Name: ratiometric imaging of extracellular ph in dental biofilms
Uploaded: 2016-03-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות חבייר א גרסיה Lene גרונקיאר לקבלת סיוע טכני Merete ק Raarup לדיונים פוריים. עבודה זו מומנה על ידי ארהוס אוניברסיטת Research Foundation ואת סיימון ספייס קרן.

פרוטוקול הניסוי נבדק ואושר על ידי ועדת האתיקה של מחוז ארהוס (M-20,100,032). 1. הכיול מיקרוסקופי Confocal של דיי ratiometric <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור רכישת תמונה, משתמש במיקרוסקופ confocal הפוך המצויד באינקובטור, טבילה אובייקטיבית מ...

<ol>
	<li>Hunter, R. C., Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+pH-sensitive+fluoroprobe+(C-SNARF-4)+for+pH+microenvironment+analysis+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71 (5), 2501-2510 (2005).</li><li>Takahashi, N., Nyvad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caries+ecology+revisited:+microbial+dynamics+and+the+caries+process.">Caries ecology revisited: microbial dynamics and the caries process.</a> Caries Res. 42 (6), 409-418 (2008).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+landscapes+in+a+novel+five-species+model+of+early+dental+biofilm.">pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm.</a> PLoS. One. 6 (9), e25299 (2011).</li><li>von Ohle, O. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+microsensor+measurement+of+local+metabolic+activities+in+ex+vivo+dental+biofilms+exposed+to+sucrose+and+treated+with+chlorhexidine.">Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (7), 2326-2334 (2010).</li><li>Revsbech, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+microbial+communities+with+electrochemical+microsensors+and+microscale+biosensors.">Analysis of microbial communities with electrochemical microsensors and microscale biosensors.</a> Methods Enzymol. 397, 147-166 (2005).</li><li>Vanhoudt, P., Lewandowski, Z., Little, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iridium+oxide+pH+microelectrode.">Iridium oxide pH microelectrode.</a> Biotechnol. Bioeng. 40 (5), 601-608 (1992).</li><li>Franks, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategy+for+three-dimensional+real-time+imaging+of+microbial+fuel+cell+communities:+monitoring+the+inhibitory+effects+of+proton+accumulation+within+the+anode+biofilm.">Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm.</a> Energy &amp; Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).</li><li>Hidalgo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tomographic+fluorescence+imaging+of+pH+microenvironments+in+microbial+biofilms+by+use+of+silica+nanoparticle+sensors.">Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (23), 7426-7435 (2009).</li><li>Vroom, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depth+penetration+and+detection+of+pH+gradients+in+biofilms+by+two-photon+excitation+microscopy.">Depth penetration and detection of pH gradients in biofilms by two-photon excitation microscopy.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65 (8), 3502-3511 (1999).</li><li>Bender, G. R., Sutton, S. V., Marquis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid+tolerance,+proton+permeabilities,+and+membrane+ATPases+of+oral+streptococci.">Acid tolerance, proton permeabilities, and membrane ATPases of oral streptococci.</a> Infect. Immun. 53 (2), 331-338 (1986).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+imaging+of+extracellular+pH+in+bacterial+biofilms+using+C-SNARF-4.">Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms using C-SNARF-4.</a> Appl. Environ. Microbiol. 81 (4), 1267-1273 (2015).</li><li>Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+identification+of+streptococci+and+other+bacteria+in+initial+dental+biofilm+by+confocal+laser+scanning+microscopy+and+fluorescence+in+situ+hybridization.">In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization.</a> Eur. J Oral Sci. 115 (6), 459-467 (2007).</li><li>de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+oral+Streptococcus+species+and+Actinomyces+viscosus+in+human+saliva.">Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva.</a> Appl. Environ. Microbiol. 47 (5), 901-904 (1984).</li><li>Daims, H., Lucker, S., Wagner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=daime,+a+novel+image+analysis+program+for+microbial+ecology+and+biofilm+research.">daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research.</a> Environ. Microbiol. 8 (2), 200-213 (2006).</li><li>Liu, Y. L., Nascimento, M., Burne, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+toward+understanding+the+contribution+of+alkali+generation+in+dental+biofilms+to+inhibition+of+dental+caries.">Progress toward understanding the contribution of alkali generation in dental biofilms to inhibition of dental caries.</a> Int. J Oral Sci. 4 (3), 135-140 (2012).</li></ol>

ניטור מיקרוסקופי של pH ביופילם מספק מספר יתרונות, לעומת מדידות אלקטרודה או microelectrode 4-6. טכניקות מיקרוסקופיות להתיר לקבוע pH עם רזולוציה מרחבית גבוהה ולאפשר לכידה הן הדרגתיים pH אופקי ואנכי ב biofilms מבלי להפריע ביופילם מכאנית. ניסיונות קודמים של ניטור pH המיקרוסקופי, ?...

