Name: primary endodermal epithelial cell culture from the yolk sac membrane of japanese quail embryos
Uploaded: 2016-03-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos at JoVE.com

O financiamento para o desenvolvimento de protocolo atual é particularmente apoiada por &quot;Aim para o Plano Universidade Top&quot;, da Universidade Nacional de Taiwan, Taiwan (concessão ID-104R350144), bem como o Ministério da Ciência e Tecnologia de Taiwan (ID concessão: a maioria dos 104 -2313-B-002-039-MY3). Agradecemos especialmente o Centro de Biotecnologia da Universidade Nacional de Taiwan para fornecer uma sala de animais e espaço de laboratório para o estudo atual.

NOTA: Este procedimento é uma modificação de um protocolo de cultura modelo de galinha desenvolvido por Bauer et al 2013 e Nakazawa et al, 2011. 2,9.. 1. Prepare Healthy Embryonic Dia 5 embriões de codorniz japonesa <ol><li> Coloque 1 do sexo masculino e 3 do sexo feminino sexualmente maduros codornas japonesas juntos na mesma gaiola. Alimentação de alimentação e água ad libitum. Ajustar a luz na sala de animal para 14 horas de luz e ...

<ol>
	<li>Abeyrathne, E. D., Lee, H. Y., Ahn, D. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+white+proteins+and+their+potential+use+in+food+processing+or+as+nutraceutical+and+pharmaceutical+agents--a+review.">Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents--a review.</a> Poult Sci. 92 (12), 3292-3299 (2013).</li><li>Bauer, R., Plieschnig, J. A., Finkes, T., Riegler, B., Hermann, M., Schneider, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developing+chicken+yolk+sac+acquires+nutrient+transport+competence+by+an+orchestrated+differentiation+process+of+its+endodermal+epithelial+cells.">The developing chicken yolk sac acquires nutrient transport competence by an orchestrated differentiation process of its endodermal epithelial cells.</a> J Biol Chem. 288 (2), 1088-1098 (2013).</li><li>Ding, S. T., Nestor, K. E., Lilburn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+concentration+of+different+lipid+classes+during+late+embryonic+development+in+a+randombred+turkey+population+and+a+subline+selected+for+increased+body+weight+at+sixteen+weeks+of+age.">The concentration of different lipid classes during late embryonic development in a randombred turkey population and a subline selected for increased body weight at sixteen weeks of age.</a> Poult Sci. 74 (2), 374-382 (1995).</li><li>Ding, S. T., Lilburn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+expression+of+acyl-coenzyme+A:+cholesterol+acyltransferase+in+the+yolk+sac+membrane,+liver,+and+intestine+of+developing+embryos+and+posthatch+turkeys.">The developmental expression of acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase in the yolk sac membrane, liver, and intestine of developing embryos and posthatch turkeys.</a> Poult Sci. 79 (10), 1460-1464 (2000).</li><li>Ding, S. T., Lilburn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ontogeny+of+fatty+acid-binding+protein+in+turkey+(Meleagridis+gallopavo)+intestine+and+yolk+sac+membrane+during+embryonic+and+early+posthatch+development.">The ontogeny of fatty acid-binding protein in turkey (Meleagridis gallopavo) intestine and yolk sac membrane during embryonic and early posthatch development.</a> Poult Sci. 81 (7), 1065-1070 (2002).</li><li>Kanai, M., Soji, T., Sugawara, E., Watari, N., Oguchi, H., Matsubara, M., Herbert, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Participation+of+endodermal+epithelial+cells+on+the+synthesis+of+plasma+LDL+and+HDL+in+the+chick+yolk+sac.">Participation of endodermal epithelial cells on the synthesis of plasma LDL and HDL in the chick yolk sac.</a> Microsc Res Tech. 35 (4), 340-348 (1996).</li><li>Mobbs, I. G., McMillan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+endodermal+epithelium+of+the+chick+yolk+sac+during+early+stages+of+development.">Structure of the endodermal epithelium of the chick yolk sac during early stages of development.</a> Am J Anat. 155 (3), 287-309 (1979).</li><li>Mobbs, I. G., McMillan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+across+endodermal+cells+of+the+chick+yolk+sac+during+early+stages+of+development.">Transport across endodermal cells of the chick yolk sac during early stages of development.