Name: isolation and characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar chromatin organization
Uploaded: 2016-01-07T12:00:01
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization at JoVE.com

M.M. and C.A.R. acknowledge the financial support of the Ministero della Salute, Ricerca Finalizzata/giovani ricercatori anno 2009 of the Fondazione IRCCS Ospedale San Matteo, Pavia (I). M.M and C.A.R. wish to thank Marianna Longo for helping with the images preparation.

इस प्रोटोकॉल यूरोपीय के मार्गदर्शक सिद्धांत (ईयू 63/2010) और वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए इस्तेमाल जानवरों की रक्षा इतालवी (26/2014) कानूनों के अनुसार आयोजित किया जाता है। सरवाइकल अव्यवस्था इच्छामृत्यु अंडाशय अलगाव के ?...

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	<li>Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+antral+follicles:+oocyte+nucleus+and+the+karyosphere+formation+(electron+microscopic+and+autoradiographic+data).">Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data).</a> Gamete Res. 22 (2), 219-231 (1989).</li><li>Anderiesz, C., Ferraretti, A. P., Magli, C., Fiorentino, A., Fortini, D., Gianaroli, L., Jones, G. M., Trounson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+recombinant+human+gonadotropins+on+human,+bovine+and+murine+oocyte+meiosis,+fertilization+and+embryonic+development+in+vitro.">Effect of recombinant human gonadotropins on human, bovine and murine oocyte meiosis, fertilization and embryonic development in vitro.</a> Human Reprod. 15 (5), 1140-1148 (2000).</li><li>Mattson, B. A., Albertini, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis:+Chromatin+and+microtubule+dynamics+during+meiotic+prophase.">Oogenesis: Chromatin and microtubule dynamics during meiotic prophase.</a> Mol. Reprod. Dev. 25 (4), 374-383 (1990).</li><li>Debey, P., Szollosi, M. S., Szollosi, D., Vautier, D., Girousse, A., Besomber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competent+mouse+oocytes+isolated+from+antral+follicles+exhibit+different+chromatin+organization+and+follow+different+maturation+dynamics.">Competent mouse oocytes isolated from antral follicles exhibit different chromatin organization and follow different maturation dynamics.</a> Mol. Reprod. Dev. 36 (1), 59-74 (1993).</li><li>Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+organisation+during+mouse+oocyte+growth.">Chromatin organisation during mouse oocyte growth.</a> Mol. Reprod. Dev. 41 (1-2), 479-485 (1995).</li><li>Wu, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+oocytes+for+in+vitro+maturation+by+brilliant+cresyl+blue+staining:+a+study+using+the+mouse+model.">Selection of oocytes for in vitro maturation by brilliant cresyl blue staining: a study using the mouse model.</a> Cell Res. 17, 722-731 (2007).</li><li>Opiela, Y., K&#261;tska-Ksi&#261;&#380;kiewicz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+utility+of+Brilliant+Cresyl+Blue+(BCB)+staining+of+mammalian+oocytes+used+for+in+vitro+embryo+production+(IVP).">The utility of Brilliant Cresyl Blue (BCB) staining of mammalian oocytes used for in vitro embryo production (IVP).</a> Reproductive Biol. 13, 177-183 (2013).</li><li>Labrecque, R., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+study+of+mammalian+oocyte+competence+by+transcriptome+analysis:+progress+and+challenges.">The study of mammalian oocyte competence by transcriptome analysis: progress and challenges.</a> Mol. Human Reprod. 20 (2), 103-116 (2014).</li><li>Monti, M., Zanoni, M., Calligaro, A., Ko, M. S., Mauri, P. L., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+arrest+and+mouse+antral+Not-Surrouded+Nucleolus+oocyte.">Developmental arrest and mouse antral Not-Surrouded Nucleolus oocyte.</a> Biol. Reprod. 88 (1), 1-7 (2013).</li><li>Yurttas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+PADI6+and+the+cytoplasmic+lattices+in+ribosomal+storage+in+oocytes+and+translational+control+in+the+early+mouse+embryo.">Role for PADI6 and the cytoplasmic lattices in ribosomal storage in oocytes and translational control in the early mouse embryo.</a> Development. 135 (15), 2627-2636 (2008).</li><li>Li, L., Baibakov, B., Dean, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+subcortical+maternal+complex+essential+for+preimplantation+mouse+embryogenesis.">A subcortical maternal complex essential for preimplantation mouse embryogenesis.</a> Dev. Cell. 15 (3), 416-425 (2008).</li><li>Ami, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FT-IR+spectra+signatures+of+mouse+antral+oocytes:+molecular+markers+of+oocyte+maturation+and+developmental+competence.">FT-IR spectra signatures of mouse antral oocytes: molecular markers of oocyte maturation and developmental competence.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1813 (6), 1220-1222 (2011).</li><li>Fulton, B. P., Whittingam, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+mammalian+oocytes+by+intercellular+injection+of+calcium.">Activation of mammalian oocytes by intercellular injection of calcium.</a> Nature. 273 (5658), 149-151 (1978).</li><li>Luttmer, S. J., Longo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+living+and+fixed+gametes+and+early+embryos+stained+with+supravital+fluorochromes+(Hoechst+33342+and+3,3&#8242;-dihexyloxacarbocyanine+iodide).">Examination of living and fixed gametes and early embryos stained with supravital fluorochromes (Hoechst 33342 and 3,3&#8242;-dihexyloxacarbocyanine iodide).</a> Gamete Res. 15 (3), 267-283 (1986).</li><li>Monti, M., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biopolitics+of+frozen+embryos.">The biopolitics of frozen embryos.</a> Int. J. Dev. Biol. 55, 243-247 (2011).</li></ol>

