Name: ratiometric imaging of extracellular ph in dental biofilms
Uploaded: 2016-03-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke Javier E. Garcia og Lene Grønkjær for teknisk assistanse og Merete K. Raarup for fruktbare diskusjoner. Dette arbeidet ble finansiert av Aarhus University Research Foundation og Simon Spies Foundation.

Den eksperimentelle protokollen ble gjennomgått og godkjent av etikkomiteen av Århus amt (M-20100032). 1. Confocal Mikroskopisk Kalibrering av Proporsjonellekspansjon Dye <ol><li> For bildeoverføring, kan du bruke en omvendt confocal mikroskop utstyrt med en inkubator, et 63X / 1.2-numerisk aperture vann nedsenking objektiv, en 543 nm laser linje og en META-detektor. </li><li> Forbered HEPES buffer stamløsninger (50 mM, innstilt til pH 4,5 til 8,5 i trinn på 0,1 pH-enheter). Pipetter 100 ul av hver opplø...

<ol>
	<li>Hunter, R. C., Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+pH-sensitive+fluoroprobe+(C-SNARF-4)+for+pH+microenvironment+analysis+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71 (5), 2501-2510 (2005).</li><li>Takahashi, N., Nyvad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caries+ecology+revisited:+microbial+dynamics+and+the+caries+process.">Caries ecology revisited: microbial dynamics and the caries process.</a> Caries Res. 42 (6), 409-418 (2008).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+landscapes+in+a+novel+five-species+model+of+early+dental+biofilm.">pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm.</a> PLoS. One. 6 (9), e25299 (2011).</li><li>von Ohle, O. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+microsensor+measurement+of+local+metabolic+activities+in+ex+vivo+dental+biofilms+exposed+to+sucrose+and+treated+with+chlorhexidine.">Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (7), 2326-2334 (2010).</li><li>Revsbech, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+microbial+communities+with+electrochemical+microsensors+and+microscale+biosensors.">Analysis of microbial communities with electrochemical microsensors and microscale biosensors.</a> Methods Enzymol. 397, 147-166 (2005).</li><li>Vanhoudt, P., Lewandowski, Z., Little, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iridium+oxide+pH+microelectrode.">Iridium oxide pH microelectrode.</a> Biotechnol. Bioeng. 40 (5), 601-608 (1992).</li><li>Franks, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategy+for+three-dimensional+real-time+imaging+of+microbial+fuel+cell+communities:+monitoring+the+inhibitory+effects+of+proton+accumulation+within+the+anode+biofilm.">Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm.</a> Energy &amp; Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).</li><li>Hidalgo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tomographic+fluorescence+imaging+of+pH+microenvironments+in+microbial+biofilms+by+use+of+silica+nanoparticle+sensors.">Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (23), 7426-7435 (2009).</li><li>Vroom, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depth+penetration+and+detection+of+pH+gradients+in+biofilms+by+two-photon+excitation+microscopy.">Depth penetration and detection of pH gradients in biofilms by two-photon excitation microscopy.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65 (8), 3502-3511 (1999).</li><li>Bender, G. R., Sutton, S. V., Marquis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid+tolerance,+proton+permeabilities,+and+membrane+ATPases+of+oral+streptococci.">Acid tolerance, proton permeabilities, and membrane ATPases of oral streptococci.</a> Infect. Immun. 53 (2), 331-338 (1986).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+imaging+of+extracellular+pH+in+bacterial+biofilms+using+C-SNARF-4.">Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms using C-SNARF-4.</a> Appl. Environ. Microbiol. 81 (4), 1267-1273 (2015).</li><li>Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+identification+of+streptococci+and+other+bacteria+in+initial+dental+biofilm+by+confocal+laser+scanning+microscopy+and+fluorescence+in+situ+hybridization.">In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization.</a> Eur. J Oral Sci. 115 (6), 459-467 (2007).</li><li>de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+oral+Streptococcus+species+and+Actinomyces+viscosus+in+human+saliva.">Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva.</a> Appl. Environ. Microbiol. 47 (5), 901-904 (1984).</li><li>Daims, H., Lucker, S., Wagner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=daime,+a+novel+image+analysis+program+for+microbial+ecology+and+biofilm+research.">daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research.</a> Environ. Microbiol. 8 (2), 200-213 (2006).</li><li>Liu, Y. L., Nascimento, M., Burne, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+toward+understanding+the+contribution+of+alkali+generation+in+dental+biofilms+to+inhibition+of+dental+caries.">Progress toward understanding the contribution of alkali generation in dental biofilms to inhibition of dental caries.</a> Int. J Oral Sci. 4 (3), 135-140 (2012).</li></ol>

Mikroskopisk overvåking av biofilm pH gir flere fordeler, sammenlignet med elektroden eller microelectrode målinger 4-6. Mikroskopiske teknikker som tillater å bestemme pH-verdien med en høy romlig oppløsning og tillater å fange både horisontale og vertikale pH-gradienter i biofilmer uten å forstyrre biofilmen mekanisk. Tidligere forsøk av mikroskopiske pH-måling er imidlertid ikke klart å skille mellom ekstracellulær og intracellulær pH i biofilmer 1,7,9. På grunn av bakteriell homeo...

