Name: ratiometric imaging of extracellular ph in dental biofilms
Uploaded: 2016-03-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Javier E. Garcia og Lene Grønkjær til teknisk bistand og Merete K. Raarup for frugtbare diskussioner. Dette arbejde blev finansieret af Aarhus Universitets Forskningsfond og Simon Spies Fonden.

Den eksperimentelle protokol blev gennemgået og godkendt af den etiske komité i Århus Amt (M-20.100.032). 1. Konfokal Mikroskopisk Kalibrering af Ratiometrisk Dye <ol><li> For erhvervelse billede, bruge en omvendt konfokal mikroskop udstyret med en inkubator, en 63X / 1.2-numerisk blænde vand nedsænkning mål, en 543 nm laser linje og en META detektor. </li><li> Forbered HEPES buffer stamopløsninger (50 mM, justeret til pH 4,5 til 8,5 i trin af 0,1 pH-enheder). Tilsæt 100 pi af hver opløsning i brønde...

<ol>
	<li>Hunter, R. C., Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+pH-sensitive+fluoroprobe+(C-SNARF-4)+for+pH+microenvironment+analysis+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71 (5), 2501-2510 (2005).</li><li>Takahashi, N., Nyvad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caries+ecology+revisited:+microbial+dynamics+and+the+caries+process.">Caries ecology revisited: microbial dynamics and the caries process.</a> Caries Res. 42 (6), 409-418 (2008).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+landscapes+in+a+novel+five-species+model+of+early+dental+biofilm.">pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm.</a> PLoS. One. 6 (9), e25299 (2011).</li><li>von Ohle, O. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+microsensor+measurement+of+local+metabolic+activities+in+ex+vivo+dental+biofilms+exposed+to+sucrose+and+treated+with+chlorhexidine.">Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (7), 2326-2334 (2010).</li><li>Revsbech, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+microbial+communities+with+electrochemical+microsensors+and+microscale+biosensors.">Analysis of microbial communities with electrochemical microsensors and microscale biosensors.</a> Methods Enzymol. 397, 147-166 (2005).</li><li>Vanhoudt, P., Lewandowski, Z., Little, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iridium+oxide+pH+microelectrode.">Iridium oxide pH microelectrode.</a> Biotechnol. Bioeng. 40 (5), 601-608 (1992).</li><li>Franks, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategy+for+three-dimensional+real-time+imaging+of+microbial+fuel+cell+communities:+monitoring+the+inhibitory+effects+of+proton+accumulation+within+the+anode+biofilm.">Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm.</a> Energy &amp; Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).</li><li>Hidalgo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tomographic+fluorescence+imaging+of+pH+microenvironments+in+microbial+biofilms+by+use+of+silica+nanoparticle+sensors.">Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (23), 7426-7435 (2009).</li><li>Vroom, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depth+penetration+and+detection+of+pH+gradients+in+biofilms+by+two-photon+excitation+microscopy.">Depth penetration and detection of pH gradients in biofilms by two-photon excitation microscopy.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65 (8), 3502-3511 (1999).</li><li>Bender, G. R., Sutton, S. V., Marquis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid+tolerance,+proton+permeabilities,+and+membrane+ATPases+of+oral+streptococci.">Acid tolerance, proton permeabilities, and membrane ATPases of oral streptococci.</a> Infect. Immun. 53 (2), 331-338 (1986).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+imaging+of+extracellular+pH+in+bacterial+biofilms+using+C-SNARF-4.">Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms using C-SNARF-4.</a> Appl. Environ. Microbiol. 81 (4), 1267-1273 (2015).</li><li>Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+identification+of+streptococci+and+other+bacteria+in+initial+dental+biofilm+by+confocal+laser+scanning+microscopy+and+fluorescence+in+situ+hybridization.">In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization.</a> Eur. J Oral Sci. 115 (6), 459-467 (2007).</li><li>de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+oral+Streptococcus+species+and+Actinomyces+viscosus+in+human+saliva.">Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva.</a> Appl. Environ. Microbiol. 47 (5), 901-904 (1984).</li><li>Daims, H., Lucker, S., Wagner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=daime,+a+novel+image+analysis+program+for+microbial+ecology+and+biofilm+research.">daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research.</a> Environ. Microbiol. 8 (2), 200-213 (2006).</li><li>Liu, Y. L., Nascimento, M., Burne, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+toward+understanding+the+contribution+of+alkali+generation+in+dental+biofilms+to+inhibition+of+dental+caries.">Progress toward understanding the contribution of alkali generation in dental biofilms to inhibition of dental caries.</a> Int. J Oral Sci. 4 (3), 135-140 (2012).</li></ol>

Mikroskopiske overvågning af biofilm pH tilvejebringer adskillige fordele i sammenligning med elektrodematerialer eller mikroelektrode målinger 4-6. Mikroskopiske teknikker tillader at bestemme pH med en høj rumlig opløsning og tillade opfange både horisontale og vertikale pH-gradienter i biofilm uden at forstyrre biofilmen mekanisk. Tidligere forsøg på mikroskopisk pH overvågning, imidlertid ikke skelne mellem ekstracellulær og intracellulær pH i biofilm 1,7,9. På grund af bakteriel hom...

