Name: ratiometric imaging of extracellular ph in dental biofilms
Uploaded: 2016-03-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms at JoVE.com

Författarna vill tacka Javier E. Garcia och Lene Grønkjær för tekniskt stöd och Merete K. Raarup för givande diskussioner. Detta arbete har finansierats av Aarhus University Research Foundation och Simon Spies Foundation.

Experimentprotokollet granskades och godkändes av den etiska kommittén i Århus Amt (M-20.100.032). 1. Confocal Mikroskopisk Kalibrering av Propportionell Dye <ol><li> För bildtagning, använda ett inverterat konfokalmikroskop utrustad med en inkubator, en 63x / 1.2-numerisk öppning nedsänkning i vatten mål, en 543 nm laserlinjen och en META detektor. </li><li> Förbered HEPES buffert stamlösningar (50 mM, justerat till pH 4,5 till 8,5 i steg om 0,1 pH-enheter). Pipettera 100 | il av varje lösning i br...

<ol>
	<li>Hunter, R. C., Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+pH-sensitive+fluoroprobe+(C-SNARF-4)+for+pH+microenvironment+analysis+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71 (5), 2501-2510 (2005).</li><li>Takahashi, N., Nyvad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caries+ecology+revisited:+microbial+dynamics+and+the+caries+process.">Caries ecology revisited: microbial dynamics and the caries process.</a> Caries Res. 42 (6), 409-418 (2008).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+landscapes+in+a+novel+five-species+model+of+early+dental+biofilm.">pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm.</a> PLoS. One. 6 (9), e25299 (2011).</li><li>von Ohle, O. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+microsensor+measurement+of+local+metabolic+activities+in+ex+vivo+dental+biofilms+exposed+to+sucrose+and+treated+with+chlorhexidine.">Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (7), 2326-2334 (2010).</li><li>Revsbech, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+microbial+communities+with+electrochemical+microsensors+and+microscale+biosensors.">Analysis of microbial communities with electrochemical microsensors and microscale biosensors.</a> Methods Enzymol. 397, 147-166 (2005).</li><li>Vanhoudt, P., Lewandowski, Z., Little, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iridium+oxide+pH+microelectrode.">Iridium oxide pH microelectrode.</a> Biotechnol. Bioeng. 40 (5), 601-608 (1992).</li><li>Franks, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategy+for+three-dimensional+real-time+imaging+of+microbial+fuel+cell+communities:+monitoring+the+inhibitory+effects+of+proton+accumulation+within+the+anode+biofilm.">Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm.</a> Energy &amp; Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).</li><li>Hidalgo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tomographic+fluorescence+imaging+of+pH+microenvironments+in+microbial+biofilms+by+use+of+silica+nanoparticle+sensors.">Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (23), 7426-7435 (2009).</li><li>Vroom, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depth+penetration+and+detection+of+pH+gradients+in+biofilms+by+two-photon+excitation+microscopy.">Depth penetration and detection of pH gradients in biofilms by two-photon excitation microscopy.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65 (8), 3502-3511 (1999).</li><li>Bender, G. R., Sutton, S. V., Marquis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid+tolerance,+proton+permeabilities,+and+membrane+ATPases+of+oral+streptococci.">Acid tolerance, proton permeabilities, and membrane ATPases of oral streptococci.</a> Infect. Immun. 53 (2), 331-338 (1986).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+imaging+of+extracellular+pH+in+bacterial+biofilms+using+C-SNARF-4.">Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms using C-SNARF-4.</a> Appl. Environ. Microbiol. 81 (4), 1267-1273 (2015).</li><li>Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+identification+of+streptococci+and+other+bacteria+in+initial+dental+biofilm+by+confocal+laser+scanning+microscopy+and+fluorescence+in+situ+hybridization.">In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization.</a> Eur. J Oral Sci. 115 (6), 459-467 (2007).</li><li>de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+oral+Streptococcus+species+and+Actinomyces+viscosus+in+human+saliva.">Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva.</a> Appl. Environ. Microbiol. 47 (5), 901-904 (1984).</li><li>Daims, H., Lucker, S., Wagner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=daime,+a+novel+image+analysis+program+for+microbial+ecology+and+biofilm+research.">daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research.</a> Environ. Microbiol. 8 (2), 200-213 (2006).</li><li>Liu, Y. L., Nascimento, M., Burne, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+toward+understanding+the+contribution+of+alkali+generation+in+dental+biofilms+to+inhibition+of+dental+caries.">Progress toward understanding the contribution of alkali generation in dental biofilms to inhibition of dental caries.</a> Int. J Oral Sci. 4 (3), 135-140 (2012).</li></ol>

Mikroskopisk analys av biofilm pH ger flera fördelar, jämfört med elektrod eller mikroelektrodmätningar 4-6. Mikroskopiska tekniker tillåter att bestämma pH med en hög rumslig upplösning och tillåta fånga både horisontella och vertikala pH-gradienter i biofilmer utan att störa biofilmen mekaniskt. Tidigare försök av mikroskopisk pH-övervakning, dock misslyckats med att skilja mellan extracellulära och intracellulära pH i biofilmer 1,7,9. På grund av bakteriell homeostas skiljer in...

