Name: ratiometric imaging of extracellular ph in dental biofilms
Uploaded: 2016-03-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Хавьер Гарсиа и Е. Лене Груншер об оказании технической помощи и Мерете К. Raarup за плодотворные дискуссии. Эта работа финансировалась исследовательского фонда Университета Орхус и Simon Spies Foundation.

Экспериментальный протокол был рассмотрен и одобрен Комитетом по этике Орхусе County (M-20100032) путем. 1. конфокальной Микроскопические Калибровка Логометрический Dye <ol><li> Для получения изображения, используйте перевернутую конфокальной микроскопии, оснащенный инкубатор, 63X / 1.2-цифров?...

<ol>
	<li>Hunter, R. C., Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+pH-sensitive+fluoroprobe+(C-SNARF-4)+for+pH+microenvironment+analysis+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71 (5), 2501-2510 (2005).</li><li>Takahashi, N., Nyvad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caries+ecology+revisited:+microbial+dynamics+and+the+caries+process.">Caries ecology revisited: microbial dynamics and the caries process.</a> Caries Res. 42 (6), 409-418 (2008).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+landscapes+in+a+novel+five-species+model+of+early+dental+biofilm.">pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm.</a> PLoS. One. 6 (9), e25299 (2011).</li><li>von Ohle, O. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+microsensor+measurement+of+local+metabolic+activities+in+ex+vivo+dental+biofilms+exposed+to+sucrose+and+treated+with+chlorhexidine.">Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (7), 2326-2334 (2010).</li><li>Revsbech, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+microbial+communities+with+electrochemical+microsensors+and+microscale+biosensors.">Analysis of microbial communities with electrochemical microsensors and microscale biosensors.</a> Methods Enzymol. 397, 147-166 (2005).</li><li>Vanhoudt, P., Lewandowski, Z., Little, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iridium+oxide+pH+microelectrode.">Iridium oxide pH microelectrode.</a> Biotechnol. Bioeng. 40 (5), 601-608 (1992).</li><li>Franks, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategy+for+three-dimensional+real-time+imaging+of+microbial+fuel+cell+communities:+monitoring+the+inhibitory+effects+of+proton+accumulation+within+the+anode+biofilm.">Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm.</a> Energy &amp; Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).</li><li>Hidalgo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tomographic+fluorescence+imaging+of+pH+microenvironments+in+microbial+biofilms+by+use+of+silica+nanoparticle+sensors.">Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (23), 7426-7435 (2009).</li><li>Vroom, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depth+penetration+and+detection+of+pH+gradients+in+biofilms+by+two-photon+excitation+microscopy.">Depth penetration and detection of pH gradients in biofilms by two-photon excitation microscopy.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65 (8), 3502-3511 (1999).</li><li>Bender, G. R., Sutton, S. V., Marquis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid+tolerance,+proton+permeabilities,+and+membrane+ATPases+of+oral+streptococci.">Acid tolerance, proton permeabilities, and membrane ATPases of oral streptococci.</a> Infect. Immun. 53 (2), 331-338 (1986).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+imaging+of+extracellular+pH+in+bacterial+biofilms+using+C-SNARF-4.">Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms using C-SNARF-4.</a> Appl. Environ. Microbiol. 81 (4), 1267-1273 (2015).</li><li>Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+identification+of+streptococci+and+other+bacteria+in+initial+dental+biofilm+by+confocal+laser+scanning+microscopy+and+fluorescence+in+situ+hybridization.">In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization.</a> Eur. J Oral Sci. 115 (6), 459-467 (2007).</li><li>de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+oral+Streptococcus+species+and+Actinomyces+viscosus+in+human+saliva.">Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva.</a> Appl. Environ. Microbiol. 47 (5), 901-904 (1984).</li><li>Daims, H., Lucker, S., Wagner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=daime,+a+novel+image+analysis+program+for+microbial+ecology+and+biofilm+research.">daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research.</a> Environ. Microbiol. 8 (2), 200-213 (2006).</li><li>Liu, Y. L., Nascimento, M., Burne, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+toward+understanding+the+contribution+of+alkali+generation+in+dental+biofilms+to+inhibition+of+dental+caries.">Progress toward understanding the contribution of alkali generation in dental biofilms to inhibition of dental caries.</a> Int. J Oral Sci. 4 (3), 135-140 (2012).</li></ol>

Микроскопический контроль биопленки рН обеспечивает ряд преимуществ, по сравнению с электродными или микроэлектродов измерений 4-6. Микроскопические методы позволяют определить рН с высоким пространственным разрешением и позволяет захватывать горизонтальные и вертикальные г?...

