Name: ratiometric imaging of extracellular ph in dental biofilms
Uploaded: 2016-03-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms at JoVE.com

Os autores gostariam de agradecer a Javier E. Garcia e Lene Grønkjær de assistência técnica e Merete K. Raarup para discussões frutíferas. Este trabalho foi financiado pelo Aarhus University Research Foundation eo Simon Spies Foundation.

O protocolo experimental foi analisado e aprovado pelo Comitê de Ética de Aarhus County (M-20100032). 1. confocal microscópica Calibração do Ratiometric Dye <ol><li> Para aquisição de imagem, use um microscópio invertido confocal equipado com uma incubadora, uma objectiva de imersão em água abertura 63X / 1.2-numérico, uma linha de laser 543 nm e um detector de META. </li><li> Preparar tampão HEPES soluções de reserva (50 mM, ajustado a pH 4,5-8,5 em passos de 0,1 unidades de pH). Pipetar 100 l d...

<ol>
	<li>Hunter, R. C., Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+pH-sensitive+fluoroprobe+(C-SNARF-4)+for+pH+microenvironment+analysis+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71 (5), 2501-2510 (2005).</li><li>Takahashi, N., Nyvad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caries+ecology+revisited:+microbial+dynamics+and+the+caries+process.">Caries ecology revisited: microbial dynamics and the caries process.</a> Caries Res. 42 (6), 409-418 (2008).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+landscapes+in+a+novel+five-species+model+of+early+dental+biofilm.">pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm.</a> PLoS. One. 6 (9), e25299 (2011).</li><li>von Ohle, O. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+microsensor+measurement+of+local+metabolic+activities+in+ex+vivo+dental+biofilms+exposed+to+sucrose+and+treated+with+chlorhexidine.">Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (7), 2326-2334 (2010).</li><li>Revsbech, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+microbial+communities+with+electrochemical+microsensors+and+microscale+biosensors.">Analysis of microbial communities with electrochemical microsensors and microscale biosensors.</a> Methods Enzymol. 397, 147-166 (2005).</li><li>Vanhoudt, P., Lewandowski, Z., Little, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iridium+oxide+pH+microelectrode.">Iridium oxide pH microelectrode.</a> Biotechnol. Bioeng. 40 (5), 601-608 (1992).</li><li>Franks, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategy+for+three-dimensional+real-time+imaging+of+microbial+fuel+cell+communities:+monitoring+the+inhibitory+effects+of+proton+accumulation+within+the+anode+biofilm.">Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm.</a> Energy &amp; Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).</li><li>Hidalgo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tomographic+fluorescence+imaging+of+pH+microenvironments+in+microbial+biofilms+by+use+of+silica+nanoparticle+sensors.">Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (23), 7426-7435 (2009).</li><li>Vroom, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depth+penetration+and+detection+of+pH+gradients+in+biofilms+by+two-photon+excitation+microscopy.">Depth penetration and detection of pH gradients in biofilms by two-photon excitation microscopy.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65 (8), 3502-3511 (1999).</li><li>Bender, G. R., Sutton, S. V., Marquis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid+tolerance,+proton+permeabilities,+and+membrane+ATPases+of+oral+streptococci.">Acid tolerance, proton permeabilities, and membrane ATPases of oral streptococci.</a> Infect. Immun. 53 (2), 331-338 (1986).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+imaging+of+extracellular+pH+in+bacterial+biofilms+using+C-SNARF-4.">Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms using C-SNARF-4.</a> Appl. Environ. Microbiol. 81 (4), 1267-1273 (2015).</li><li>Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+identification+of+streptococci+and+other+bacteria+in+initial+dental+biofilm+by+confocal+laser+scanning+microscopy+and+fluorescence+in+situ+hybridization.">In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization.</a> Eur. J Oral Sci. 115 (6), 459-467 (2007).</li><li>de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+oral+Streptococcus+species+and+Actinomyces+viscosus+in+human+saliva.">Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva.</a> Appl. Environ. Microbiol. 47 (5), 901-904 (1984).</li><li>Daims, H., Lucker, S., Wagner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=daime,+a+novel+image+analysis+program+for+microbial+ecology+and+biofilm+research.">daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research.</a> Environ. Microbiol. 8 (2), 200-213 (2006).</li><li>Liu, Y. L., Nascimento, M., Burne, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+toward+understanding+the+contribution+of+alkali+generation+in+dental+biofilms+to+inhibition+of+dental+caries.">Progress toward understanding the contribution of alkali generation in dental biofilms to inhibition of dental caries.</a> Int. J Oral Sci. 4 (3), 135-140 (2012).</li></ol>