Den här beskrivna metoden gör det möjligt att övervaka extracellulära pH i dental biofilmer i intervallet mellan 4,5 och 7, med användning av den kvotmetriska färgämnet seminaphthorhodafluor-4F 5- (och-6) karboxylsyra (C-snarf-4) i kombination med konfokal laserscanningsmikroskopi och digital bildanalys. Sysselsatta fluorescerande färgämne är pH-känslig och visar en förändring i sin fluorescensemission beroende på tillståndet hos protone. Den fluorescerande emission av protone molekyl toppar vid 580 nm, och emissionen av deprotonerade molekylen vid 640 nm en. Förhållandet mellan de fluorescerande emissionsintensitet i två detekteringsfönster som innefattar de två emissionstopparna (576-608 nm och 629-661 nm) återspeglar således pH i den flytande fasen, oberoende av färgkoncentrationen. Med ett pKa av ~ 6,4 färgämnet är lämpligt att visualisera pH i måttligt sura miljöer. PH i bakteriella biofilmer är av central betydelse för alla metaboliska processer.I fallet med tand biofilmer, är pH i den extracellulära matrisen nyckeln virulens faktor för utvecklingen av dental karies. Längre perioder med lågt pH vid biofilmen tand gränssnitt leder till långsam demineralisering av den underliggande emalj 2. Grund av den komplexa tredimensionella arkitekturen i biofilmer, metaboliter, innefattande organiska syror, inte är enhetligt fördelade över biofilmen. Mycket och mindre syrabildande mikromiljöer kan hittas i nära fysisk närhet 3. I årtionden har vertikala pH-gradienter i biofilmer som spelats in med hjälp av mikroelektroder 4-6. Medan de erbjuder en bra rumslig upplösning på grund av sin lilla spetsstorlek, är de inte väl lämpade för att övervaka horisontella gradienter. Dessutom införing av elektroden stör biofilmen mekaniskt. Kvantitativa fluorescerande mikroskopiska tekniker erbjuder fördelen med att visualisera pH-förändringar i olika områden av en biofilm utan mekanisk interfererance. Olika mikroskopiska synfält kan väljas fritt och avbildas flera gånger under längre perioder 1,7-9. Men när man tolkar mikroskopiska biofilm bilder, är det viktigt att skilja mellan fluorescens som härrör från den mikrobiella biomassan och fluorescens som härrör från det extracellulära utrymmet. Under sura betingelser, är pH inuti bakterieceller skiljer sig från pH i den extracellulära matrisen, som bakterierna aktivt transportera protoner över deras cellmembran på bekostnad av adenosintrifosfat 10. Inom ramen för karies, inte intracellulär bakterie pH inte har en direkt inverkan på de underliggande emalj, medan låg extracellulära pH leder till demineralisering. Genomsnitt pH i mikroskopiska bilder som innehåller både bakteriefria områden och bakterier leder till felaktiga resultat. Användning av andra fläckar tillsammans med pH-känsligt färgämne för att visualisera den bakteriella biomassan och skilja mellan extra- och intracellulära områden ger abut risken för fluorescerande kontaminering av det extracellulära utrymmet och falska mätningar 11. Föreliggande manuskript beskriver därför användning av den kvotmetriska färgämnet i en dubbel funktion; både som en pH-markör och som en universell bakterie fläck. Som färgämnet är upp-koncentreras i bakterieceller, en kombination av konfokala mikroskopisk avbildning och en korrekt digital förfarande bildanalys medger bestämning extracellulärt pH i området mellan 4,5 och 7,0 i tunna tand biofilmer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1258">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Zeiss LSM 510 META</td>
			<td style="width:305px;">Zeiss</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">C-Apochromat 63X water immersion objective</td>
			<td style="width:305px;">Zeiss</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">XL Incubator</td>
			<td style="width:305px;">PeCON</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid</td>
			<td style="width:305px;">Life Technologies</td>
			<td>S23920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:305px;">Life Technologies</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">HEPES</td>
			<td style="width:305px;">Life Technologies</td>
			<td>11344-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Costar 96-well black clear-bottom plate</td>
			<td style="width:305px;">Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:409px;">Custom-made glass slabs (4x4x1 mm; 1,200 grit)</td>
			<td style="width:305px;">Menzel</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Alginate impression material</td>
			<td style="width:305px;">GC Corporation</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs</td>
			<td style="width:305px;">Axis Dental</td>
			<td style="width:243px;">LS-906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Orthodontic retainer containers</td>
			<td style="width:305px;">Spark Medical Equipment Co., Ltd</td>
			<td style="width:243px;">SK-WDTC01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Sticky wax</td>
			<td style="width:305px;">Dentsply</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chewing paraffin wax&#160;</td>
			<td>Ivoclar Vivadent AG</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Dithiothreitol</td>
			<td style="width:305px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td>Used during preparation of salivary solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">0.45 &#181;m and 0.2 &#181;m syringe filters</td>
			<td style="width:305px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS431220; CLS431219&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:409px;">daime</td>
			<td style="width:305px;">University of Vienna, Austria</td>
			<td style="width:243px;">http://dome.csb.univie.ac.at/daime</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">ImageJ</td>
			<td>NIH, Bethesda, Maryland, USA</td>
			<td style="width:243px;">http://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ratiometric imaging of extracellular ph in dental biofilms