השיטה המתוארת כאן מאפשר ניטור pH תאיים biofilms שיניים בטווח שבין 4.5 ו -7, באמצעות צבע ratiometric seminaphthorhodafluor-4F 5 (ו -6) חומצה קרבוקסילית (C-SNARF-4) בשילוב עם מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal ו ניתוח תמונה דיגיטלי. צבע פלואורסצנטי המועסק הוא pH רגיש ומציג שינוי פליטתו פלורסנט בהתאם למצב של protonation. פליטת הניאון של פסגות מולקולת protonated ב 580 ננומטר, ואת פליטת מולקולת deprotonated ב 640 1 ננומטר. היחס בין עוצמות פליטת הניאון בשני חלונות זיהוי הכולל שתי פסגות הפליטה (576 - 608 ננומטר 629 - 661 ננומטר) ובכך משקפים pH בשלב הנוזלי, ללא קשר ריכוז לצבוע. עם א א PK של ~ 6.4 לצבוע מתאים לדמיין pH בסביבות חומציות מתונה. PH ב biofilms חיידקי היא בעלת חשיבות מרכזית לכל התהליכים המטבוליים.במקרה של biofilms שיניים, pH במטריצה ​​התאית הוא הגורם ארסי מפתח לפיתוח עששת. תקופות ממושכות עם pH הנמוך ביתרון ממשק ביופילם-שן להאט איבוד מינרלי האמייל הבסיסי 2. בשל הארכיטקטורה תלת-ממדי המורכבת של biofilms, מטבוליטים, כוללים חומצות אורגניות, אינם מפוזרים באופן אחיד על פני ביופילם. מאוד ופחות microenvironments acidogenic ניתן למצוא בסמיכות מרחבית קרובות 3. במשך עשרות שנים, הדרגתיים pH אנכי biofilms נרשמו בעזרת microelectrodes 4-6. בעוד שהם מציעים רזולוצית מרחבית טובה בשל גודל טיפ הקטן שלהם, הם לא מתאימים היטב כדי לפקח הדרגתיים אופקיים. יתר על כן, החדרת אלקטרודה מפריעה ביופילם מכנית. טכניקות מיקרוסקופיות פלורסנט כמוני מציעות את היתרון של ביטוי חזותי שינויי pH באזורים שונים של ביופילם ללא מכנים להפריעNCE. שדות מיקרוסקופים מבט שונים ניתן לבחור באופן חופשי צלמו שוב ושוב לאורך תקופות ממושכות 1,7-9. עם זאת, כאשר מפרשים תמונות ביופילם מיקרוסקופיות, חשוב להבחין בין הקרינה הנובעת ביומסה מיקרוביאליים הקרינה הנובעת מן המרחב התאי. בתנאים חומציים, pH בתוך תאי חיידקיים שונה pH בתוך תאי מטריקס, כמו החיידקים פעילים להעביר פרוטונים על פני קרום התא שלהם על חשבון אדנוזין אדנוזין 10. בהקשר של עששת, pH חיידקי תאיים אין השפעה ישירה על האמייל הבסיסי ואילו pH תאיים הנמוך מוביל איבוד מינרלים. מיצוע pH ב תמונות מיקרוסקופיות שמכילות הוא חיידקים ללא באזורים וחיידקים מוביל לתוצאות שגויות. השימוש כתם אחרים יחד עם צבע pH הרגיש על מנת להמחיש את ביומסה החיידקים ולבדל בין אזורי חוּץ ו תאיים מביא abאת הסיכון לזיהום הניאון של מרחב התאים ומדידות שווא 11. כתב היד הנוכחי ולכן מתאר את השימוש של צבע ratiometric ב תפקיד כפול; הן כסמן pH ו ככתם חיידקים אוניוורסלי. כמו לצבוע תלוי-מרוכזים תאים חיידקיים, השילוב של הדמיה מיקרוסקופית confocal ונוהל ניתוח תמונה דיגיטלית מדויקת מאפשר קביעת pH תאיים בטווח שבין 4.5 ו -7.0 ב biofilms שיניים דק.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1258">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Zeiss LSM 510 META</td>
			<td style="width:305px;">Zeiss</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">C-Apochromat 63X water immersion objective</td>
			<td style="width:305px;">Zeiss</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">XL Incubator</td>
			<td style="width:305px;">PeCON</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid</td>
			<td style="width:305px;">Life Technologies</td>
			<td>S23920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:305px;">Life Technologies</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">HEPES</td>
			<td style="width:305px;">Life Technologies</td>
			<td>11344-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Costar 96-well black clear-bottom plate</td>
			<td style="width:305px;">Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:409px;">Custom-made glass slabs (4x4x1 mm; 1,200 grit)</td>
			<td style="width:305px;">Menzel</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Alginate impression material</td>
			<td style="width:305px;">GC Corporation</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs</td>
			<td style="width:305px;">Axis Dental</td>
			<td style="width:243px;">LS-906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Orthodontic retainer containers</td>
			<td style="width:305px;">Spark Medical Equipment Co., Ltd</td>
			<td style="width:243px;">SK-WDTC01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Sticky wax</td>
			<td style="width:305px;">Dentsply</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chewing paraffin wax&#160;</td>
			<td>Ivoclar Vivadent AG</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Dithiothreitol</td>
			<td style="width:305px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td>Used during preparation of salivary solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">0.45 &#181;m and 0.2 &#181;m syringe filters</td>
			<td style="width:305px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS431220; CLS431219&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:409px;">daime</td>
			<td style="width:305px;">University of Vienna, Austria</td>
			<td style="width:243px;">http://dome.csb.univie.ac.at/daime</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">ImageJ</td>
			<td>NIH, Bethesda, Maryland, USA</td>
			<td style="width:243px;">http://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ratiometric imaging of extracellular ph in dental biofilms