Den her beskrevne fremgangsmåde tillader overvågning ekstracellulære pH i dentale biofilm i intervallet mellem 4,5 og 7, ved hjælp af ratiometrisk farvestof seminaphthorhodafluor-4F 5- (and-6) carboxylsyre (C-snarf-4) i kombination med konfokal laser scanning mikroskopi og digital billedanalyse. Den anvendte fluorescerende farvestof er pH-følsom og viser et skift i sin fluorescerende emission afhængigt af tilstanden af ​​protonering. Den fluorescerende emission af de protonerede molekyle topper ved 580 nm og emission af deprotoneret molekyle ved 640 nm 1. Forholdet mellem de fluorescerende emissionsintensiteter i to detektionsvinduer omfattende de to emissionstoppe (576 - 608 nm og 629-661 nm) afspejler således pH i den flydende fase, uanset koncentrationen farvestof. Med en pKa på ~ 6.4 farvestoffet er egnet til at visualisere pH i moderat sure miljøer. PH i bakterielle biofilm, er af central betydning for alle metaboliske processer.I tilfælde af dental biofilm, pH i den ekstracellulære matrix er nøglen virulensfaktor for udvikling af karies. Udvidede perioder med lav pH-værdi på biofilmen-tand interfaceledning at bremse demineralisering af den underliggende emalje 2. På grund af den komplekse tredimensionale arkitektur af biofilm, metabolitter, herunder organiske syrer, er ikke ensartet fordelt hen over biofilmen. Meget og mindre syrefase mikromiljøer kan findes i tæt rumlig nærhed 3. I årtier blev lodrette pH-gradienter i biofilm indspillet med hjælp fra mikroelektroder 4-6. Mens de tilbyder en god rumlig opløsning på grund af deres lille spids størrelse, er de ikke velegnede til at overvåge horisontale gradienter. Endvidere indsættelse af elektroden forstyrrer biofilmen mekanisk. Kvantitative fluorescerende mikroskopiske teknikker har den fordel at visualisere pH-ændringer i forskellige områder af en biofilm uden mekanisk blandence. Forskellige mikroskopiske synsfelter kan vælges frit og filmede gentagne gange over længere perioder 1,7-9. Men når fortolkningen mikroskopiske biofilm billeder, er det vigtigt at skelne mellem fluorescens hidrørende fra den mikrobielle biomasse og fluorescens stammer fra det ekstracellulære rum. Under sure betingelser, pH inde bakterieceller er forskellig fra pH i den ekstracellulære matrix, som bakterierne aktivt transportere protoner tværs deres cellemembran på bekostning af adenosintriphosphat 10. I forbindelse med caries, er intracellulær bakterie pH ikke har en direkte indvirkning på de underliggende emalje mens lav ekstracellulære pH fører til demineralisering. Gennemsnit pH i mikroskopiske billeder, der indeholder både bakterier-frie områder og bakterier fører til fejlagtige resultater. Anvendelse af andre pletter sammen med det pH-følsomme farvestof for at visualisere den bakterielle biomasse og skelne mellem ekstra- og intracellulære områder bringer abud risikoen for fluorescerende forurening af det ekstracellulære rum og falske målinger 11. Den foreliggende manuskript beskriver derfor anvendelsen af ​​den ratiometriske farvestof i en dobbelt funktion; både som pH markør og som en universel bakteriel plet. Som farvestoffet er op-koncentreret i bakterieceller er kombinationen af ​​konfokal mikroskopiske billeddannelse og en præcis billedanalyse procedure digital tillader bestemmelse af ekstracellulær pH ​​i området mellem 4,5 og 7,0 i tynde dental biofilm.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1258">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Zeiss LSM 510 META</td>
			<td style="width:305px;">Zeiss</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">C-Apochromat 63X water immersion objective</td>
			<td style="width:305px;">Zeiss</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">XL Incubator</td>
			<td style="width:305px;">PeCON</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid</td>
			<td style="width:305px;">Life Technologies</td>
			<td>S23920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:305px;">Life Technologies</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">HEPES</td>
			<td style="width:305px;">Life Technologies</td>
			<td>11344-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Costar 96-well black clear-bottom plate</td>
			<td style="width:305px;">Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:409px;">Custom-made glass slabs (4x4x1 mm; 1,200 grit)</td>
			<td style="width:305px;">Menzel</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Alginate impression material</td>
			<td style="width:305px;">GC Corporation</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs</td>
			<td style="width:305px;">Axis Dental</td>
			<td style="width:243px;">LS-906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Orthodontic retainer containers</td>
			<td style="width:305px;">Spark Medical Equipment Co., Ltd</td>
			<td style="width:243px;">SK-WDTC01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Sticky wax</td>
			<td style="width:305px;">Dentsply</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chewing paraffin wax&#160;</td>
			<td>Ivoclar Vivadent AG</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Dithiothreitol</td>
			<td style="width:305px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td>Used during preparation of salivary solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">0.45 &#181;m and 0.2 &#181;m syringe filters</td>
			<td style="width:305px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS431220; CLS431219&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:409px;">daime</td>
			<td style="width:305px;">University of Vienna, Austria</td>
			<td style="width:243px;">http://dome.csb.univie.ac.at/daime</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">ImageJ</td>
			<td>NIH, Bethesda, Maryland, USA</td>
			<td style="width:243px;">http://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ratiometric imaging of extracellular ph in dental biofilms