Описанный здесь метод позволяет осуществлять мониторинг внеклеточный рН в зубных биопленок в диапазоне от 4,5 до 7, с использованием Логометрический краситель seminaphthorhodafluor-4F 5- (а-6) карбоновой кислоты (С-Snarf-4) в сочетании с конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и цифрового анализа изображений. Примененный флуоресцентный краситель рН-чувствительный и отображает сдвиг в его флуоресцентного излучения в зависимости от состояния протонирования. Флуоресцентное излучение протонированных пиков молекул при 580 нм, а излучение депротонированным молекулы при 640 нм 1. Отношение флуоресцентных интенсивностей излучения в двух окнах обнаружения содержит два пика излучения (576 - 608 нм и 629 - 661 нм), таким образом, отражает значение рН в жидкой фазе, независимо от концентрации красителя. С рК а ~ 6,4 краситель подходит для визуализации рН в умеренно кислой среде. PH в бактериальных биопленок имеет центральное значение для всех метаболических процессов.В случае зубных биопленок, рН во внеклеточной матрице является ключевым фактором вирулентности для развития кариеса зубов. Длительные периоды с низким рН на границе раздела свинца биопленки зуба , чтобы замедлить деминерализации эмали подстилающей 2. Из-за сложной трехмерной архитектурой биопленок, метаболитов, в том числе органические кислоты, не распределены равномерно по всему биопленки. Высоко и менее кислотопродуцирующий микросреды могут быть найдены в непосредственной пространственной близости 3. В течение многих десятилетий, вертикальные градиенты рН в биопленки были записаны с помощью микроэлектродов 4-6. Несмотря на то, что они предлагают хорошее пространственное разрешение из-за их небольшого размера наконечника, они не очень хорошо подходят для контроля горизонтальных градиентов. Кроме того, введение электрода нарушает биопленку механически. Количественные флуоресцентные методы микроскопии обеспечивают преимущество визуализации изменений рН в различных областях биопленки без механического интерферироватьсть. Различные микроскопические поля зрения могут быть выбраны свободно и повторно отображены в течение длительных периодов 1,7-9. Тем не менее, при интерпретации микроскопических биопленки изображений, важно проводить различие между флуоресценцией, вытекающей из микробной биомассы и флуоресценции, вытекающей из внеклеточного пространства. В кислой среде, рН внутри бактериальных клеток отличается от рН в внеклеточного матрикса, так как бактерии активно транспортируют протонов через их клеточную мембрану за счет аденозинтрифосфата 10. В контексте кариеса, внутриклеточная бактериальная рН не оказывают непосредственное влияние на нижележащих эмали, тогда как низкий внеклеточного рН приводит к деминерализации. Усреднение рН в микроскопических изображений, которые содержат как бактерии участков, свободных и бактерий приводит к ошибочным результатам. Использование других пятен наряду с рН-чувствительного красителя для визуализации бактериальной биомассы и различия между вне- и внутриклеточных областей приносит абиз - за риска флуоресцентного загрязнения внеклеточного пространства и ложных измерений 11. Поэтому в настоящем рукопись описывает использование Логометрический красителя в двойной функции; как в качестве рН-маркера и в качестве универсального бактериального окрашивания. По мере того как краска повышающего концентрируется в бактериальных клетках, сочетание конфокальной микроскопических изображений и точная процедура анализа цифровых изображений позволяет определить внеклеточный рН в интервале между 4,5 и 7,0 в тонких зубных биопленок.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1258">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Zeiss LSM 510 META</td>
			<td style="width:305px;">Zeiss</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">C-Apochromat 63X water immersion objective</td>
			<td style="width:305px;">Zeiss</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">XL Incubator</td>
			<td style="width:305px;">PeCON</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid</td>
			<td style="width:305px;">Life Technologies</td>
			<td>S23920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:305px;">Life Technologies</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">HEPES</td>
			<td style="width:305px;">Life Technologies</td>
			<td>11344-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Costar 96-well black clear-bottom plate</td>
			<td style="width:305px;">Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:409px;">Custom-made glass slabs (4x4x1 mm; 1,200 grit)</td>
			<td style="width:305px;">Menzel</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Alginate impression material</td>
			<td style="width:305px;">GC Corporation</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs</td>
			<td style="width:305px;">Axis Dental</td>
			<td style="width:243px;">LS-906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Orthodontic retainer containers</td>
			<td style="width:305px;">Spark Medical Equipment Co., Ltd</td>
			<td style="width:243px;">SK-WDTC01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Sticky wax</td>
			<td style="width:305px;">Dentsply</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chewing paraffin wax&#160;</td>
			<td>Ivoclar Vivadent AG</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Dithiothreitol</td>
			<td style="width:305px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td>Used during preparation of salivary solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">0.45 &#181;m and 0.2 &#181;m syringe filters</td>
			<td style="width:305px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS431220; CLS431219&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:409px;">daime</td>
			<td style="width:305px;">University of Vienna, Austria</td>
			<td style="width:243px;">http://dome.csb.univie.ac.at/daime</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">ImageJ</td>
			<td>NIH, Bethesda, Maryland, USA</td>
			<td style="width:243px;">http://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ratiometric imaging of extracellular ph in dental biofilms

