Name: ratiometric imaging of extracellular ph in dental biofilms
Uploaded: 2016-03-09T14:00:00
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Les auteurs tiennent à remercier Javier E. Garcia et Lene Grønkjær d&#39;assistance technique et Merete K. Raarup pour des discussions fructueuses. Ce travail a été financé par la Fondation de recherche de l&#39;Université d&#39;Aarhus et de la Simon Spies Foundation.

Le protocole expérimental a été examiné et approuvé par le Comité d&#39;éthique du comté d&#39;Aarhus (M-20100032). 1. confocale Microscopique Calibration du Ratiométrique Dye <ol><li> Pour l&#39;acquisition d&#39;image, utiliser un microscope inversé confocal équipé d&#39;un incubateur, un objectif d&#39;immersion dans l&#39;eau d&#39;ouverture 63X / 1.2-numérique, une ligne de laser 543 nm et un détecteur META. </li><li> Préparer tampon HEPES solutions mères (50 mM, ajusté à un pH de 4,5 à...

<ol>
	<li>Hunter, R. C., Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+pH-sensitive+fluoroprobe+(C-SNARF-4)+for+pH+microenvironment+analysis+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71 (5), 2501-2510 (2005).</li><li>Takahashi, N., Nyvad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caries+ecology+revisited:+microbial+dynamics+and+the+caries+process.">Caries ecology revisited: microbial dynamics and the caries process.</a> Caries Res. 42 (6), 409-418 (2008).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+landscapes+in+a+novel+five-species+model+of+early+dental+biofilm.">pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm.</a> PLoS. One. 6 (9), e25299 (2011).</li><li>von Ohle, O. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+microsensor+measurement+of+local+metabolic+activities+in+ex+vivo+dental+biofilms+exposed+to+sucrose+and+treated+with+chlorhexidine.">Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (7), 2326-2334 (2010).</li><li>Revsbech, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+microbial+communities+with+electrochemical+microsensors+and+microscale+biosensors.">Analysis of microbial communities with electrochemical microsensors and microscale biosensors.</a> Methods Enzymol. 397, 147-166 (2005).</li><li>Vanhoudt, P., Lewandowski, Z., Little, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iridium+oxide+pH+microelectrode.">Iridium oxide pH microelectrode.</a> Biotechnol. Bioeng. 40 (5), 601-608 (1992).</li><li>Franks, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategy+for+three-dimensional+real-time+imaging+of+microbial+fuel+cell+communities:+monitoring+the+inhibitory+effects+of+proton+accumulation+within+the+anode+biofilm.">Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm.</a> Energy &amp; Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).</li><li>Hidalgo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tomographic+fluorescence+imaging+of+pH+microenvironments+in+microbial+biofilms+by+use+of+silica+nanoparticle+sensors.">Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (23), 7426-7435 (2009).</li><li>Vroom, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depth+penetration+and+detection+of+pH+gradients+in+biofilms+by+two-photon+excitation+microscopy.">Depth penetration and detection of pH gradients in biofilms by two-photon excitation microscopy.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65 (8), 3502-3511 (1999).</li><li>Bender, G. R., Sutton, S. V., Marquis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid+tolerance,+proton+permeabilities,+and+membrane+ATPases+of+oral+streptococci.">Acid tolerance, proton permeabilities, and membrane ATPases of oral streptococci.</a> Infect. Immun. 53 (2), 331-338 (1986).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+imaging+of+extracellular+pH+in+bacterial+biofilms+using+C-SNARF-4.">Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms using C-SNARF-4.</a> Appl. Environ. Microbiol. 81 (4), 1267-1273 (2015).</li><li>Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+identification+of+streptococci+and+other+bacteria+in+initial+dental+biofilm+by+confocal+laser+scanning+microscopy+and+fluorescence+in+situ+hybridization.">In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization.</a> Eur. J Oral Sci. 115 (6), 459-467 (2007).</li><li>de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+oral+Streptococcus+species+and+Actinomyces+viscosus+in+human+saliva.">Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva.</a> Appl. Environ. Microbiol. 47 (5), 901-904 (1984).</li><li>Daims, H., Lucker, S., Wagner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=daime,+a+novel+image+analysis+program+for+microbial+ecology+and+biofilm+research.">daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research.</a> Environ. Microbiol. 8 (2), 200-213 (2006).</li><li>Liu, Y. L., Nascimento, M., Burne, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+toward+understanding+the+contribution+of+alkali+generation+in+dental+biofilms+to+inhibition+of+dental+caries.">Progress toward understanding the contribution of alkali generation in dental biofilms to inhibition of dental caries.</a> Int. J Oral Sci. 4 (3), 135-140 (2012).</li></ol>

La surveillance microscopique du biofilm pH offre plusieurs avantages par rapport à l&#39; électrode ou microélectrode mesures 4-6. techniques microscopiques permettent de déterminer le pH avec une haute résolution spatiale et permettre la capture des gradients de pH à la fois horizontale et verticale dans les biofilms sans perturber le biofilm mécaniquement. Les tentatives précédentes de surveillance du pH microscopique, cependant, omis de faire la différence entre le pH extracellulaire et intracel...