Monitorização microscópica de pH biofilme proporciona várias vantagens, como comparado com eléctrodos ou microeléctrodos 4-6 medições. técnicas microscópicas permitir determinar pH com uma alta resolução espacial e permitir a captura gradientes de pH horizontais e verticais em biofilmes sem perturbar o biofilme mecanicamente. As tentativas anteriores de monitoramento do pH microscópico, no entanto, não conseguiram diferenciar entre pH extracelular e intracelular no biofilme 1,7,9. Dev...

O método descrito aqui permite a monitorização do pH extracelular em biofilmes dentais na gama entre 4,5 e 7, utilizando o corante raciométrica seminaphthorhodafluor 4F-5- (e-6) ácido carboxílico (C-SNARF-4), em combinação com a microscopia de varrimento a laser confocal e análise de imagem digital. O corante fluorescente empregue é sensível ao pH e exibe uma mudança na sua emissão fluorescente, dependendo do estado de protonação. A emissão fluorescente dos picos de moléculas protonadas a 580 nm, e a emissão da molécula desprotonado em 640 nm 1. A razão entre as intensidades de emissão fluorescente em duas janelas de detecção que compreende os dois picos de emissão (576-608 nm e 629-661 nm) reflecte, portanto, o pH na fase líquida, independentemente da concentração de corante. Com um valor de pKa de 6,4 ~ o corante é adequado para visualização em ambientes de pH moderadamente ácidas. PH no biofilme bacteriano é de importância central para todos os processos metabólicos.No caso de biofilmes dentais, o pH na matriz extracelular é o factor de virulência chave para o desenvolvimento de cárie dentária. Longos períodos com pH baixo na liderança interface de biofilme-tooth para retardar a desmineralização do esmalte subjacente 2. Devido à arquitectura tridimensional complexa de biofilmes, metabolitos, incluindo os ácidos orgânicos, não são uniformemente distribuídos através do biofilme. Altamente e menos microambientes acidogênicas pode ser encontrada em estreita proximidade espacial 3. Durante décadas, os gradientes de pH verticais em biofilmes foram gravadas com a ajuda de microeletrodos 4-6. Enquanto eles oferecem uma boa resolução espacial devido ao seu tamanho pequeno ponta, eles não são adequados para monitorar gradientes horizontais. Além disso, a inserção do eléctrodo perturba o biofilme mecanicamente. técnicas microscópicas fluorescentes quantitativos oferecem a vantagem de visualizar mudanças de pH em diferentes áreas de um biofilme sem interferir mecânicance. Diferentes campos de vista microscópico pode ser escolhido livremente e fotografada várias vezes ao longo de períodos prolongados 1,7-9. No entanto, ao interpretar imagens microscópicas de biofilme, é importante fazer a distinção entre a fluorescência derivada da biomassa microbiana e a fluorescência resultante a partir do espaço extracelular. Em condições acídicas, o pH no interior das células bacterianas é diferente do pH na matriz extracelular, como as bactérias transportar activamente protões através sua membrana celular à custa de adenosina trifosfato 10. No contexto da cárie dentária, pH bacteriana intracelular não tem um impacto direto sobre o esmalte subjacentes enquanto baixo pH extracelular leva a desmineralização. Média de pH em imagens microscópicas que contêm ambas as áreas e bactérias livres de bactérias leva a resultados errados. A utilização de outras manchas, juntamente com o corante sensível ao pH, a fim de visualizar a biomassa bacteriana e diferenciar entre as áreas extra e intracelulares traz abo risco de contaminação de fluorescência do espaço extracelular e erros de medição 11. Por conseguinte, o presente manuscrito descreve a utilização do corante raciométrica numa função dupla; tanto como um marcador de pH e como uma mancha universal de bactérias. Como o corante é-se concentrado em células bacterianas, a combinação de imagem microscópica confocal e um processo de análise de imagem digital preciso permite determinar o pH extracelular no intervalo entre 4,5 e 7,0 em biofilmes finos dentários.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1258">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Zeiss LSM 510 META</td>
			<td style="width:305px;">Zeiss</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">C-Apochromat 63X water immersion objective</td>
			<td style="width:305px;">Zeiss</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">XL Incubator</td>
			<td style="width:305px;">PeCON</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid</td>
			<td style="width:305px;">Life Technologies</td>
			<td>S23920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:305px;">Life Technologies</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">HEPES</td>
			<td style="width:305px;">Life Technologies</td>
			<td>11344-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Costar 96-well black clear-bottom plate</td>
			<td style="width:305px;">Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:409px;">Custom-made glass slabs (4x4x1 mm; 1,200 grit)</td>
			<td style="width:305px;">Menzel</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Alginate impression material</td>
			<td style="width:305px;">GC Corporation</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs</td>
			<td style="width:305px;">Axis Dental</td>
			<td style="width:243px;">LS-906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Orthodontic retainer containers</td>
			<td style="width:305px;">Spark Medical Equipment Co., Ltd</td>
			<td style="width:243px;">SK-WDTC01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Sticky wax</td>
			<td style="width:305px;">Dentsply</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chewing paraffin wax&#160;</td>
			<td>Ivoclar Vivadent AG</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Dithiothreitol</td>
			<td style="width:305px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td>Used during preparation of salivary solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">0.45 &#181;m and 0.2 &#181;m syringe filters</td>
			<td style="width:305px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS431220; CLS431219&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:409px;">daime</td>
			<td style="width:305px;">University of Vienna, Austria</td>
			<td style="width:243px;">http://dome.csb.univie.ac.at/daime</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">ImageJ</td>
			<td>NIH, Bethesda, Maryland, USA</td>
			<td style="width:243px;">http://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ratiometric imaging of extracellular ph in dental biofilms

