Name: ratiometric imaging of extracellular ph in dental biofilms
Uploaded: 2016-03-09T14:00:00
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Los autores desean agradecer a Javier E. García y Lene Grønkjær para la asistencia técnica y Merete K. Raarup para un debate fructífero. Este trabajo fue financiado por la Fundación de Investigación de la Universidad de Aarhus y la Fundación Simon Spies.

El protocolo experimental fue revisado y aprobado por el Comité de Ética del Condado de Aarhus (M-20100032). 1. confocal microscópica de calibración radiométrica del tinte <ol><li> Para la adquisición de imágenes, usar un microscopio invertido confocal equipado con una incubadora, un objetivo de inmersión en agua apertura 63X / 1.2-numérico, una línea láser de 543 nm y un detector de META. </li><li> Preparar tampón HEPES soluciones madre (50 mM, ajustado a pH 4.5 a 8.5 en pasos de 0,1 unidades de p...

<ol>
	<li>Hunter, R. C., Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+pH-sensitive+fluoroprobe+(C-SNARF-4)+for+pH+microenvironment+analysis+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71 (5), 2501-2510 (2005).</li><li>Takahashi, N., Nyvad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caries+ecology+revisited:+microbial+dynamics+and+the+caries+process.">Caries ecology revisited: microbial dynamics and the caries process.</a> Caries Res. 42 (6), 409-418 (2008).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+landscapes+in+a+novel+five-species+model+of+early+dental+biofilm.">pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm.</a> PLoS. One. 6 (9), e25299 (2011).</li><li>von Ohle, O. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+microsensor+measurement+of+local+metabolic+activities+in+ex+vivo+dental+biofilms+exposed+to+sucrose+and+treated+with+chlorhexidine.">Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (7), 2326-2334 (2010).</li><li>Revsbech, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+microbial+communities+with+electrochemical+microsensors+and+microscale+biosensors.">Analysis of microbial communities with electrochemical microsensors and microscale biosensors.</a> Methods Enzymol. 397, 147-166 (2005).</li><li>Vanhoudt, P., Lewandowski, Z., Little, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iridium+oxide+pH+microelectrode.">Iridium oxide pH microelectrode.</a> Biotechnol. Bioeng. 40 (5), 601-608 (1992).</li><li>Franks, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategy+for+three-dimensional+real-time+imaging+of+microbial+fuel+cell+communities:+monitoring+the+inhibitory+effects+of+proton+accumulation+within+the+anode+biofilm.">Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm.</a> Energy &amp; Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).</li><li>Hidalgo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tomographic+fluorescence+imaging+of+pH+microenvironments+in+microbial+biofilms+by+use+of+silica+nanoparticle+sensors.">Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (23), 7426-7435 (2009).</li><li>Vroom, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depth+penetration+and+detection+of+pH+gradients+in+biofilms+by+two-photon+excitation+microscopy.">Depth penetration and detection of pH gradients in biofilms by two-photon excitation microscopy.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65 (8), 3502-3511 (1999).</li><li>Bender, G. R., Sutton, S. V., Marquis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid+tolerance,+proton+permeabilities,+and+membrane+ATPases+of+oral+streptococci.">Acid tolerance, proton permeabilities, and membrane ATPases of oral streptococci.</a> Infect. Immun. 53 (2), 331-338 (1986).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+imaging+of+extracellular+pH+in+bacterial+biofilms+using+C-SNARF-4.">Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms using C-SNARF-4.</a> Appl. Environ. Microbiol. 81 (4), 1267-1273 (2015).</li><li>Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+identification+of+streptococci+and+other+bacteria+in+initial+dental+biofilm+by+confocal+laser+scanning+microscopy+and+fluorescence+in+situ+hybridization.">In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization.</a> Eur. J Oral Sci. 115 (6), 459-467 (2007).</li><li>de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+oral+Streptococcus+species+and+Actinomyces+viscosus+in+human+saliva.">Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva.</a> Appl. Environ. Microbiol. 47 (5), 901-904 (1984).</li><li>Daims, H., Lucker, S., Wagner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=daime,+a+novel+image+analysis+program+for+microbial+ecology+and+biofilm+research.">daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research.</a> Environ. Microbiol. 8 (2), 200-213 (2006).</li><li>Liu, Y. L., Nascimento, M., Burne, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+toward+understanding+the+contribution+of+alkali+generation+in+dental+biofilms+to+inhibition+of+dental+caries.">Progress toward understanding the contribution of alkali generation in dental biofilms to inhibition of dental caries.</a> Int. J Oral Sci. 4 (3), 135-140 (2012).</li></ol>

