Name: bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink
Uploaded: 2016-04-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink at JoVE.com

Författarna erkänner tacksamt finansiering från Reduction Agency (DTRA) under Space och Naval Warfare Systems Center Pacific (SSC PACIFIC) kontrakt nr N6601-13-C-2027 Defense Threat. Offentliggörandet av detta material utgör inte godkännande av regeringen av resultaten eller slutsatser häri.

1. Hydrogel Bioink Formuleringar och förberedelser <ol><li> För att tillhandahålla vävnadsspecifika biokemiska profiler, förbereda vävnadsspecifik ECM smälta lösningar som tidigare beskrivits för lever. 20 Obs: I allmänhet kommer denna ECM Digest omfatta 40% av den slutliga hydrogel bioink volym som används. Flera hundra milliliter av ECM uppslutningslösningen kan framställas, alikvoterades och frystes vid -80 ° C för framtida användning. </li><li> Före hydrogelformulering, upplösa ...

Det finns flera komponenter som är kritiska att tänka på när man försöker biofabricate 3-D vävnadskonstrukten, för eventuell användning i människor, eller för in vitro-screening program. Under användning av lämpliga cellulära komponenterna bestämmer slutet potentiella funktionalitet, medan biofabrication enheten själv bestämmer den allmänna metoden för att nå slutkonstruktionen. Den tredje komponenten, biomaterialet, är lika viktigt, eftersom det tjänar dubbla roller. Specifikt måste biom...