Le procédé décrit ici permet de surveiller le pH extracellulaire dans les biofilms dentaires dans la plage comprise entre 4,5 et 7, en utilisant le colorant ratiométrique seminaphthorhodafluor-4F 5- (et-6), acide carboxylique (C-SNARF-4) en combinaison avec la microscopie confocale à balayage laser et l&#39;analyse d&#39;image numérique. Le colorant fluorescent utilisé est sensible au pH et affiche un changement dans son émission de fluorescence en fonction de l&#39;état de protonation. L&#39;émission de fluorescence des pics moléculaires protonés à 580 nm et l&#39;émission de la molécule déprotonée 1 à 640 nm. Le rapport des intensités d&#39;émission de fluorescence dans deux fenêtres de détection comprenant deux pics d&#39;émission (576-608 nm et 629-661 nm) reflète ainsi le pH dans la phase liquide, quelle que soit la concentration de colorant. Avec un pKa de 6,4 ~ le colorant est adapté pour visualiser le pH dans un environnement modérément acides. PH dans les biofilms bactériens est d&#39;une importance capitale pour tous les processus métaboliques.Dans le cas des biofilms dentaires, le pH dans la matrice extracellulaire est le facteur de virulence essentiel pour le développement des caries dentaires. Des périodes prolongées de faible pH à l&#39;interface biofilm-dent conduit à ralentir la déminéralisation de l&#39;émail sous - jacent 2. Grâce à l&#39;architecture tridimensionnelle complexe de biofilms, des métabolites, y compris les acides organiques, ne sont pas répartis uniformément à travers le biofilm. Hautement et moins microenvironnements acidogènes se trouvent dans la proximité spatiale étroite 3. Depuis des décennies, des gradients de pH verticaux dans les biofilms ont été enregistrées à l&#39;aide de micro - électrodes 4-6. Bien qu&#39;ils offrent une bonne résolution spatiale en raison de leur petite taille de la pointe, ils ne sont pas bien adaptés pour surveiller les gradients horizontaux. En outre, l&#39;insertion de l&#39;électrode perturbe le biofilm mécaniquement. techniques microscopiques fluorescentes quantitatives offrent l&#39;avantage de visualiser les changements de pH dans différentes zones d&#39;un biofilm sans interférer mécaniquence. Champs microscopiques de vue différents peuvent être choisis librement et imagées de manière répétée sur des périodes prolongées 1,7-9. Cependant, lors de l&#39;interprétation des images microscopiques biofilm, il est important de faire la distinction entre la fluorescence provenant de la biomasse microbienne et de la fluorescence provenant de l&#39;espace extracellulaire. Dans des conditions acides, le pH à l&#39; intérieur des cellules bactériennes est différent du pH dans la matrice extracellulaire, comme les bactéries transportent activement des protons à travers la membrane cellulaire , au détriment de l&#39; adénosine triphosphate 10. Dans le contexte de la carie dentaire, le pH intracellulaire des bactéries n&#39;a pas un impact direct sur l&#39;émail sous-jacent alors qu&#39;une faible pH extracellulaire conduit à la déminéralisation. Étalement pH dans des images microscopiques qui contiennent à la fois des zones exemptes de bactéries et les bactéries conduit à des résultats erronés. L&#39;utilisation d&#39;autres tâches ainsi que le colorant sensible au pH pour visualiser la biomasse bactérienne et de différencier entre les régions extra- et intracellulaires apporte able risque de contamination fluorescente de l&#39;espace extracellulaire et des erreurs de mesure 11. Le présent manuscrit décrit donc l&#39;utilisation du colorant ratiométrique dans une double fonction; à la fois en tant que marqueur de pH et comme une tache bactérienne universelle. Comme le colorant est mis concentré dans des cellules bactériennes, la combinaison d&#39;imagerie microscopique confocale et une procédure d&#39;analyse d&#39;image numérique précis permet la détermination du pH extracellulaire dans la plage comprise entre 4,5 et 7,0 dans les biofilms minces dentaires.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1258">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Zeiss LSM 510 META</td>
			<td style="width:305px;">Zeiss</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">C-Apochromat 63X water immersion objective</td>
			<td style="width:305px;">Zeiss</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">XL Incubator</td>
			<td style="width:305px;">PeCON</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid</td>
			<td style="width:305px;">Life Technologies</td>
			<td>S23920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:305px;">Life Technologies</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">HEPES</td>
			<td style="width:305px;">Life Technologies</td>
			<td>11344-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Costar 96-well black clear-bottom plate</td>
			<td style="width:305px;">Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:409px;">Custom-made glass slabs (4x4x1 mm; 1,200 grit)</td>
			<td style="width:305px;">Menzel</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Alginate impression material</td>
			<td style="width:305px;">GC Corporation</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs</td>
			<td style="width:305px;">Axis Dental</td>
			<td style="width:243px;">LS-906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Orthodontic retainer containers</td>
			<td style="width:305px;">Spark Medical Equipment Co., Ltd</td>
			<td style="width:243px;">SK-WDTC01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Sticky wax</td>
			<td style="width:305px;">Dentsply</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chewing paraffin wax&#160;</td>
			<td>Ivoclar Vivadent AG</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Dithiothreitol</td>
			<td style="width:305px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td>Used during preparation of salivary solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">0.45 &#181;m and 0.2 &#181;m syringe filters</td>
			<td style="width:305px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS431220; CLS431219&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:409px;">daime</td>
			<td style="width:305px;">University of Vienna, Austria</td>
			<td style="width:243px;">http://dome.csb.univie.ac.at/daime</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">ImageJ</td>
			<td>NIH, Bethesda, Maryland, USA</td>
			<td style="width:243px;">http://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ratiometric imaging of extracellular ph in dental biofilms

