Name: isolation and characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar chromatin organization
Uploaded: 2016-01-07T12:00:01
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M.M. and C.A.R. acknowledge the financial support of the Ministero della Salute, Ricerca Finalizzata/giovani ricercatori anno 2009 of the Fondazione IRCCS Ospedale San Matteo, Pavia (I). M.M and C.A.R. wish to thank Marianna Longo for helping with the images preparation.

이 프로토콜은 유럽의 원칙 (EU 2천10분의 63)과 과학 연구에 사용되는 동물을 보호하는 이탈리아어 (2천14분의 26) 법에 따라 수행된다. 경추 탈구 안락사는 난소 분리를 위해 사용되며, 이는 본 연구를 덮는 승인 프로토콜에 나열된 개인 전문가에 의해 수행되고 훈련된다. 1. 동물 <ol><li> 제어 온도와 습도 방에 6 주령의 암컷 마우스에 성인 3을 유지한다 (12L의 단계와 : 12D와 공급 임의로).</e...

<ol>
	<li>Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+antral+follicles:+oocyte+nucleus+and+the+karyosphere+formation+(electron+microscopic+and+autoradiographic+data).">Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data).</a> Gamete Res. 22 (2), 219-231 (1989).</li><li>Anderiesz, C., Ferraretti, A. P., Magli, C., Fiorentino, A., Fortini, D., Gianaroli, L., Jones, G. M., Trounson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+recombinant+human+gonadotropins+on+human,+bovine+and+murine+oocyte+meiosis,+fertilization+and+embryonic+development+in+vitro.">Effect of recombinant human gonadotropins on human, bovine and murine oocyte meiosis, fertilization and embryonic development in vitro.</a> Human Reprod. 15 (5), 1140-1148 (2000).</li><li>Mattson, B. A., Albertini, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis:+Chromatin+and+microtubule+dynamics+during+meiotic+prophase.">Oogenesis: Chromatin and microtubule dynamics during meiotic prophase.</a> Mol. Reprod. Dev. 25 (4), 374-383 (1990).</li><li>Debey, P., Szollosi, M. S., Szollosi, D., Vautier, D., Girousse, A., Besomber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competent+mouse+oocytes+isolated+from+antral+follicles+exhibit+different+chromatin+organization+and+follow+different+maturation+dynamics.">Competent mouse oocytes isolated from antral follicles exhibit different chromatin organization and follow different maturation dynamics.</a> Mol. Reprod. Dev. 36 (1), 59-74 (1993).</li><li>Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+organisation+during+mouse+oocyte+growth.">Chromatin organisation during mouse oocyte growth.</a> Mol. Reprod. Dev. 41 (1-2), 479-485 (1995).</li><li>Wu, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+oocytes+for+in+vitro+maturation+by+brilliant+cresyl+blue+staining:+a+study+using+the+mouse+model.">Selection of oocytes for in vitro maturation by brilliant cresyl blue staining: a study using the mouse model.</a> Cell Res. 17, 722-731 (2007).</li><li>Opiela, Y., K&#261;tska-Ksi&#261;&#380;kiewicz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+utility+of+Brilliant+Cresyl+Blue+(BCB)+staining+of+mammalian+oocytes+used+for+in+vitro+embryo+production+(IVP).">The utility of Brilliant Cresyl Blue (BCB) staining of mammalian oocytes used for in vitro embryo production (IVP).</a> Reproductive Biol. 13, 177-183 (2013).</li><li>Labrecque, R., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+study+of+mammalian+oocyte+competence+by+transcriptome+analysis:+progress+and+challenges.">The study of mammalian oocyte competence by transcriptome analysis: progress and challenges.</a> Mol. Human Reprod. 20 (2), 103-116 (2014).</li><li>Monti, M., Zanoni, M., Calligaro, A., Ko, M. S., Mauri, P. L., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+arrest+and+mouse+antral+Not-Surrouded+Nucleolus+oocyte.">Developmental arrest and mouse antral Not-Surrouded Nucleolus oocyte.</a> Biol. Reprod. 88 (1), 1-7 (2013).</li><li>Yurttas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+PADI6+and+the+cytoplasmic+lattices+in+ribosomal+storage+in+oocytes+and+translational+control+in+the+early+mouse+embryo.">Role for PADI6 and the cytoplasmic lattices in ribosomal storage in oocytes and translational control in the early mouse embryo.</a> Development. 135 (15), 2627-2636 (2008).</li><li>Li, L., Baibakov, B., Dean, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+subcortical+maternal+complex+essential+for+preimplantation+mouse+embryogenesis.">A subcortical maternal complex essential for preimplantation mouse embryogenesis.</a> Dev. Cell. 15 (3), 416-425 (2008).</li><li>Ami, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FT-IR+spectra+signatures+of+mouse+antral+oocytes:+molecular+markers+of+oocyte+maturation+and+developmental+competence.">FT-IR spectra signatures of mouse antral oocytes: molecular markers of oocyte maturation and developmental competence.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1813 (6), 1220-1222 (2011).</li><li>Fulton, B. P., Whittingam, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+mammalian+oocytes+by+intercellular+injection+of+calcium.">Activation of mammalian oocytes by intercellular injection of calcium.</a> Nature. 273 (5658), 149-151 (1978).</li><li>Luttmer, S. J., Longo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+living+and+fixed+gametes+and+early+embryos+stained+with+supravital+fluorochromes+(Hoechst+33342+and+3,3&#8242;-dihexyloxacarbocyanine+iodide).">Examination of living and fixed gametes and early embryos stained with supravital fluorochromes (Hoechst 33342 and 3,3&#8242;-dihexyloxacarbocyanine iodide).</a> Gamete Res. 15 (3), 267-283 (1986).</li><li>Monti, M., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biopolitics+of+frozen+embryos.">The biopolitics of frozen embryos.</a> Int. J. Dev. Biol. 55, 243-247 (2011).</li></ol>

이 프로토콜은 분리 및 마우스 전 정부 GV 난자를 분류하기 위해 사용 된 방법을 설명한다. 몇 가지 예외를 제외하고, 밑줄 특별히 중요한 단계가 없습니다. ) 난자의 활력을 유지하고 b)에 사용되는 배지에서 pH 변화를 방지 : 첫째 :이 절차는 가능한 한 빨리 수행되어야한다. 둘째 : 난자는 IVM과 체외 수정은 다음 단계는 특히, 염색질 손상 및 난자의 후속 죽음을 피하기 위해 Hoechst33342에 (5 ~ 10 초) ?...