Under de senaste åren har en mängd olika tekniker blir tillgängliga som tar upp behovet av alternativa källor till funktionella organ och vävnader genom att försöka tillverka eller biofabricate, dem. Bioprinting har dykt upp som en av de mest lovande av dessa tekniker. Bioprinting kan betraktas som en form av robot additiv tillverkning av biologiska delar, som kan användas för att bygga eller mönster livskraftig organliknande eller vävnadsliknande strukturer i 3 dimensioner. 1 I de flesta fall utnyttjar bioprinting en 3-dimensionell (3 -D) utskriftsenhet som styrs av en dator för att sätta in celler och biomaterial i exakta positioner, vilket rekapitulera anatomiskt liknande fysiologiska arkitekturer. 2 Dessa enheter ut en &quot;bioink&quot;, som kan ta formen av cellaggregat, celler inkapslade i hydrogeler eller viskösa vätskor, eller cellsådd mikrobärare, såväl som cellfria polymerer som ger mekaniska struktur eller fungera som cellfritt placeholders. 3,4 Efter bioprinting processen, kan den resulterande strukturen mognat till funktionell vävnad eller organstrukturer och används för sitt avsedda slut ansökan. 5,6 Hittills en komplett fullt fungerande människa-sized organ har inte skrivits ut, men det är fortfarande den främsta långsiktiga mål för bioprinting forskning och utveckling. 2 emellertid småskaliga &quot;organoid&quot; vävnadskonstrukten förs för närvarande i ett antal applikationer, inklusive patologi modellering, läkemedelsutveckling och toxikologi screening. En av de största hindren som forskare har stött på vid tillämpningen bioprinting tekniken är att mycket få material har utvecklats för det uttryckliga syftet att bioprinting. För att effektivt lyckas bioprinting måste ett biomaterial uppfylla 4 grundläggande krav. Biomaterialet måste ha 1) lämpliga mekaniska egenskaper för att möjliggöra avsättning (oavsett om det strängsprutning genom ett munstycke som en gel eller en inkjet som en droppe), 2) förmågan att hålla sin form som en del av en 3-D struktur efter avsättning, 3) förmåga för användaren kontroll av de 2 tidigare egenskaper, och 4) en cell vänlig och stödjande miljö alls faser av bioprinting förfarande. 7 Historiskt bioprinting arbete har ofta försökt att använda befintliga traditionella biomaterial i bioprinting enheter utan hänsyn till deras kompatibilitet, i stället för att utforma ett biomaterial för att ha de egenskaper som är nödvändiga för bioprinting och efterföljande efterutskriftstillämpningar. En mängd olika bioinks har nyligen utvecklats för att på ett bättre gränssnitt med avsättningen och tillverkning hårdvara. Standard hydrogel system utgör stora problem eftersom de finns i allmänhet antingen föregångare Fluid Solutions med otillräckliga mekaniska egenskaper, eller polymeriserade hydrogeler som om de utskrivna kan täppa munstycken eller blir delas upp på extruderingsprocessen. Vårt team, liksom andrasrs, har undersökt olika hydrogelformuleringar att ta itu med dessa bioprinting problem, bland annat cell sfäroid utskrift i hydrogel substrat, 5,8 cell och hydrogel filament extrudering från microcapillary rör, 9-11 strängsprut hyaluronsyra (HA) -guld nanopartiklar hydrogeler med dynamiska tvärbindningsegenskaper , 12 temporal kontroll av hydrogel styvhet med användning av fotopolymeriserbara metakrylerade HA och gelatin, 13 fibrinogen-trombin-baserade tvärbindning, 14,15 jonisk utbytes alginat-kollagen-geler, 16 och nyligen snabba polymeriserande ultraviolett ljus (UV) -initiated tvärbindning, 17 Dessa exempel visar möjligheten att generera material som kan genom bioprinted effektivt. Men förutom integration med hårdvara, för att framgångsrikt generera livskraftiga och funktionella 3-D vävnad konstruktioner måste biomaterial innehålla biokemiska och mekaniska signaler som stöd för att upprätthålla cellulärlivsduglighet och funktion. Dessa ytterligare faktorer, biokemiska och mekaniska profiler, kan ha en betydande inverkan på den framgångsrika funktion bioprinted vävnadskonstruktioner. Båda cellerna och den nativa extracellulära matrisen (ECM) är ansvariga för att presentera ett brett spektrum av signalmolekyler, såsom tillväxtfaktorer och andra cytokiner till andra celler. Kombinationen av dessa signaler varierar från vävnad till vävnad, men kan vara extremt potent och inflytelserik vid reglering cell- och vävnads beteende. 18 Under användning av vävnadsspecifika ECM-komponenter från olika organ och genomförande som en hydrogel eller som del av en hydrogel har undersökts med framgång. 19-21 Detta tillvägagångssätt, som är sammansatt av decellularizing en given vävnad, pulverisering den, och lösa upp den, kan användas för att framställa vävnadsspecifika biokemiska signaler från någon vävnad och kan införlivas i 3-D-hydrogel-konstruktioner. 22 Dessutom,det är allmänt dokumenterat att vävnader i kroppen upptar ett brett spektrum av styvheter. 23 Som sådan, förmågan att avstämma de mekaniska egenskaperna hos biomaterial, såsom elasticitetsmodulen E &#39;eller skjuvning elasticitetsmodul G&#39;, är ett användbart verktyg i vävnadsteknik . Såsom beskrivits ovan, kontroll över bioink mekaniska egenskaper möjliggör extrudering baserade biofabrication med användning av en mjuk gel, som sedan kan manipuleras ytterligare genom sekundär tvärbindning vid en senare punkt, vid vilken elasticitetsmodul nivåer kan uppnås som matchar den hos typ målorganet. Till exempel, kan biomaterial anpassas för att matcha en styvhet på 5-10 kPa som en infödd lever, 23 eller matcha en styvhet på 10 till 15 kPa som nativt hjärtvävnad, 24,25 teoretiskt ökar förmågan hos dessa organoids att fungera i ett liknande sätt som deras nativa vävnads motsvarigheter. Inverkan av miljö styvhet på cellfenotyp har explored under de senaste åren, särskilt med avseende på stamceller. Engler et al. Visade att substrat elasticitet understödda i drivande mesenkymala stamceller (MSC) mot linjerna med vävnadens elasticitet matchar den hos substratet. 25 Detta koncept har vidare utforskas för differentiering till muskel, hjärtfunktion, lever fenotyp, hematopoetisk stamcellsproliferering , och underhåll av stamcells terapeutiska potential. 24,26-29 att kunna ställa en hydrogel till olika elasticitetsmoduler är en viktig egenskap hos ett biomaterial som kommer att användas för att biofabricate vävnadskonstrukten. 30 Här beskriver vi ett protokoll som utgör en mångsidig metod som används i vårt laboratorium för att formulera en hydrogel system som kan extrudering bioprinted och anpassade för att 1) ​​innehåller den biokemiska profilen hos en speciell vävnad typ och 2) härma elasticitetsmodulen hos den vävnadstyp . Genom att ta itu med dessa krav, strävar vi efter att provide ett material som kan sammanfatta de fysiokemiska och biologiska egenskaper för in vivo vävnad. 31 Modul hydrogel kompositsystem som beskrivs häri utnyttjar en flertvärbindande tillvägagångssätt för erhållande av extruderbara bioinks, och tillåter en sekundär tvärbindning för att stabilisera och ökar styvheten hos den end produkter för att matcha en rad vävnadstyper. Biochemical anpassning uppfylls genom att använda vävnadsspecifika ECM-komponenter. Som en demonstration, använder vi en leverspecifik variation av denna hydrogel system Bioprint funktionella lever organoid konstruktioner. Protokollet som beskrivs med ett anpassat 3-D bioprinting enhet. I allmänhet kan detta protokoll anpassas till de flesta extrudering-baserade skrivare, specifika utskriftsparametrar varierar kraftigt för varje typ av enhet och kräver testning av användaren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="903">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hyaluronic acid</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">53747</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Gelatin</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G6144</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">410896</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:340px;">Hyaluronic acid and gelatin hydrogel kit (HyStem-HP)</td>
			<td style="width:108px;">ESI-BIO</td>
			<td style="width:119px;">GS315</td>
			<td style="width:336px;">Kit contains the components Heprasil (thiolated and heparinized hyaluronic acid), Gelin-S (thiolated gelatin), and Extralink (PEGDA)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">PEG 8-Arm Alkyne, 10 kDa</td>
			<td style="width:108px;">Creative PEGWorks</td>
			<td>PSB-887</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Primary human hepatocytes</td>
			<td style="width:108px;">Triangle Research Labs</td>
			<td>HUCPM6</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Primary human liver stellate cells</td>
			<td style="width:108px;">ScienCell</td>
			<td style="width:119px;">5300</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Primary human Kupffer cells</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">HUKCCS</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hepatocyte Basal Media (HBM)</td>
			<td style="width:108px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-3199</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:340px;">Hepatocyte Media Supplement Kit</td>
			<td style="width:108px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-3198</td>
			<td style="width:336px;">HCM SingleQuot Kits (contains ascorbic acid, 0.5mL; bovine serum albumin [fatty acid free], 10 mL; gentamicin sulfate/amphotericin B, 0.5mL; hydrocortisone 21-hemisuccinate, 0.5 mL; insulin, 0.5 mL; human recombinant epidermal growth factor, 0.5 mL; transferring, 0.5 mL)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td style="width:336px;">Other manufacturers are ok.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Ammonium hydroxide</td>
			<td style="width:108px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A669</td>
			<td style="width:336px;">Other manufacturers are ok.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Fresh porcine cadaver tissue</td>
			<td style="width:108px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Lyophilizer</td>
			<td style="width:108px;">any</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Freezer mill</td>
			<td style="width:108px;">any</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:340px;">Bioprinter</td>
			<td style="width:108px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;">The bioprinter described herein was custom built in-house. In general, other devices are adequate provided they support computer controlled extrusion-based printing of hydrogel materials.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hanging drop cell culture plate</td>
			<td style="width:108px;">InSphero</td>
			<td>CS-06-001</td>
			<td style="width:336px;">InSphero GravityPlus 3D Culture Platform</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

