Name: isolation and characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar chromatin organization
Uploaded: 2016-01-07T12:00:01
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization at JoVE.com

M.M. and C.A.R. acknowledge the financial support of the Ministero della Salute, Ricerca Finalizzata/giovani ricercatori anno 2009 of the Fondazione IRCCS Ospedale San Matteo, Pavia (I). M.M and C.A.R. wish to thank Marianna Longo for helping with the images preparation.

Dit protocol wordt uitgevoerd in overeenstemming met de grondbeginselen van de Europese (EU-63/2010) en Italiaanse (26/2014) wetten ter bescherming van dieren gebruikt voor wetenschappelijk onderzoek. Cervicale dislocatie euthanasie wordt gebruikt voor de eierstokken isolatie en het wordt uitgevoerd door deskundige en getraind in het goedgekeurde protocol met betrekking tot dit onderzoek vermelde personen. 1. Dieren <ol><li> Onderhouden volwassen 3- tot 6-weken oude vrouwelijke muizen in een kamer met gecontro...

<ol>
	<li>Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+antral+follicles:+oocyte+nucleus+and+the+karyosphere+formation+(electron+microscopic+and+autoradiographic+data).">Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data).</a> Gamete Res. 22 (2), 219-231 (1989).</li><li>Anderiesz, C., Ferraretti, A. P., Magli, C., Fiorentino, A., Fortini, D., Gianaroli, L., Jones, G. M., Trounson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+recombinant+human+gonadotropins+on+human,+bovine+and+murine+oocyte+meiosis,+fertilization+and+embryonic+development+in+vitro.">Effect of recombinant human gonadotropins on human, bovine and murine oocyte meiosis, fertilization and embryonic development in vitro.</a> Human Reprod. 15 (5), 1140-1148 (2000).</li><li>Mattson, B. A., Albertini, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis:+Chromatin+and+microtubule+dynamics+during+meiotic+prophase.">Oogenesis: Chromatin and microtubule dynamics during meiotic prophase.</a> Mol. Reprod. Dev. 25 (4), 374-383 (1990).</li><li>Debey, P., Szollosi, M. S., Szollosi, D., Vautier, D., Girousse, A., Besomber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competent+mouse+oocytes+isolated+from+antral+follicles+exhibit+different+chromatin+organization+and+follow+different+maturation+dynamics.">Competent mouse oocytes isolated from antral follicles exhibit different chromatin organization and follow different maturation dynamics.</a> Mol. Reprod. Dev. 36 (1), 59-74 (1993).</li><li>Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+organisation+during+mouse+oocyte+growth.">Chromatin organisation during mouse oocyte growth.</a> Mol. Reprod. Dev. 41 (1-2), 479-485 (1995).</li><li>Wu, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+oocytes+for+in+vitro+maturation+by+brilliant+cresyl+blue+staining:+a+study+using+the+mouse+model.">Selection of oocytes for in vitro maturation by brilliant cresyl blue staining: a study using the mouse model.</a> Cell Res. 17, 722-731 (2007).</li><li>Opiela, Y., K&#261;tska-Ksi&#261;&#380;kiewicz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+utility+of+Brilliant+Cresyl+Blue+(BCB)+staining+of+mammalian+oocytes+used+for+in+vitro+embryo+production+(IVP).">The utility of Brilliant Cresyl Blue (BCB) staining of mammalian oocytes used for in vitro embryo production (IVP).</a> Reproductive Biol. 13, 177-183 (2013).</li><li>Labrecque, R., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+study+of+mammalian+oocyte+competence+by+transcriptome+analysis:+progress+and+challenges.">The study of mammalian oocyte competence by transcriptome analysis: progress and challenges.</a> Mol. Human Reprod. 20 (2), 103-116 (2014).</li><li>Monti, M., Zanoni, M., Calligaro, A., Ko, M. S., Mauri, P. L., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+arrest+and+mouse+antral+Not-Surrouded+Nucleolus+oocyte.">Developmental arrest and mouse antral Not-Surrouded Nucleolus oocyte.</a> Biol. Reprod. 88 (1), 1-7 (2013).</li><li>Yurttas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+PADI6+and+the+cytoplasmic+lattices+in+ribosomal+storage+in+oocytes+and+translational+control+in+the+early+mouse+embryo.">Role for PADI6 and the cytoplasmic lattices in ribosomal storage in oocytes and translational control in the early mouse embryo.</a> Development. 135 (15), 2627-2636 (2008).</li><li>Li, L., Baibakov, B., Dean, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+subcortical+maternal+complex+essential+for+preimplantation+mouse+embryogenesis.">A subcortical maternal complex essential for preimplantation mouse embryogenesis.</a> Dev. Cell. 15 (3), 416-425 (2008).</li><li>Ami, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FT-IR+spectra+signatures+of+mouse+antral+oocytes:+molecular+markers+of+oocyte+maturation+and+developmental+competence.">FT-IR spectra signatures of mouse antral oocytes: molecular markers of oocyte maturation and developmental competence.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1813 (6), 1220-1222 (2011).</li><li>Fulton, B. P., Whittingam, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+mammalian+oocytes+by+intercellular+injection+of+calcium.">Activation of mammalian oocytes by intercellular injection of calcium.</a> Nature. 273 (5658), 149-151 (1978).</li><li>Luttmer, S. J., Longo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+living+and+fixed+gametes+and+early+embryos+stained+with+supravital+fluorochromes+(Hoechst+33342+and+3,3&#8242;-dihexyloxacarbocyanine+iodide).">Examination of living and fixed gametes and early embryos stained with supravital fluorochromes (Hoechst 33342 and 3,3&#8242;-dihexyloxacarbocyanine iodide).</a> Gamete Res. 15 (3), 267-283 (1986).</li><li>Monti, M., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biopolitics+of+frozen+embryos.">The biopolitics of frozen embryos.</a> Int. J. Dev. Biol. 55, 243-247 (2011).</li></ol>

Dit protocol beschrijft de methode die wordt gebruikt om te isoleren en te classificeren muis antral GV eicellen. Er zijn geen specifieke kritische stappen te onderstrepen, met enkele uitzonderingen. Ten eerste: deze procedure moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd om: a) behoud van de vitaliteit van de eicellen en b) voorkomen pH veranderingen in het gebruikte medium. Ten tweede: eicellen moeten kort worden opgewekt (5-10 sec) om Hoechst33342 chromatine schade en daaropvolgende dood van de oöcyten te voorkomen, voora...