Monitoreo microscópico de pH biofilm proporciona varias ventajas, en comparación con los electrodos o microelectrodos mediciones 4-6. técnicas microscópicas permiten determinar el pH con una alta resolución espacial y permitir la captura de gradientes de pH, tanto horizontales como verticales en biofilms sin perturbar el biofilm mecánicamente. Los intentos previos de monitoreo del pH microscópico, sin embargo, no pudieron diferenciar entre pH extracelular e intracelular en las biopelículas 1,7,9....

El método aquí descrito permite el seguimiento de pH extracelular en biofilms dentales en el intervalo entre 4,5 y 7, usando el colorante radiométrica seminaphthorhodafluor-4F 5- (y-6) ácido carboxílico (C-SNARF-4) en combinación con microscopía confocal de barrido láser y análisis de imagen digital. El colorante fluorescente empleado es sensible al pH y muestra un cambio en su emisión fluorescente en función del estado de protonación. La emisión fluorescente de los picos de moléculas protonadas en 580 nm, y la emisión de la molécula desprotonado a 640 nm 1. La relación de las intensidades de emisión fluorescente en dos ventanas de detección que comprende los dos picos de emisión (576-608 nm y 629-661 nm) refleja así pH en la fase líquida, con independencia de la concentración de colorante. Con un pK a de ~ 6,4 el colorante es adecuado para visualizar pH en ambientes moderadamente ácidas. PH en las biopelículas bacterianas es de vital importancia para todos los procesos metabólicos.En el caso de biofilms dentales, pH en la matriz extracelular es el factor de virulencia clave para el desarrollo de la caries dental. Los períodos prolongados con un pH bajo en la interfaz de plomo-biopelícula dental para frenar la desmineralización del esmalte subyacente 2. Debido a la compleja arquitectura tridimensional de biofilms, metabolitos, incluyendo ácidos orgánicos, no se distribuyen uniformemente a través de la biopelícula. Altamente y menos microambientes acidogénicas se pueden encontrar en estrecha proximidad espacial 3. Durante décadas, los gradientes de pH verticales en biofilms se registraron con la ayuda de microelectrodos 4-6. Mientras que ofrecen una buena resolución espacial debido a su pequeño tamaño de la punta, no son muy adecuados para controlar los gradientes horizontales. Por otra parte, la inserción del electrodo perturba el biofilm mecánicamente. Cuantitativos técnicas microscópicas fluorescentes ofrecen la ventaja de visualizar los cambios de pH en las diferentes áreas de un biofilm sin interferir mecánicana vez. Diferentes campos microscópicos de vista se pueden seleccionar libremente y la imagen varias veces durante periodos prolongados 1,7-9. Sin embargo, al interpretar imágenes microscópicas de biofilm, es importante distinguir entre la fluorescencia que deriva de la biomasa microbiana y la fluorescencia derivada del espacio extracelular. En condiciones ácidas, el pH dentro de las células bacterianas es diferente de pH en la matriz extracelular, como las bacterias transportan activamente protones a través de su membrana celular a expensas de trifosfato de adenosina 10. En el contexto de la caries dental, pH intracelular bacteriana no tiene un impacto directo sobre el esmalte mientras que subyacen bajo pH extracelular conduce a la desmineralización. Un promedio de pH en imágenes microscópicas que contienen ambas áreas y bacterias libres de bacterias conduce a resultados erróneos. El uso de otros a lo largo de las manchas con el colorante sensible al pH con el fin de visualizar la biomasa bacteriana y diferenciar entre las áreas extra e intracelulares trae abel riesgo de contaminación fluorescente del espacio extracelular y mediciones falsas 11. Por consiguiente, la presente manuscrito describe el uso del colorante radiométrico en una doble función; tanto como un marcador de pH y como una mancha bacteriana universal. A medida que el tinte es up-concentra en las células bacterianas, la combinación de imágenes microscópicas confocal y un procedimiento de análisis de imagen digital precisa permite la determinación de pH extracelular en el intervalo entre 4,5 y 7,0 en las biopelículas dentales delgados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1258">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Zeiss LSM 510 META</td>
			<td style="width:305px;">Zeiss</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">C-Apochromat 63X water immersion objective</td>
			<td style="width:305px;">Zeiss</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">XL Incubator</td>
			<td style="width:305px;">PeCON</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid</td>
			<td style="width:305px;">Life Technologies</td>
			<td>S23920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:305px;">Life Technologies</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">HEPES</td>
			<td style="width:305px;">Life Technologies</td>
			<td>11344-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Costar 96-well black clear-bottom plate</td>
			<td style="width:305px;">Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:409px;">Custom-made glass slabs (4x4x1 mm; 1,200 grit)</td>
			<td style="width:305px;">Menzel</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Alginate impression material</td>
			<td style="width:305px;">GC Corporation</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs</td>
			<td style="width:305px;">Axis Dental</td>
			<td style="width:243px;">LS-906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Orthodontic retainer containers</td>
			<td style="width:305px;">Spark Medical Equipment Co., Ltd</td>
			<td style="width:243px;">SK-WDTC01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Sticky wax</td>
			<td style="width:305px;">Dentsply</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chewing paraffin wax&#160;</td>
			<td>Ivoclar Vivadent AG</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Dithiothreitol</td>
			<td style="width:305px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td>Used during preparation of salivary solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">0.45 &#181;m and 0.2 &#181;m syringe filters</td>
			<td style="width:305px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS431220; CLS431219&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:409px;">daime</td>
			<td style="width:305px;">University of Vienna, Austria</td>
			<td style="width:243px;">http://dome.csb.univie.ac.at/daime</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">ImageJ</td>
			<td>NIH, Bethesda, Maryland, USA</td>
			<td style="width:243px;">http://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ratiometric imaging of extracellular ph in dental biofilms