När de förfaranden som beskrivs ovan följs korrekt, bör hydrogeler innehåller en biokemisk profil som är specifik för målvävnaden typ, 20 möjliggöra en hög grad av kontroll över bioprinting och slutelasticitetsmodul, 34 och stödja livskraftiga funktionella celler i vävnadskonstruktioner. hydrogel Anpassning För att bäst härma infödda levern, var hydrogelen bioink...

Watch this Scientific Journal Video about Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink at JoVE.com

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting Cellularized Konstrukt användning av en vävnadsspecifik Hydrogel Bioink

Vi beskriver en uppsättning protokoll som tillsammans ger en vävnadsliknande hydrogel bioink som funktionella och livskraftiga 3-D konstruktioner vävnads kan bioprinted för användning i in vitro screeningsapplikationer.

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

Syntes av ett intein medierad Artificiell Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

Lönsamhet Bioprinted Cellular konstruktioner med hjälp av en tre Dispenser cartesianska skrivare

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting av brosk och hud vävnad analoger utnyttja en roman passiv enhet blandningsteknik för Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

Pankreasvävnad-härledda extracellulära matrix Bioink för utskrift 3D cell-lastat Pankreasvävnad konstruktioner

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Protokoll för 3D Bioprinning av gelatin Methacryloyl hydrogel baserade Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

Using Multilayered Hydrogel Bioink in Three-Dimensional Bioprinting for Homogeneous Cell Distribution

Använda flerskiktad Hydrogel Bioink i tredimensionell bioprinting för homogen cellfördelning

During the extrusion-based three-dimensional bioprinting process, liquid-like bioinks with low viscosity can protect cells from membrane damage induced by ...

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

3D Bioprinting av Murine Cortical Astrocytes för engineering neural-liknande vävnad

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...

Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering

Beredning och karakterisering av grafenbaserat 3D-biohybridhydrogelbiobläck för perifer neuroengineering

Peripheral neuropathies can occur as a result of axonal damage, and occasionally due to demyelinating diseases. Peripheral nerve damage is a global ...

Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting

Gelatinmetakryloylgranulära hydrogelställningar: Mikrogeltillverkning med hög genomströmning, frystorkning, kemisk montering och 3D-bioprinting

The emergence of granular hydrogel scaffolds (GHS), fabricated via assembling hydrogel microparticles (HMPs), has enabled microporous scaffold formation ...

Phototunable Bioprinted Hydrogels to Probe Cellular Responses to ECM Stiffening

3D Bioprinting Phototunable Hydrogels to Study Fibroblast Activation

Understanding Chronic Lung Diseases Using 3D Printed Phototunable Hydrogels (Video) | JoVE

3D-bioprintning av fotoavstämbara hydrogeler för att studera fibroblastaktivering

Phototunable hydrogels can transform spatially and temporally in response to light exposure. Incorporating these types of biomaterials in cell-culture ...