Name: isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres
Uploaded: 2016-02-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres at JoVE.com

The authors thank Guillermina Hill-Teran and Marie-Elise Schwartz for assistance. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (5R00HL105791 to S.N.) and from the Alzheimer (NIRP 12-259162). This work was also supported by Institut National de la Sant&#233; et de la Recherche M&#233;dicale (CFC and JLT), Agence Nationale de la Recherche (13-BSV4-0002-01 (JLT), NIH (1R01EB016629-01A1 (JLT), Connecticut Stem Cell Research Fund (13-SCA-Yale-04 (JLT).

Данио штамма WT CF были подняты и поддерживается в соответствии с протоколами , утвержденными Institutional Animal Care и использование комитета Йельского университета (IACUC номер протокола 2012-11473) путем. Все эксперименты должны быть сначала одобрены всеми соответствующими правитель?...

<ol>
	<li>Rietze, R. L., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+isolation+and+characterization.">Neural stem cell isolation and characterization.</a> Methods Enzymol. 419, 3-23 (2006).</li><li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+neurons+and+neurospheres.">Isolation and culture of adult neurons and neurospheres.</a> Nat Protoc. 2, 1490-1498 (2007).</li><li>Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+multipotent+neural+stem+or+progenitor+cells+from+both+the+dentate+gyrus+and+subventricular+zone+of+a+single+adult+mouse.">Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse.</a> Nat Protoc. 7, 2005-2012 (2012).</li><li>Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+wide+open:+a+critical+review+of+sphere-formation+as+an+assay+for+stem+cells.">Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 486-498 (2011).</li><li>Winter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+neural+stem+cell+segmentation,+tracking+and+lineaging+with+validation+and+editing.">Vertebrate neural stem cell segmentation, tracking and lineaging with validation and editing.</a> Nat Protoc. 6, 1942-1952 (2011).</li><li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+neural+stem+cells.">Mammalian neural stem cells.</a> Science. 287, 1433-1438 (2000).</li><li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship.">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nat Methods. 2, 333-336 (2005).</li><li>Ghosh, C., Liu, Y., Ma, C., Collodi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cultures+derived+from+early+zebrafish+embryos+differentiate+in+vitro+into+neurons+and+astrocytes.">Cell cultures derived from early zebrafish embryos differentiate in vitro into neurons and astrocytes.</a> Cytotechnology. 23, 221-230 (1997).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+neuron+culture+for+nerve+growth+and+axon+guidance+studies+in+zebrafish+(Danio+rerio).">Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in zebrafish (Danio rerio).</a> PloS one. 8, e57539 (2013).</li><li>Hinsch, K., Zupanc, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+long-term+persistence+of+new+neurons+in+the+adult+zebrafish+brain:+a+quantitative+analysis.">Generation and long-term persistence of new neurons in the adult zebrafish brain: a quantitative analysis.</a> Neuroscience. 146, 679-696 (2007).</li><li>Ristori, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dicer-miR-107+interaction+regulates+biogenesis+of+specific+miRNAs+crucial+for+neurogenesis.">A dicer-miR-107 interaction regulates biogenesis of specific miRNAs crucial for neurogenesis.</a> Dev Cell. 32, 546-560 (2015).</li><li>Louis, S. K., SIegel, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Viability+Analysis+Using+Trypan+Blue:+Manual+and+Automated+Methods.">Cell Viability Analysis Using Trypan Blue: Manual and Automated Methods.</a> Methods Mol Bio. 740, (2011).</li><li>Harrison, M. M., Jenkins, B. V., O'Connor-Giles, K. M., Wildonger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR+view+of+development.">A CRISPR view of development.</a> Genes dev. 28, 1859-1872 (2014).</li><li>Marz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+progenitor+cell+subtypes+in+the+ventricular+zone+of+the+zebrafish+adult+telencephalon.">Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon.</a> Glia. 58, 870-888 (2010).</li></ol>

Основной целью этого протокола является, чтобы изолировать и культуры взрослых данио мозга, полученных нейросферы для изучения клеточных и молекулярных особенностей нервных стволовых клеток / клеток-предшественников. Здесь мы сообщаем о том , как выбрать мультипотентных нервных клет...