O pH em biofilmes bacterianas nos dentes é de importância central para a cárie dentária, uma doença com alta prevalência em todo o mundo. Nutrientes e metabólitos não são distribuídas uniformemente em biofilmes dentais. Uma interacção complexa de sorção de reacção e com a matéria orgânica no biofilme reduz os caminhos de difusão de solutos e cria gradientes íngremes de moléculas reactivas, incluindo os ácidos orgânicos, entre os biofilme. métodos microscópicos fluorescentes quantitativos, tais como a imagiologia de tempo de vida de fluorescência ou ratiometry pH, pode ser utilizado para visualizar o pH em diferentes microambientes de biofilmes dentais. pH ratiometry explora um deslocamento dependente do pH na emissão de fluorescência de corantes sensíveis ao pH. O cálculo da razão de emissão em dois comprimentos de onda diferentes permite a determinação do pH local em imagens microscópicas, independentemente da concentração do corante. Contrariamente ao microeléctrodos a técnica permite monitorar ambos os gradientes de pH verticais e horizontais em tempo real commecanicamente perturbar o biofilme. No entanto, é preciso ter cuidado para diferenciar com precisão entre os compartimentos extra e intracelulares do biofilme. Aqui, o corante raciométrica, seminaphthorhodafluor 4F-5- (e-6) ácido carboxílico (C-SNARF-4) é empregue para monitorizar o pH extracelular in vivo em biofilmes dentais cultivadas espécies de composição desconhecida. Após a exposição a glicose do corante é up-concentrada dentro de todas as células bacterianas nos biofilmes; É, assim, usado tanto como uma mancha universal de bactérias e como um marcador do pH extracelular. Após a aquisição da imagem microscópica confocal, a biomassa bacteriana é removida de todas as fotos usando o software de análise de imagem digital, que permite calcular exclusivamente pH extracelular. ratiometry pH com o corante proporcional está bem adequado para o estudo do pH extracelular em biofilmes finos de até 75 um de espessura, mas está limitada ao intervalo de pH entre 4,5 e 7,0.

O método apresentado permite a monitorização extracelular pH cai em diferentes microambientes de biofilmes dentais na gama de pH de 4,5 a 7, em tempo real. Se as condições experimentais são escolhidas como descrito acima, o pH começa a cair em todas as áreas dos biofilmes logo após a exposição à glicose. Quando o pH em um biofilme gotas, as células bacterianas se tornam visíveis dentro de pouco tempo (&lt;1 min),...

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Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

Imagem raciométrica de pH extracelular no biofilme dentário

Um corante raciométrica sensível ao pH é utilizado em combinação com a microscopia de varrimento a laser confocal e análise de imagem digital para monitorar o pH extracelular em biofilmes dentários em tempo real.

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...

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