इस प्रोटोकॉल को अलग और माउस कोटरीय जीवी oocytes वर्गीकृत करने के लिए प्रयोग किया जाता विधि का वर्णन है। कुछ अपवादों के साथ, रेखांकित करने के लिए कोई विशेष महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। क) oocytes की जीवन शक्ति को बनाए ...

अंडाशय के कोटरीय डिब्बे से अलग कोटरीय पूर्ण विकसित oocytes (जीवी, कीटाणु पुटिका) नियमित रूप से इस तरह के रूप में विभिन्न प्रयोजनों के लिए उपयोग किया जाता है, उदाहरण के लिए, मेटाफ़ेज़ द्वितीय चरण तक इन विट्रो परिपक्वता के पीछे आणविक और सेलुलर तंत्र का अध्ययन। उनके सुंदर दिखने के सबसे कोटरीय oocytes के बावजूद, लेकिन सभी नहीं, अर्धसूत्रीविभाजन को पूरा करने और ब्लास्टोसिस्ट चरण तक पहुंचने के लिए सक्षम हैं; निषेचन 3-5 होती है, तो वास्तव में, मनुष्य 1,2 सहित कई स्तनधारी प्रजातियों में, उनमें से लगभग 30%, 2 सेल मंच पर उनके विकास को गिरफ्तार। तिथि करने के लिए, कुछ मापदंडों ऐसा करने में असमर्थ उन से भ्रूण के विकास को बनाए रखने के लिए सक्षम oocytes के बीच भेद करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। उदाहरण के लिए, cresyl नीले धुंधला (बीसीबी) बीसीबी + या BCB- धुंधला से संबंधित इस छँटाई विधि की उपयोगिता है, हालांकि ग्लूकोज-6-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज की गतिविधि के आधार पर oocytes सुलझाने के लिए एक वैध तरीका हैअभी भी 6-8 निर्भर प्रयोगशाला। एक और अच्छी तरह से स्थापित विधि उनकी क्रोमेटिन संगठन में रहता है: (Hoechst33342) की तरह किसी भी डीएनए intercalating रंगों के साथ दाग, तो कोटरीय oocytes की 70% न्यूक्लियस के चारों ओर एक डाई सकारात्मक अंगूठी दिखाने के लिए और न्यूक्लियस (एस एन) घिरा कहा जाता है 30%, जबकि शेष एक अधिक देखा सकारात्मक संकेतों दिखाने के लिए और (NSN) 3-5 नहीं घिरा न्यूक्लियस कहा जाता है। हाल ही में हमने दिखाया कि साइटोप्लास्मिक lattices 9 (CPLS, स्तनधारी oocytes और भ्रूण दोनों में माता के रूप में ली गई mRNA और राइबोसोम के लिए महत्वपूर्ण भंडारण साइटों) के अभाव में 10 और की उपस्थिति के साथ एक साथ (CPLS गठन 11 के लिए आवश्यक) विद्यालय के नीचे विनियमन, उनकी cytoplasms 9,12 में लिपिड बूंदों, 2-सेल चरण से आगे बढ़ने के लिए NSN oocytes अक्षमता से संबंधित अन्य कारणों से हो सकता है। दुर्भाग्य से, कुछ तकनीकों कोटरीय एस.एन. और NSN oocytes और सुलझाने के लिए लागू किया जा सकता है,इस कारण के लिए, (परमाणु धुंधला, निर्धारण प्रक्रियाओं या मुंह pipettes साथ हेरफेर के बिना) एक कम इनवेसिव विधि का विकास दोनों मानव और पशुओं के भ्रूण के विकास की दरों में वृद्धि करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण हो सकता है। इस पत्र में, हम विस्तार से सरल और त्वरित प्रोटोकॉल विज्ञापन प्रकार एस.एन. और मादा चूहों से NSN कोटरीय oocytes को अलग-थलग करने के लिए इस्तेमाल किया और यह महिला gametogenesis, डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता और भ्रूण के विकास के अध्ययन में रुचि रखने वाले सभी वैज्ञानिकों को संबोधित किया है।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PMSG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmbrioMax M2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-015-PD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst33342</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish 35mmx10mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Dish 35mm, high glass bottom</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Pasteur Borosilicate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7095D-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assemblies for calibrated micropillary pipettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar chromatin organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures. 
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