Den metode som er beskrevet her gjør det mulig å overvåke ekstracellulære pH i tann biofilmer i området mellom 4.5 og 7, ved hjelp av ratiometrisk fargestoff seminaphthorhodafluor-4F 5- (og 6-) karboksylsyre (C-snarf-4) i kombinasjon med konfokal laser-skanning mikroskopi og digital bildeanalyse. Den næringsdrivende fluorescerende fargestoff er pH-følsomt og viser et skifte i sin fluorescensemisjon avhengig av tilstanden av protonering. Fluorescensemisjonen fra de protonerte molekyl topper ved 580 nm, og emisjonen av den deprotonerte molekylet ved 640 nm 1. Forholdet mellom fluorescens-emisjonsintensitet i to deteksjons vinduer omfattende de to utslipps toppene (576-608 nm og 629-661 nm) reflekterer således pH-verdien i den flytende fase, uavhengig av fargestoff konsentrasjon. Med en pKa på ~ 6,4 fargestoffet er egnet til å visualisere pH i moderat sure miljøer. PH i bakterielle biofilmer er av sentral betydning for alle metabolske prosesser.I tilfelle av tann biofilmer, pH i den ekstracellulære matriks er nøkkelen virulens faktor for utviklingen av karies. Lengre perioder med lav pH i biofilm-tann grensesnitt føre til treg demineralisering av den underliggende emalje to. På grunn av den komplekse tredimensjonale arkitektur av biofilm, metabolitter, innbefattende organiske syrer, ikke er jevnt fordelt på tvers av biofilm. Høyt og mindre acidogenic microenvironments kan finnes i umiddelbar romlig nærhet tre. I flere tiår ble vertikale pH-gradienter i biofilmer spilt inn med hjelp av mikroelektroder 4-6. Mens de tilbyr en god romlig oppløsning på grunn av sin lille spissen størrelse, de er ikke godt egnet til å overvåke horisontale gradienter. Videre, innføring av elektroden forstyrrer biofilmen mekanisk. Kvantitative fluorescerende mikroskopiske teknikker tilbyr fordelen av å visualisere pH-endringer i ulike områder av en biofilm uten mekanisk forstyrreNCE. Ulike mikroskopiske synsfelt kan velges fritt og avbildes gjentatte ganger over lengre perioder 1,7-9. Imidlertid, når man tolker mikroskopiske biofilm-bilder, er det viktig å skille mellom fluorescens som stammer fra mikrobiell biomasse og fluorescens som stammer fra det ekstracellulære rom. I sure betingelser, pH innenfor bakteriecellene er forskjellig fra pH-verdien i den ekstracellulære matriks, som bakterier aktivt transporterer protoner gjennom cellemembranen på bekostning av adenosintrifosfat 10. I sammenheng med karies, betyr intracellulær bakterie pH ikke har en direkte innvirkning på de underliggende emalje mens lav ekstracellulære pH fører til demineralisering. Gjennomsnitt pH i mikroskopiske bilder som inneholder både bakteriefrie områder og bakterier fører til feilaktige resultater. Bruken av andre flekker sammen med den pH-følsomt fargestoff for å visualisere bakteriell biomasse og skille mellom ekstra- og intracellulære områder bringer abut risikoen for fluorescerende forurensning av det ekstracellulære rom og falske målinger 11. Den foreliggende manuskriptet beskriver således bruken av den ratiometrisk fargestoff i en dobbeltfunksjon; både som en pH-markør og som en universell bakterie flekk. Som fargestoff er opp-konsentrert i bakterieceller, er kombinasjonen av konfokal mikroskopisk avbildning og en nøyaktig digital bildeanalyse fremgangsmåte tillater bestemmelse av ekstracellulære pH i området mellom 4,5 og 7,0 i tynne tann biofilmer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1258">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Zeiss LSM 510 META</td>
			<td style="width:305px;">Zeiss</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">C-Apochromat 63X water immersion objective</td>
			<td style="width:305px;">Zeiss</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">XL Incubator</td>
			<td style="width:305px;">PeCON</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid</td>
			<td style="width:305px;">Life Technologies</td>
			<td>S23920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:305px;">Life Technologies</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">HEPES</td>
			<td style="width:305px;">Life Technologies</td>
			<td>11344-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Costar 96-well black clear-bottom plate</td>
			<td style="width:305px;">Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:409px;">Custom-made glass slabs (4x4x1 mm; 1,200 grit)</td>
			<td style="width:305px;">Menzel</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Alginate impression material</td>
			<td style="width:305px;">GC Corporation</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs</td>
			<td style="width:305px;">Axis Dental</td>
			<td style="width:243px;">LS-906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Orthodontic retainer containers</td>
			<td style="width:305px;">Spark Medical Equipment Co., Ltd</td>
			<td style="width:243px;">SK-WDTC01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Sticky wax</td>
			<td style="width:305px;">Dentsply</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chewing paraffin wax&#160;</td>
			<td>Ivoclar Vivadent AG</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Dithiothreitol</td>
			<td style="width:305px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td>Used during preparation of salivary solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">0.45 &#181;m and 0.2 &#181;m syringe filters</td>
			<td style="width:305px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS431220; CLS431219&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:409px;">daime</td>
			<td style="width:305px;">University of Vienna, Austria</td>
			<td style="width:243px;">http://dome.csb.univie.ac.at/daime</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">ImageJ</td>
			<td>NIH, Bethesda, Maryland, USA</td>
			<td style="width:243px;">http://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ratiometric imaging of extracellular ph in dental biofilms