난소 전 정부 구획실로부터 분리 전 정부 완전히 자란 난자 (GV, 새싹 소포)는 일상적 같은 다른 목적을 위해 사용되는 예를 들면, 중기 II 단계까지 시험 관내 성숙 뒤에 분자 세포 메카니즘의 연구. 그들의 아름다운 외관에도 불구하고 대부분의 전 정부 난자, 전부는 아니지만, 감수 분열을 완료하고 포배기에 도달 할 수있다; 시비 3-5 발생할 경우 실제로 인간 1,2- 포함한 많은 포유류 종에서, 이들 중 약 30 %, 2 단계에서 셀들이 개발 체포. 현재까지, 몇몇 파라미터는 그렇게 할 수없는 것과 배아 발달을 유지할 수 난자를 구별하기 위해 사용된다. 예를 들어, 크레 실 블루 염색 (BCB)은 BCB + 또는 BCB- 염색 관련이 정렬 방법의 유용성이 있지만 글루코오스 -6- 포스페이트 탈수소 효소의 활성에 기초하여 난자를 정렬하는 방법으로서 유효한여전히 6-8 의존 실험실. 또 다른 잘 확립 된 방법은 염색질 조직에있는 (Hoechst33342 같은) 어떤 DNA의 인터 염료로 염색하는 경우, 전 정부 난자의 70 %가 핵소체 주위에 염료 긍정적 인 반지를 보여 핵소체 (SN)를 둘러싸인라고 30 %를 유지하면서 더 발견 긍정적 인 신호를 보여주고 (NSN) 3-5하지 둘러싸인 핵소체라고합니다. 최근에 우리는 보여 주었다 세포질 그릴 (9) (CPLS, 포유류의 난자와 배아 모두 모계 유래의 mRNA와 리보솜에 중요한 저장 사이트)의 부재 (10)의 존재와 함께 (CPLS 형성 (11)에 대한 필수) 이잖아요의 하향 조절, 그들의 세포질 9,12- 지질 방울, 2 세포 단계 이상으로 진행 NSN 난자의 무능력과 관련된 다른 원인이 될 수 있습니다. 불행하게도, 몇몇 기술은 전 정부 SN과 NSN의 난자와 정렬을 적용 할 수 있습니다,이러한 이유로, (핵 염색, 정착 절차 또는 입 피펫으로 조작없이) 덜 침습적 방법의 개발이 모두 인간과 동물의 배아 발달의 속도를 높이기 위해 매우 중요해질 수있다. 본 논문에서는 세부 간단하고 빠른 프로토콜은 광고 정렬 SN과 여성의 생쥐에서 NSN 전 정부 난자를 격리하는 데 사용됩니다 그것은 여성 배우자, 난자의 성숙과 배아 개발의 연구에 관심이있는 모든 과학자들에게 해결됩니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PMSG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmbrioMax M2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-015-PD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst33342</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish 35mmx10mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Dish 35mm, high glass bottom</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Pasteur Borosilicate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7095D-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assemblies for calibrated micropillary pipettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar chromatin organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures. 
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

다음 이미지 Hoechst33342 의해 난자 &#39;정렬에 피펫 준비부터 마우스 난소 전 정부로부터 난자를 분리하기 위해 사용 된 방법을 보여준다. 이 방법은 매우 간단하고, CO2 인큐베이터, 실체 현미경과 Hoechst33342의 관측을위한 올바른 필터를 갖춘 형광 현미경에 장착 된 임의의 실험실에서 수행 될 수있다 (1) 수치는 피펫 제조의 초기 단계를 보여준다. 유리 ?...

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Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

여기에서 우리는 핵소체 조직을 기반으로 마우스의 전 정부 난자의 특성에 대한 프로토콜을 제시한다.

핵소체 염색질 조직을 바탕으로 마우스 전 정부 난 모세포의 분리 및 특성

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

인간의 골격근에서 기본 근육 조직 세포와 섬유 아 세포의 분리 및 정량 면역 세포 화학 특성

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

연구

발생학

Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

쥐 머리 Branchiomeric 근육에서 분리 및 위성 세포의 특성

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

분리 및 Zebrafish의 배아에서 단일 세포의 특성

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

인간 제대혈 및 태아 태반에서 중간 엽 기질 세포의 분리 및 특성

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

마우스에서 초기 임신 특성에 대 한 3 차원 높은-주파수 초음파의 새로운 사용

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes

발달 능력 또는 무능 한 마우스 가득 Oocytes의 신경 네트워크 기반 식별

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus ...

Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants

절연 및 인간의 탯 유래 중간 엽 줄기 세포 Preterm와 기간 유아에서의 특성화

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

마우스 배아 줄기 세포에서 신경 전조및 뉴런의 분화 및 특성화

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

미성숙한 고양이 오키트의 최소 볼륨 바이트화

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

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가축의 초기 개국 여포에서 온수에 대한 생체 외 문화 전략

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...