGWorks</td>
			<td>PSB-887</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Primary human hepatocytes</td>
			<td style="width:108px;">Triangle Research Labs</td>
			<td>HUCPM6</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Primary human liver stellate cells</td>
			<td style="width:108px;">ScienCell</td>
			<td style="width:119px;">5300</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Primary human Kupffer cells</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">HUKCCS</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hepatocyte Basal Media (HBM)</td>
			<td style="width:108px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-3199</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:340px;">Hepatocyte Media Supplement Kit</td>
			<td style="width:108px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-3198</td>
			<td style="width:336px;">HCM SingleQuot Kits (contains ascorbic acid, 0.5mL; bovine serum albumin [fatty acid free], 10 mL; gentamicin sulfate/amphotericin B, 0.5mL; hydrocortisone 21-hemisuccinate, 0.5 mL; insulin, 0.5 mL; human recombinant epidermal growth factor, 0.5 mL; transferring, 0.5 mL)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td style="width:336px;">Other manufacturers are ok.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Ammonium hydroxide</td>
			<td style="width:108px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A669</td>
			<td style="width:336px;">Other manufacturers are ok.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Fresh porcine cadaver tissue</td>
			<td style="width:108px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Lyophilizer</td>
			<td style="width:108px;">any</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Freezer mill</td>
			<td style="width:108px;">any</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:340px;">Bioprinter</td>
			<td style="width:108px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;">The bioprinter described herein was custom built in-house. In general, other devices are adequate provided they support computer controlled extrusion-based printing of hydrogel materials.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hanging drop cell culture plate</td>
			<td style="width:108px;">InSphero</td>
			<td>CS-06-001</td>
			<td style="width:336px;">InSphero GravityPlus 3D Culture Platform</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

Cuando los procedimientos descritos anteriormente se siguen correctamente, los hidrogeles deben contener un perfil bioquímico específico para el tipo de tejido diana, 20 permiten un alto grado de control sobre bioprinting y módulo elástico final, 34 y apoyar células funcionales viables en construcciones de tejido. Personalización de hidrogel Para mejor hígado nativo mímica,...

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Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting Cellularized Construye El uso de un Tejidos específicos de hidrogel Bioink

Se describe un conjunto de protocolos que en conjunto proporcionan un bioink hidrogel imitando tejido con el que construcciones de tejido 3-D funcionales y viables se pueden bioprinted para su uso en aplicaciones de cribado in vitro.

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

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