Antrale volgroeide eicellen (GV, kiemblaasje) geïsoleerd uit de antrale compartiment van het ovarium worden routinematig gebruikt voor verschillende doeleinden zoals bijvoorbeeld het onderzoek van de moleculaire en cellulaire mechanismen achter in vitro rijping tot metafase II stadium. Ondanks hun mooie uiterlijk meest antral eicellen, maar niet alle, zijn in staat om de meiose te voltooien en bereiken de blastocyststadium; in feite, vele zoogdiersoorten, waaronder mensen 1,2, ongeveer 30% van hen arrestatie hun ontwikkeling op de 2-cel stadium, wanneer bevruchting plaatsvindt 3-5. Tot op heden zijn enkele parameters die worden gebruikt om onderscheid te maken tussen de eicellen in staat om de embryonale ontwikkeling van die daartoe niet in staat te houden. Bijvoorbeeld, cresyl blauw kleuring (BCB) is een valide methode om de oöcyten basis van de activiteit van glucose-6-fosfaat-dehydrogenase sorteren, hoewel het nut van deze sorteermethode verband met BCB + of BCB- kleuringnog laboratorium afhankelijk 6-8. Een andere bekende methode woont in hun chromatine organisatie: als gekleurd met elke DNA intercalerende kleurstoffen (zoals Hoechst33342), 70% van de antrale eicellen laten een dye-positieve ring rond de nucleolus en heten Omringd Nucleolus (SN), terwijl de resterende 30% tonen een gevlekte positieve signalen en heten niet omringd Nucleolus (NSN) 3-5. Recent toonden we aan dat het ontbreken van cytoplasma roosters 9 (CPLS belangrijke opslagplaatsen voor maternale mRNA en ribosomen in zowel zoogdieren eicellen en embryo&#39;s) 10 en de down-regulatie van MATER (essentieel voor CPLS vorming 11), samen met de aanwezigheid van vetdruppels in hun cytoplasma 9,12, kunnen andere oorzaken verband met de NSN eicellen onvermogen verder komt dan het 2-cel stadium. Helaas kan paar technieken worden toegepast op antrale SN en NSN eicellen en sorteren,Daarom zou de ontwikkeling van een minder invasieve werkwijze (zonder nucleaire kleuring, fixatie of manipulatie met de mond pipetten) zeer belangrijk geworden om de tarieven van menselijke en dierlijke embryo ontwikkeling. In dit artikel hebben we detail de eenvoudige en snelle protocol dat wordt gebruikt om ad soort SN en NSN antrale eicellen van vrouwelijke muizen te isoleren en het is gericht tot alle wetenschappers geïnteresseerd in de studie van de vrouwelijke gametogenese, eicel maturatie en embryo-ontwikkeling.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PMSG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmbrioMax M2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-015-PD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst33342</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish 35mmx10mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Dish 35mm, high glass bottom</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Pasteur Borosilicate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7095D-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assemblies for calibrated micropillary pipettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar chromatin organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures. 
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

De volgende foto&#39;s tonen de methode die wordt gebruikt om antrale eicellen te isoleren van de muis eierstokken, vanaf pipetten voorbereiding tot het sorteren van de eicellen &#39;door middel van Hoechst33342. Deze methode is heel eenvoudig en kan in een laboratorium met een CO2 incubator, een stereomicroscoop en een fluorescentiemicroscoop uitgerust met de juiste filter voor de waarneming van de Hoechst33342 uitgevoerd Figuur 1 toont de eerste stap pipet p...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization at JoVE.com

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

Hier presenteren we een protocol voor de karakterisering van muis antral eicellen gebaseerd op nucleolair organisatie.

Isolatie en karakterisering van de Muis Antral Eicellen Gebaseerd op Hergroepering van nucleoli chromatine Organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Isolatie en Kwantitatieve Immunocytochemische karakterisering van primaire Myogene cellen en fibroblasten van Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Isolatie en karakterisering van Satellite Cellen van Rat Head Branchiomeric Spieren

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolatie en karakterisering van enkele cellen van zebravis embryo&#39;s

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

Isolatie en karakterisering van mesenchymale stromale cellen uit menselijke navelstreng en foetale Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

Een roman gebruik van driedimensionale hoogfrequente Ultrasonografie voor vroege zwangerschap karakterisering in de muis

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes

Een neuraal netwerk-gebaseerde identificatie van ontwikkelingsachterstand bevoegde of incompetente muis volgroeide eicellen

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus ...

Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants

Isolatie en karakterisatie van menselijke navelstreng afkomstige mesenchymale stamcellen van vroeggeboorte en termijn zuigelingen

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

Differentiatie en karakterisering van neurale voorlopercellen en neuronen uit embryonale stamcellen van muizen

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

Minimale volume vitrificatie van onvolwassen feline oocyten

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

In Vitro Cultuur Strategie voor Eicellen uit early antral follikel bij runderen

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...