निम्नलिखित चित्र Hoechst33342 के माध्यम से oocytes &#39;छँटाई करने के लिए pipettes तैयारी से शुरू, माउस अंडाशय से कोटरीय oocytes को अलग-थलग करने के लिए इस्तेमाल किया विधि दिखा। यह पद्धति काफी सरल है और सीओ 2 इनक्य...

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Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

यहाँ हम nucleolar संगठन के आधार पर माउस कोटरीय oocytes के लक्षण वर्णन के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे।

Nucleolar Chromatin संगठन के आधार पर माउस कोटरीय oocytes के अलगाव और विशेषता

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

मानव कंकाल की मांसपेशी से प्राथमिक myogenic कोशिकाओं और fibroblasts के अलगाव और मात्रात्मक Immunocytochemical विशेषता

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

चूहा हेड Branchiomeric मांसपेशियों से अलगाव और उपग्रह कोशिकाओं की विशेषता

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

अलगाव और zebrafish भ्रूण से एकल कक्ष की विशेषता

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

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मानव गर्भनाल और भ्रूण प्लेसेंटा से अलगाव और Mesenchymal Stromal कोशिकाओं की विशेषता

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

माउस में प्रारंभिक गर्भावस्था लक्षण वर्णन के लिए तीन आयामी उच्च आवृत्ति ट्रा का एक उपंयास का उपयोग

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

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तंत्रिका नेटवर्क-आधारित विकास के सक्षम या अक्षम माउस की पहचान पूरी तरह से बड़े हो अंडाणुओं

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus ...

Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants

अलगाव और मानव गर्भनाल के लक्षण वर्णन-व्युत्पंन Mesenchymal और अवधि के शिशुओं से स्टेम सेल

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

माउस भ्रूणस्टेम कोशिकाओं से तंत्रिका जनक और न्यूरॉन्स का भेदभाव और लक्षण वर्णन

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Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

अपरिपक्व फेलिन ओसाइट्स का न्यूनतम वॉल्यूम विट्रीफिकेशन

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

पशुओं में अर्ली एंट्रल कूप से Oocytes के लिए विट्रो संस्कृति रणनीति

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...