Name: isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres
Uploaded: 2016-02-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres at JoVE.com

The authors thank Guillermina Hill-Teran and Marie-Elise Schwartz for assistance. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (5R00HL105791 to S.N.) and from the Alzheimer (NIRP 12-259162). This work was also supported by Institut National de la Sant&#233; et de la Recherche M&#233;dicale (CFC and JLT), Agence Nationale de la Recherche (13-BSV4-0002-01 (JLT), NIH (1R01EB016629-01A1 (JLT), Connecticut Stem Cell Research Fund (13-SCA-Yale-04 (JLT).

Sebrafisk av WT CF belastningen ble reist og vedlikeholdes i henhold til protokoller godkjent av Yale University Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC protokollen antall 2012-11473). Alle forsøkene bør først bli godkjent av alle relevante statlige og institusjonelle etikk regulerer organer om bruk av dyr til forskningsformål. 1. Forberedelser <ol><li> Forbered 10 ml disseksjon medium, legge 200 mL av 100x penicillin-streptomycin inn 9,8 ml DMEM...

<ol>
	<li>Rietze, R. L., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+isolation+and+characterization.">Neural stem cell isolation and characterization.</a> Methods Enzymol. 419, 3-23 (2006).</li><li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+neurons+and+neurospheres.">Isolation and culture of adult neurons and neurospheres.</a> Nat Protoc. 2, 1490-1498 (2007).</li><li>Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+multipotent+neural+stem+or+progenitor+cells+from+both+the+dentate+gyrus+and+subventricular+zone+of+a+single+adult+mouse.">Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse.</a> Nat Protoc. 7, 2005-2012 (2012).</li><li>Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+wide+open:+a+critical+review+of+sphere-formation+as+an+assay+for+stem+cells.">Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 486-498 (2011).</li><li>Winter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+neural+stem+cell+segmentation,+tracking+and+lineaging+with+validation+and+editing.">Vertebrate neural stem cell segmentation, tracking and lineaging with validation and editing.</a> Nat Protoc. 6, 1942-1952 (2011).</li><li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+neural+stem+cells.">Mammalian neural stem cells.</a> Science. 287, 1433-1438 (2000).</li><li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship.">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nat Methods. 2, 333-336 (2005).</li><li>Ghosh, C., Liu, Y., Ma, C., Collodi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cultures+derived+from+early+zebrafish+embryos+differentiate+in+vitro+into+neurons+and+astrocytes.">Cell cultures derived from early zebrafish embryos differentiate in vitro into neurons and astrocytes.</a> Cytotechnology. 23, 221-230 (1997).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+neuron+culture+for+nerve+growth+and+axon+guidance+studies+in+zebrafish+(Danio+rerio).">Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in zebrafish (Danio rerio).</a> PloS one. 8, e57539 (2013).</li><li>Hinsch, K., Zupanc, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+long-term+persistence+of+new+neurons+in+the+adult+zebrafish+brain:+a+quantitative+analysis.">Generation and long-term persistence of new neurons in the adult zebrafish brain: a quantitative analysis.</a> Neuroscience. 146, 679-696 (2007).</li><li>Ristori, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dicer-miR-107+interaction+regulates+biogenesis+of+specific+miRNAs+crucial+for+neurogenesis.">A dicer-miR-107 interaction regulates biogenesis of specific miRNAs crucial for neurogenesis.</a> Dev Cell. 32, 546-560 (2015).</li><li>Louis, S. K., SIegel, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Viability+Analysis+Using+Trypan+Blue:+Manual+and+Automated+Methods.">Cell Viability Analysis Using Trypan Blue: Manual and Automated Methods.</a> Methods Mol Bio. 740, (2011).</li><li>Harrison, M. M., Jenkins, B. V., O'Connor-Giles, K. M., Wildonger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR+view+of+development.">A CRISPR view of development.</a> Genes dev. 28, 1859-1872 (2014).</li><li>Marz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+progenitor+cell+subtypes+in+the+ventricular+zone+of+the+zebrafish+adult+telencephalon.">Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon.</a> Glia. 58, 870-888 (2010).</li></ol>

Hovedformålet med denne protokollen er å isolere og kultur voksne sebrafisk hjerne-avledet Neurosfærene for å studere cellulære og molekylære funksjoner i nevrale stilk / stamceller. Her rapporterer vi hvordan du velger multipotente nerveceller og generere de tre nevrale celletyper, dvs. astrocytter, nevroner og oligodendrocytter, fra den voksne sebrafisk hjernen. Protokollen er av stor betydning ettersom en reproduserbar neurosfære dannende analysen ikke hadde blitt etablert i sebrafisk så langt. <...