PH i bakterie biofilmer på tänderna är av central betydelse för karies, en sjukdom med hög världsomspännande prevalens. Näringsämnen och metaboliter inte fördelas jämnt i tand biofilmer. Komplex samspel av sorption till och reaktion med organiskt material i biofilmen minskar diffusionsvägarna av lösta ämnen och skapar branta gradienter av reaktiva molekyler, innefattande organiska syror, över biofilmen. Kvantitativa fluorescerande mikroskopiska metoder, såsom fluorescens livstid avbildning eller pH ratiometry, kan användas för att visualisera pH i olika mikromiljöer av dentala biofilmer. pH ratiometry utnyttjar en pH-beroende förändring i den fluorescerande emissionen av pH-känsliga färgämnen. Beräkning av emissionsförhållandet vid två olika våglängder medger bestämning lokala pH i mikroskopiska bilder, oberoende av koncentrationen av färgämnet. I motsats till mikroelektroder tekniken tillåter övervakning både vertikala och horisontella pH-gradienter i realtid medut mekaniskt störa biofilmen. Emellertid måste försiktighet iakttas för att noggrant skilja mellan extra- och intracellulära fack i biofilmen. Här, den kvotmetriska färgämnet seminaphthorhodafluor-4F 5- (och-6) karboxylsyra (C-Snarf-4) används för att övervaka extracellulära pH i in vivo odlas tand biofilmer av okänd artsammansättning. Vid exponering för glukos färgämnet är upp-koncentreras i alla bakterieceller i biofilmer; den används sålunda både som en universell bakterie fläcken och som en markör för extracellulärt pH. Efter konfokala mikroskopisk bild förvärv, är den bakteriella biomassan bort från alla bilder med digital bildanalys programvara som tillåter att enbart beräkna extracellulära pH. pH ratiometry med ratiometrisk färgämnet är väl lämpad för att studera extracellulärt pH i tunna biofilmer på upp till 75 um tjocklek, men är begränsad till pH-intervallet mellan 4,5 och 7,0.

Denna metod medger övervakning extracellulärt pH sjunker i olika mikromiljöer av dentala biofilmer i pH-området från 4,5 till 7 i realtid. Om de experimentella betingelserna är valda såsom beskrivits ovan, börjar pH att släppa i alla områden av de biofilmer strax efter exponering för glukos. När pH i en biofilm droppar, bakterieceller blir synliga inom kort tid (&lt;1 min), eftersom den kvotmetriska färgämnet upc...

Watch this Scientific Journal Video about Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms at JoVE.com

Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

Propportionell Imaging av extracellulära pH i Tand Biofilmer

Ett pH-känsligt ratiometrisk färgämne används i kombination med konfokala laserskanning mikroskopi och digital bildanalys för att övervaka extracellulära pH i tand biofilmer i realtid.

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Tillväxt av Mycobacterium tuberculosis Biofilmer

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Mätning Phagosome pH genom Propportionell fluorescensmikroskopi

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

Imaging den neutrofila fagosomen och Cytoplasma hjälp av en Propportionell pH-indikator

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular ...

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Rening av ett högt molekylärt Mass protein i Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy

Övervakning ExtracellulärpH i cross-kingdom biofilmer med confocal mikroskopi

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Förtydligande och Imaging Candida albicans Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis

Övervakad maskininlärning för semikvantifiering av extracellulärt DNA i Glomerulonefrit

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular ...

Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy

Mätning av makropinosomernas pH-, Redoxkemi och degraderande kapacitet med dubbelfluorfor ratiometrisk mikroskopi

In recent years, the field of macropinocytosis has grown rapidly. Macropinocytosis has emerged as a central mechanism by which innate immune cells ...

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

En ny ex vivo-sårmodell med hög genomströmning för får för testning av nya antibiotika

The development of antimicrobials is an expensive process with increasingly low success rates, which makes further investment in antimicrobial discovery ...