ה- pH ב biofilms חיידקים על השיניים היא בעלת חשיבות מרכזית עבור עששת, מחלה עם שכיחות ברחבי העולם גבוהה. Nutrients מטבוליטים אינם מתחלקים באופן שווה ב biofilms שיניים. גומלין מורכב של וספיחה כדי ותגובה עם חומר אורגני ביופילם מפחית השבילים דיפוזיה של מומסים ויוצר הדרגתיים תלולה של מולקולות, כוללים חומצות אורגניות, מעבר ביופילם. שיטות מיקרוסקופיות פלורסנט כמותי, כגון הדמיה זמן החיים הקרינה או pH ratiometry, יכול להיות מועסק על מנת להמחיש pH במיקרו-סביבות שונות של biofilms שיניים. pH ratiometry מנצל משמרת תלויי pH של פליטת ניאון של צבעים pH רגיש. חישוב יחס הפליטה בשני אורכי גל שונים מאפשר קביעת pH מקומית תמונות מיקרוסקופיות, ללא קשר הריכוז של הצבע. בניגוד microelectrodes הטכניקה מאפשרת ניטור הוא הדרגתי pH אנכי ואופקית בזמן אמת עםמתוך מכאני להפריע ביופילם. עם זאת, יש להקפיד להבדיל במדויק בין תאי חוּץ ו התאיים של ביופילם. הנה, לצבוע ratiometric, seminaphthorhodafluor-4F 5 (ו -6) חומצה קרבוקסילית (C-SNARF-4) הוא מועסק כדי לפקח pH תאיים in vivo גדל biofilms שיניים של הרכב מינים שאינם מוכרים. בחשיפה לגלוקוז לצבוע תלוי-המרוכז בתוך כל תאי חיידקי biofilms; הוא ובכך לשמש הוא כתם אוניברסלית חיידקים כסמן של pH התאי. לאחר רכישת תמונה מיקרוסקופית confocal, ביומסה החיידקים תוסר כל התמונות באמצעות תוכנת ניתוח תמונה דיגיטלית, המאפשרת לחשב pH התאי באופן בלעדי. ratiometry pH עם צבע ratiometric הוא מותאם היטב כדי ללמוד pH התאי biofilms הדקה של עד 75 מיקרומטר עובי, אבל מוגבל בטווח pH בין 4.5 ו -7.0.

השיטה המוצגת מאפשרת pH תאיים ניטור טיפות במיקרו-סביבות שונות של biofilms שיניים בטווח מה PH 4.5 עד 7 בזמן אמת. אם תנאי הניסוי נבחרים כמתואר לעיל, pH מתחיל לרדת בכל התחומים של biofilms זמן קצר לאחר החשיפה לגלוקוז. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;directio...

Watch this Scientific Journal Video about Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms at JoVE.com

Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

הדמית ratiometric של pH התאי Biofilms השיניים

לצבוע ratiometric רגיש pH משמש בשילוב עם מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal וניתוח תמונה דיגיטלית לפקח pH תאיים biofilms שיניים בזמן אמת.

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

גידול של שחפת Mycobacterium Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

מדידת pH Phagosome ידי ratiometric מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

הדמיה נויטרופילים Phagosome ו הציטופלסמה באמצעות אינדיקטור pH ratiometric

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular ...

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

טיהור חלבון המסה המולקולרי הגבוה בסטרפטוקוקוס

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy

מעקב אחר תמציות ביומיסקופיה באמצעות מיקרוסקופ Confocal וקדי

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

הבהרת והדמיה של קנדידה ביוביאמים

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis

לימוד מכונה ללימוד למחצה של דנ א של מסחטות בפקאוסולפטיס

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular ...

Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy

מדידת ה-pH, הכימיות האדומות והיכולת המשפילה של מקרופאינוזום באמצעות מיקרוסקופיה רציומטרית דו-פלואורופור

In recent years, the field of macropinocytosis has grown rapidly. Macropinocytosis has emerged as a central mechanism by which innate immune cells ...

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

מודל חדשני של פצעי עור Ex Vivo Ovine בתפוקה גבוהה לבדיקת אנטיביוטיקה מתפתחת

The development of antimicrobials is an expensive process with increasingly low success rates, which makes further investment in antimicrobial discovery ...