Pattedyr nevrale stamceller (NSC) er blitt karakterisert in vitro ved deres evne til å vokse i frittflytende kulturer som klynger av delende celler betegnet neurosfærer 1. I nærvær av epidermal vekstfaktor (EGF), og fibroblast vekstfaktor (FGF), NSCs dele enten symmetrisk for å generere selv-fornyende NSCs, eller asymmetrisk for å generere to forskjellige datterceller, det vil si., En differensierende stamceller og en ny NSC. Neurosfære kulturer er derfor en blanding av nervestammen / stamceller og mer differensierte neuralceller 2-4 NSCs kan imidlertid skilles fra andre neurosfære celletyper ved to spesifikke egenskaper. De viser langtidsselvfornyelse i fritt flytende kulturer og de ​​kan differensiere til alle nervecelle linjene (dvs. neuroner, astrocytter og oligodendrocytter) etter seponering av vekstfaktorer og adhesjon til ekstracellulære matrise underlag. i mammals, neurosfærene kultursystemet var det første system anvendes for å demonstrere nærværet av NSCs i den voksne hjernen in vitro og er fortsatt den mest brukte verktøy for å analysere proliferasjon, selvfornyelse kapasitet og multipotency av nevrale stamceller og forløperceller. Derfor, selv om kule dannende analyser lider av noen ulemper og begrensninger 4, er denne kulturen systemet verdifullt for å vurdere potensialet for en celle til å oppføre seg som en stamcelle når fjernet fra sin in vivo nisje 4 og har vært medvirkende til å identifisere viktige regulatorer av NSC selvfornyelse og celle skjebne besluttsomhet 5-7. I motsetning til pattedyr som har begrenset voksen neurogenesis, sebrafisk konstitutivt produsere nye nerveceller langs hele hjernen akse gjennom hele sitt liv. Sebrafisk voksne hjernen viser flere nevrogene nisjer husing nevrale stamceller / stamceller gjør sebrafisk en kraftig modellorganisme for å forstå than stamcelle aktivitet i hjernen, så vel som de molekylære programmer som kreves for sentralnervesystemet regenerering. I løpet av de siste 17 årene, flere forskningsgrupper utviklet metoder for å isolere og dyrking sebrafisk nerveceller 8,9. Disse studiene var rettet mot å produsere embryonale nevronale og gliaceller in vitro, men ikke på å opprettholde NSCs og undersøke deres egenskaper. Selv Neurosfærene har blitt generert i den voksne Apteronotus leptorhynchus (Brown Ghost Knifefish) 10, en neurosfære dannende analyse i sebrafisk gjensto å bli etablert. Her beskriver vi en neurosfære dannende analyse for å demonstrere hvilken rolle MIR-107 i løpet av sebrafisk nevrogenese 11. Protokollen gjør det mulig: 1) innsamling av voksne nevrale stilk / stamceller enten fra sebrafisk hele hjernen eller fra flere dissekert områder av hjernen som telencephalon den Tectum, og lillehjernen; 2) generering av flytende og selvfornyende Neurosfærene fra voksne nevrale stilk / stamceller; 3) den ned- og opp-regulering av ekspresjonen av gener eller små ikke-kodende RNA 11 i neurosfærer, for å undersøke deres roller i proliferasjon og differensiering av nevrale stilk / stamceller.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DPBS 1X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 1X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine hydrochloride monohydrate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6852-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>N-2 supplement (100x) liquid&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630</td>
			<td>1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose 45%&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-basic&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>&#160;100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5500-50 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA&#160;</td>
			<td>TCI</td>
			<td>P0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB11072-04000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine MS-222</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5040</td>
			<td>stock solution of 4 mg/ml.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trycold gel&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TGP8</td>
			<td>gel pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa Basic Nucleofector Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPI-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.

Generelt Scheme av Adult Sebrafisk neurosfærer Culture Her beskriver vi alle trinnene i protokollen for en neurosfære dannende analyse utført fra den voksne sebrafisk hjernen. Først har voksne nevrale stilk / stamceller er hentet enten fra sebrafisk hele hjernen eller fra flere dissekert områder av hjernen som telencephalon, den Tectum og lillehjernen (figur 1A-C). Enkelt celle suspensjon av voksne nevral...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres at JoVE.com

Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

Her gir vi en reproduserbar metode for å undersøke voksen neurogenesis bruker en neurosfære analyse avledet fra hele hjernen eller fra enten telencephalic, tectal eller lillehjernen regioner av den voksne sebrafisk hjernen. I tillegg beskriver vi fremgangsmåten for å manipulere genekspresjon i sebrafisk neurosfærer.

Isolasjon og Culture of Adult Sebrafisk Brain-avledet Neurosfærer

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Nyre Regeneration i Adult Sebrafisk av Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolering og karakterisering av enkeltceller fra sebrafisk embryo

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation and Expansion of Adult Canine Hippocampal Neural Precursors

Isolering og Utvidelse av Voksen Canine Hippokampale Neural Prekursorer

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Utarbeidelse og kultur myogenisk forloperceller / Primær myoblasts fra Skeletal Muscle of Adult og Gamle mennesker

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

Culture of Adult Transgene Sebrafisk Netthinne explants for Live-celle Imaging av multiphoton Mikros

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Isolasjon, kultur og differensiering av benmarg Stromal celler og Osteoclast Progenitors fra mus

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

Isolasjon og kultur av primære Epicardial celler avledet fra menneskelige voksne og fosterets hjerte prøver

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Kultur og Transfection sebrafisk primære celler

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Hydrogenion-mediert siRNA Gene-stanse i voksen sebrafisk hjerte

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Voksen sebrafisk skade modeller for å studere virkningene av prednisolon i å regenerere benvev

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...