Le pH dans les biofilms bactériens sur les dents est d&#39;une importance centrale pour la carie dentaire, une maladie avec une prévalence mondiale élevée. Les nutriments et métabolites ne sont pas répartis uniformément dans les biofilms dentaires. Une interaction complexe de sorption à et de la réaction avec la matière organique dans le biofilm réduit les chemins de diffusion de solutés et crée des pentes raides de molécules réactives, y compris les acides organiques, à travers le biofilm. méthodes microscopiques fluorescentes quantitatives, comme la vie de l&#39;imagerie de fluorescence de temps ou pH ratiometry, peuvent être utilisés pour visualiser le pH dans différents microenvironnements de biofilms dentaires. pH ratiometry exploite un décalage dépendant du pH dans l&#39;émission de fluorescence des colorants sensibles au pH. Calcul du rapport d&#39;émission à deux longueurs d&#39;onde différentes permet de déterminer le pH local dans les images microscopiques, quelle que soit la concentration du colorant. Contrairement à microélectrodes la technique permet de surveiller les deux gradients verticaux et horizontaux pH en temps réel avecperturber mécaniquement le biofilm. Cependant, il faut prendre soin de différencier précisément entre les compartiments extra- et intracellulaires du biofilm. Ici, le colorant ratiométrique, seminaphthorhodafluor-4F 5- (et-6) acide carboxylique (C-SNARF-4) est utilisé pour contrôler le pH extracellulaire in vivo biofilms dentaires cultivés de la composition des espèces inconnues. Lors de l&#39;exposition au glucose est le colorant jusqu&#39;à concentré à l&#39;intérieur de toutes les cellules bactériennes dans les biofilms; elle est donc utilisée à la fois comme une tache bactérienne universelle et comme marqueur du pH extracellulaire. Après l&#39;acquisition de l&#39;image microscopique confocale, la biomasse bactérienne est retiré de toutes les images en utilisant le logiciel d&#39;analyse d&#39;image numérique, qui permet de calculer exclusivement pH extracellulaire. pH ratiometry avec le colorant ratiométrique est bien adapté pour étudier le pH extracellulaire dans minces biofilms allant jusqu&#39;à 75 um d&#39;épaisseur, mais est limitée à la plage de pH entre 4,5 et 7,0.

La méthode présentée permet extracellulaire de surveillance pH chute dans différents microenvironnements de biofilms dentaires dans la gamme de pH de 4,5 à 7 en temps réel. Si les conditions expérimentales sont choisies comme décrit ci-dessus, le pH commence à chuter dans tous les domaines des biofilms peu après l&#39;exposition au glucose. Lorsque le pH diminue dans un biofilm, les cellules bactériennes deviennent ...

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Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

Imagerie Ratiométrique du pH extracellulaire dans biofilms dentaires

Un colorant ratiométrique sensible au pH est utilisé en combinaison avec la microscopie confocale à balayage laser et l&#39;analyse d&#39;image numérique pour contrôler le pH extracellulaire dans les biofilms dentaires en temps réel.

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...

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