El pH en las biopelículas bacterianas en los dientes es de importancia central para la caries dental, una enfermedad con una alta prevalencia en todo el mundo. Los nutrientes y metabolitos no se distribuyen uniformemente en las biopelículas dentales. Una compleja interacción de sorción para y la reacción con la materia orgánica en la biopelícula reduce los caminos de difusión de solutos y crea gradientes empinados de moléculas reactivas, incluyendo ácidos orgánicos, a través de la biopelícula. métodos microscópicos fluorescentes cuantitativos, tales como formación de imágenes tiempo de vida de fluorescencia o ratiometry pH, se pueden emplear para visualizar pH en diferentes microambientes de biofilms dentales. ratiometry pH explota un cambio dependiente del pH en la emisión fluorescente de los colorantes sensibles al pH. Cálculo de la relación de emisión a dos longitudes de onda diferentes permite determinar pH local en imágenes microscópicas, independientemente de la concentración del colorante. Contrariamente a la técnica de microelectrodos permite la monitorización ambos gradientes de pH verticales y horizontales, en tiempo real conperturbar mecánicamente el biofilm. Sin embargo, se debe tener cuidado para diferenciar con precisión entre los compartimentos extra e intracelulares de la biopelícula. Aquí, el colorante radiométrica, seminaphthorhodafluor 4F-5- (y 6) el ácido carboxílico (C-SNARF-4) se emplea para controlar el pH extracelular en vivo en los biofilms dentales cultivadas de la composición de especies desconocidas. Tras la exposición a la glucosa es el colorante concentrado hasta el interior de todas las células bacterianas en las biopelículas; se utiliza de este modo tanto como una mancha bacteriana universal y como un marcador de pH extracelular. Después de la adquisición de imagen microscópica confocal, la biomasa bacteriana se elimina de todas las imágenes utilizando software de análisis de imagen digital, que permite calcular exclusivamente pH extracelular. ratiometry pH con el colorante radiométrico es muy adecuado para estudiar pH extracelular en biofilms delgadas de hasta 75 m de espesor, pero está limitado al intervalo de pH entre 4,5 y 7,0.

El método presentado permite la monitorización extracelular pH cae en diferentes microambientes de biofilms dentales en el intervalo de pH de 4,5 a 7, en tiempo real. Si se eligen las condiciones experimentales como se ha descrito anteriormente, el pH comienza a caer en todas las áreas de las biopelículas poco después de la exposición a la glucosa. Cuando el pH en un biofilm gotas, las células bacterianas se hacen visib...

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Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

Imaging radiométrica de pH extracelular en los biofilms dentales

Un colorante radiométrica sensible al pH se usa en combinación con microscopía confocal de barrido láser y análisis digital de imágenes para monitorizar el pH extracelular en biofilms dentales, en tiempo real.

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