PH i bakterie biofilmer på tennene er av sentral betydning for tannråte, en sykdom med høy globale utbredelsen. Næringsstoffer og metabolitter blir ikke fordelt jevnt i dental biofilm. Et komplekst samspill av sorpsjon til og omsetning med organisk materiale i biofilm reduserer diffusjon banene for oppløste stoffer og skaper bratte stigninger av reaktive molekyler, inkludert organiske syrer, på tvers av biofilm. Kvantitative fluorescerende mikroskopiske metoder, for eksempel fluorescens levetid avbildning eller pH ratiometry, kan brukes til å visualisere pH i ulike microenvironments tann biofilm. pH ratiometry utnytter en pH-avhengig skift i fluorescensemisjonen fra pH-følsomme fargestoffer. Beregning av emisjonsforholdet ved to forskjellige bølgelengder gjør det mulig å bestemme lokal pH i mikroskopiske bilder, uavhengig av konsentrasjonen av fargestoffet. I motsetning til mikroelektroder teknikken tillater overvåking både vertikale og horisontale pH-gradienter i sanntid medut mekanisk forstyrre biofilm. Imidlertid må man sørge for å skille nøyaktig mellom ekstra- og intracellulære kamre i biofilmen. Her er den ratiometrisk fargestoff, seminaphthorhodafluor-4F 5- (og 6-) karboksylsyre (C-snarf-4) anvendes for å overvåke ekstracellulære pH i in vivo-dyrket tann biofilm med ukjent artssammensetning. Ved eksponering til glukose fargestoffet er opp-konsentrert på innsiden av alle bakteriecellene i biofilmer; Det benyttes således både som en universell bakterie flekk og som en markør av ekstracellulært pH. Etter confocal mikroskopisk bilde oppkjøpet, er bakteriell biomasse fjernes fra alle bildene ved hjelp av digital bildeanalyse programvare, som tillater å utelukkende beregne ekstracellulære pH. pH ratiometry med den ratiometrisk fargestoffet er godt egnet for å studere ekstracellulære pH i tynne biofilm på opp til 75 um tykkelse, men er begrenset til det pH-område mellom 4,5 og 7,0.

Den presenterte metoden tillater overvåking ekstracellulære pH synker i forskjellige microenvironments tann biofilm i pH-området fra 4,5 til 7 i sanntid. Dersom forsøksbetingelsene er valgt som beskrevet ovenfor, pH begynner å slippe i alle områder av biofilmer kort tid etter eksponering til glukose. Når pH i en biofilm dråper, bakterieceller blir synlige i løpet av kort tid (&lt;1 min), som den ratiometrisk fargestof...

Watch this Scientific Journal Video about Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms at JoVE.com

Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

Proporsjonal Imaging av ekstracellulær pH ​​i Dental Biofilm

Et pH-følsomt fargestoff ratiometrisk brukes i kombinasjon med konfokal laser-skanning mikroskopi og digital bildeanalyse for å overvåke ekstracellulære pH i tann biofilmer i sanntid.

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Vekst av Mycobacterium tuberculosis Biofilm

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Måling Phagosome pH ved Proporsjonellekspansjon Fluorescensmikroskopi

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

Bildebehandling nøytrofile fagosomet og Cytoplasm Ved hjelp av en Proporsjonellekspansjon pH-indikator

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular ...

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Rensing av en High Molecular Mass protein i Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy

Overvåking ekstracellulær pH i Cross-Kingdom Biofilms ved hjelp av Confocal Microscopy

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Avklare og imaging Candida albicans Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis

Veiledet maskinlæring for semikvantifisering av ekstracellulært DNA i Glomerulonefrit

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular ...

Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy

Måling av pH, redokskjemier og nedbrytende kapasitet for makropinosomer ved hjelp av dual-fluorofor ratiometrisk mikroskopi

In recent years, the field of macropinocytosis has grown rapidly. Macropinocytosis has emerged as a central mechanism by which innate immune cells ...

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

En ny høy gjennomstrømning ex vivo ovine hud sårmodell for testing av nye antibiotika

The development of antimicrobials is an expensive process with increasingly low success rates, which makes further investment in antimicrobial discovery ...

Proporsjonal Imaging av ekstracellulær pH ​​i Dental Biofilm

Proporsjonal Imaging av ekstracellulær pH i Dental Biofilm