РН в бактериальных биопленок на зубах имеет центральное значение для кариеса, болезни с высоким во всем мире распространенности. Питательные вещества и метаболиты не распределены равномерно в зубных биопленок. Сложное взаимодействие сорбции и реакции с органическими веществами в биопленки снижает диффузионные пути растворенных веществ и создает крутые градиенты реактивных молекул, в том числе органических кислот, через биопленку. Количественные флуоресцентные микроскопические методы, такие как флуоресценция жизни времени изображений или рН ratiometry, могут быть использованы для визуализации рН в различных микросреды зубных биопленок. рН ratiometry использует рН-зависимого сдвига в флуоресцентного излучения рН-чувствительных красителей. Расчет коэффициента эмиссии на двух различных длинах волн позволяет определить локальные значения рН в микроскопических изображений, независимо от концентрации красителя. В отличие от микроэлектродов метод позволяет осуществлять мониторинг как вертикальные, так и горизонтальные градиенты рН в реальном времени смеханически нарушая биопленки. Тем не менее, следует соблюдать осторожность, чтобы дифференцировать точно между вне- и внутриклеточным биопленки. Здесь Логометрический краситель, seminaphthorhodafluor-4F 5- (а-6) карбоновой кислоты (С-Snarf-4) используется для мониторинга внеклеточный рН в естественных условиях , выращенных в зубных биопленок неизвестного видового состава. При воздействии на глюкозу краситель вверх сосредоточено внутри всех бактериальных клеток в биопленки; она, таким образом, используется как в качестве универсального бактериального окрашивания и в качестве маркера внеклеточного рН. После того, как конфокальной микроскопического захвата изображений, бактериальная биомасса удаляется из всех изображений с помощью программного обеспечения цифрового анализа изображений, который позволяет исключительно рассчитать внеклеточного рН. рН ratiometry с логометрической красителя хорошо подходит для изучения внеклеточный рН в тонких биопленок толщиной до 75 мкм, но ограничена диапазоном рН от 4,5 до 7,0.

Представленный метод позволяет осуществлять мониторинг внеклеточный рН падает в различных микросреды зубных биопленок в диапазоне рН от 4,5 до 7 в режиме реального времени. Если условия эксперимента выбраны, как описано выше, рН начинает падать во всех областях биопле...

Watch this Scientific Journal Video about Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms at JoVE.com

Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

Логометрический визуализации внеклеточного рН в зубных биопленок

РН-чувствительный ратиометрический краситель используется в сочетании с конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и анализа цифровых изображений для мониторинга внеклеточный рН в зубных биопленок в реальном времени.

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Рост Микобактерий туберкулеза Биопленки

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Измерение рН фагосомы по Логометрический флуоресцентной микроскопии

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

Воображение нейтрофильных фагосомы и цитоплазмы Использование индикатора рН логометрической

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular ...

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Очистка высокомолекулярного массового белка в streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy

Мониторинг внеклеточного рН в кросс-Королевства Biofilms с помощью конфокальной микроскопии

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Уточнение и изображение Candida Альбиканс Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis

Контролируемое машинное обучение для полукоми оценке внеклеточной ДНК при гломерулонефрите

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular ...

Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy

Измерение pH, окислительно-восстановительных химических веществ и деградативной способности макропиносом с помощью двухфлуорофорной ратиометрической микроскопии

In recent years, the field of macropinocytosis has grown rapidly. Macropinocytosis has emerged as a central mechanism by which innate immune cells ...

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

Новая высокопроизводительная модель раны овечьей кожи Ex Vivo для тестирования новых антибиотиков

The development of antimicrobials is an expensive process with increasingly low success rates, which makes further investment in antimicrobial discovery ...