Млекопитающие нервные стволовые клетки (NSC , ) были охарактеризованы в пробирке их способности расти в свободно плавающих культур как кластеры делящиеся клетки называются нейросферы 1. В присутствии эпидермального фактора роста (EGF) и фактор роста фибробластов (FGF), NSC , делят либо симметрично , чтобы генерировать самообновлению NSCs, или асимметрично , чтобы генерировать два разных дочерних клеток, то есть., Дифференцирующим клеток - предшественников и новый НСК. Поэтому нейросфера культуры представляют собой смесь нервных стволовых клеток / клеток- предшественников и более дифференцированных нервных клеток 2-4 NSC , может, тем не менее, следует отличать от других типов клеток нейросфера двумя специфическими свойствами:. Они показывают долгосрочное самообновление в FREE- плавающей культур , и они могут дифференцироваться во все нейронных клеточных клонов (то есть, нейроны, астроциты и олигодендроциты) после снятия факторов роста и адгезии к внеклеточного матрикса подложках. В MAMMALS, система нейросфера культура была первая система в пробирке используется для демонстрации присутствия NSCs во взрослом мозге и остается наиболее часто используемым инструментом для анализа пролиферации, способность самообновления и мультипотентность нервных стволовых клеток и клеток - предшественников. Поэтому, несмотря на то, сфера формирования анализы страдают от некоторых недостатков и ограничений 4, эта система культуры является ценным для оценки потенциала клетки , чтобы вести себя как стволовые клетки при извлечении его из своей ниши в естественных условиях 4 и играет важную роль в определении ключевых регуляторов НСК самообновлению и клеточной судьбы определения 5-7. В отличие от млекопитающих, которые имеют ограниченный нейрогенез, данио конститутивно производят новые нейроны вдоль всей оси мозга на протяжении всей их жизни. Данио мозг взрослого человека показывает множественные нейрогенные нишах укрывательство нервных стволовых / клеток-предшественников делает Zebrafish мощную модель организма для понимания тон стволовых активность клеток в головном мозге, а также молекулярные программы, необходимые для регенерации центральной нервной системы. За последние 17 лет, несколько исследовательских групп разработаны методики выделения и культивирования данио нервных клеток 8,9. Эти исследования были направлены на получение эмбриональных нейронов и глиальных клеток в пробирке, но не при поддержании NSCs и исследовать их свойства. Хотя нейросферы были сформированы во взрослом Apteronotus leptorhynchus (Brown Дух Knifefish) 10, A нейросфера формирования анализа в данио осталось установить. Здесь мы опишем нейросфера формирования анализа , чтобы продемонстрировать роль микроРНК-107 во время данио нейрогенез 11. Протокол позволяет: 1) совокупность взрослых нервных стволовых клеток / клеток-предшественников либо из данио всего мозга или из нескольких вскрытых областей мозга, таких как телэнцефалона, тектуме и мозжечка; 2) генерация фли с плавающей самообновляющихся нейросферы из взрослых клеток нервных стволовых / прогениторных; 3) понижающего и повышающей регуляции экспрессии генов , кодирующих или малых некодирующих РНК 11 в нейросферах, для того , чтобы исследовать их роль в пролиферации и дифференцировки нервных стволовых клеток / клеток - предшественников.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DPBS 1X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 1X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine hydrochloride monohydrate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6852-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>N-2 supplement (100x) liquid&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630</td>
			<td>1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose 45%&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-basic&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>&#160;100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5500-50 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA&#160;</td>
			<td>TCI</td>
			<td>P0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB11072-04000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine MS-222</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5040</td>
			<td>stock solution of 4 mg/ml.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trycold gel&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TGP8</td>
			<td>gel pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa Basic Nucleofector Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPI-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.

Генеральная схема взрослых данио нейросфера культуры Здесь мы опишем все этапы протокола в нейросфера формирования анализа выполненных из взрослых данио мозга. Во- первых, взрослые нервные клетки стволовые / предшественники, были со?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres at JoVE.com

Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

Здесь мы предлагаем воспроизводимый метод для изучения нейрогенез с использованием анализа нейросфера, полученную из целого мозга или от или конечного мозга, tectal или мозжечка областей взрослых данио мозга. Кроме того, мы опишем процедуру манипулировать экспрессии генов в данио нейросферах.

Выделение и культура взрослых данио мозга, полученных из нейросферах

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Почки Регенерация у взрослых данио рерио по гентамицина поражении

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Выделение и характеристика отдельных клеток из эмбрионов данио рерио

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation and Expansion of Adult Canine Hippocampal Neural Precursors

Выделение и расширение для взрослых собачьего гиппокампа Neural прекурсорах

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Подготовка и культура Миогенный прогениторных клеток / Первичные миобластов из скелетной мышце взрослых и выдержана Людей

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

Культура взрослых Трансгенные данио Ретинального эксплантов для живых клеток изображений многофотонной микроскопии

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Изоляция, культура и дифференцировки клеток стромы костного мозга и остеокластов прародителей от мышей

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

Изоляции и культуры клеток первичного эпикардиальной, производный от сердца человека взрослых и плода образцов

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Культура и Transfection клетки первичной данио рерио

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Наночастицы опосредованной siRNA сайленсинга генов в сердце взрослого человека данио рерио

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Взрослый данио рерио травмы модели для изучения последствий преднизолона в регенерации костной ткани

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...