PH i bakterielle biofilm på tænderne er af central betydning for caries, en sygdom med en høj forekomst på verdensplan. Næringsstoffer og metabolitter ikke jævnt fordelt i dental biofilm. Et komplekst samspil af sorption til og reaktion med organisk stof i biofilmen reducerer diffusion stier opløste stoffer og skaber stejle stigninger af reaktive molekyler, herunder organiske syrer, på tværs af biofilmen. Kvantitative fluorescerende mikroskopiske metoder, såsom fluorescens levetid billeddannelse eller pH ratiometry, kan anvendes til at visualisere pH i forskellige mikromiljøer af tand biofilm. pH ratiometry udnytter en pH-afhængig forskydning i fluorescerende emission af pH-følsomme farvestoffer. Beregning af forholdet emission ved to forskellige bølgelængder tillader bestemmelse af lokale pH i mikroskopiske billeder, uanset koncentrationen af ​​farvestoffet. I modsætning til mikroelektroder teknikken tillader overvågning både lodrette og vandrette pH-gradienter i realtid medmekanisk forstyrre biofilmen. Imidlertid skal der drages omsorg for at skelne klart mellem ekstra- og intracellulære rum i biofilmen. Her ratiometrisk farvestof, seminaphthorhodafluor-4F 5- (and-6) carboxylsyre (C-snarf-4) anvendes til at overvåge ekstracellulær pH i in vivo dyrket dental biofilm i sammensætningen ukendt art. Ved udsættelse for glucose farvestoffet er op-koncentreret inde alle bakterieceller i biofilm; det anvendes således både som en universel bakteriel plet og som en markør af ekstracellulært pH. Efter konfokal mikroskopisk billede erhvervelse, er den bakterielle biomasse fjernes fra alle billeder ved hjælp af digital billedanalyse software, som tillader udelukkende beregne ekstracellulær pH. pH ratiometry med ratiometrisk farvestof er velegnet til at studere ekstracellulær pH ​​i tynde biofilm på op til 75 um tykkelse, men er begrænset til pH-intervallet mellem 4,5 og 7,0.

I denne procedure tillader overvågning ekstracellulære pH falder i forskellige mikromiljøer af tand biofilm i pH-området fra 4,5 til 7 i realtid. Hvis der vælges de eksperimentelle betingelser som beskrevet ovenfor, pH begynder at falde inden for alle områder af biofilm kort efter udsættelse for glucose. Når pH i en biofilm dråber, bakterieceller bliver synlige inden for kort tid (&lt;1 min), som den ratiometrisk farv...

Watch this Scientific Journal Video about Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms at JoVE.com

Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

Ratiometrisk Imaging af ekstracellulære pH i Dental biofilm

En pH-følsom ratiometrisk farvestof anvendes i kombination med konfokal laser scanning mikroskopi og digital billedanalyse til at overvåge ekstracellulær pH ​​i dental biofilm i realtid.

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Vækst af Mycobacterium tuberculosis Biofilm

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Måling fagosom pH ved Ratiometrisk fluorescensmikroskopi

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

Imaging den Neutrofil fagosomet og Cytoplasma Ved hjælp af en Ratiometrisk pH-indikator

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular ...

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Oprensning af et Højmolekylært masse protein i Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy

Overvågning af ekstracellulære pH-pc'er i Biofilm på tværs af kongeriget ved hjælp af konfokalmikroskopi

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Afklaring og Imaging Candida albicans Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis

Overvåget maskinlæring til semi-kvantificering af ekstracellulær DNA i glomerulonefritis

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular ...

Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy

Måling af makroinoomers pH-, redoxkemikalier og nedbrydende kapacitet ved hjælp af dual-fluorophore ratiometrisk mikroskopi

In recent years, the field of macropinocytosis has grown rapidly. Macropinocytosis has emerged as a central mechanism by which innate immune cells ...

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

En ny ex vivo ovine hudsårsmodel med høj kapacitet til test af nye antibiotika

The development of antimicrobials is an expensive process with increasingly low success rates, which makes further investment in antimicrobial discovery ...