</a> Am J Anat. 160 (3), 285-308 (1981).</li><li>Nakazawa, F., Alev, C., Jakt, L. M., Sheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yolk+sac+endoderm+is+the+major+source+of+serum+proteins+and+lipids+and+is+involved+in+the+regulation+of+vascular+integrity+in+early+chick+development.">Yolk sac endoderm is the major source of serum proteins and lipids and is involved in the regulation of vascular integrity in early chick development.</a> Dev Dyn. 240 (8), 2002-2010 (2011).</li><li>Noble, R. C., Cocchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+metabolism+and+the+neonatal+chicken.">Lipid metabolism and the neonatal chicken.</a> Prog Lipid Res. 29 (2), 107-140 (1990).</li><li>Shand, J. H., West, D. W., McCartney, R. J., Noble, R. C., Speake, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+esterification+of+cholesterol+in+the+yolk+sac+membrane+of+the+chick+embryo.">The esterification of cholesterol in the yolk sac membrane of the chick embryo.</a> Lipids. 28 (7), 621-625 (1993).</li><li>Speier, J. S., Yadgary, L., Uni, Z., Wong, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+of+nutrient+transporters+and+digestive+enzymes+in+the+yolk+sac+membrane+and+small+intestine+of+the+developing+embryonic+chick.">Gene expression of nutrient transporters and digestive enzymes in the yolk sac membrane and small intestine of the developing embryonic chick.</a> Poult Sci. 91 (8), 1941-1949 (2012).</li><li>Walzem, R. L., Hansen, R. J., Williams, D. L., Hamilton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+Induction+of+VLDLy+Assembly+in+Egg-Laying+Hens.">Estrogen Induction of VLDLy Assembly in Egg-Laying Hens.</a> J Nutr. 129 (2), 467S-472S (1999).</li><li>Yoshizaki, N., Soga, M., Ito, Y., Mao, K. M., Sultana, F., Yonezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+consumption+of+yolk+granules+during+the+development+of+quail+embryos.">Two-step consumption of yolk granules during the development of quail embryos.</a> Dev Growth Differ. 46 (3), 229-238 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> alamarBlue Cell Viability Assay Protocol. , (2008).</li><li>Lin, H. Y., Chen, C. C., Chen, Y. J., Lin, Y. Y., Mersmann, H. J., Ding, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Amelioration+of+High-Fat+Diet-Induced+Fatty+Liver+by+Docosahexaenoic+Acid+and+Lysine+Supplementations.">Enhanced Amelioration of High-Fat Diet-Induced Fatty Liver by Docosahexaenoic Acid and Lysine Supplementations.</a> Biomed Res Int. 2014 (1), 310981 (2014).</li><li>Lin, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adiponectin+receptor+1+regulates+bone+formation+and+osteoblast+differentiation+by+GSK-3&#946;/&#946;-Catenin+signaling+in+mice.">Adiponectin receptor 1 regulates bone formation and osteoblast differentiation by GSK-3&#946;/&#946;-Catenin signaling in mice.</a> Bone. 64, 147-154 (2014).</li></ol>

Uma vez que o sistema de cultura anterior tem apenas um sucesso limitado, é necessário um sistema de cultura melhor. A endoderme codornizes YSM japonesa requer tratamento com enzimas proteolíticas tais como a colagenase para soltar as junções célula-célula para alcançar um melhor desempenho do crescimento nos explantes ex-vivo. Os nossos dados mostram que o número de células de tratamento digestão parcial foi maior do que a partir da cultura de tecido não digerido após a sementeira, durante 2 dias (...

O recurso principal nutricional do embrião aviário é gema, composto de 33% de lípidos, proteínas 17%, e 1% de cinzas. 1 durante o desenvolvimento embrionário, a membrana vitelina (YSM) cresce a partir de dentro da cavidade abdominal embrionário e cobre gradualmente a gema superfície. Começando no dia embrionário 2, a expressão de genes associados com o metabolismo dos lípidos e a angiogénese é gradualmente aumentada em YSM, e o YSM desenvolve lentamente projecções das vilosidades semelhantes. Estas projecções 8,9 aumentar a absorção de nutrientes gema para suportar o desenvolvimento embrionário. O YSM é um tecido extra-embrionário que contém três camadas germinativas, endoderme, mesoderme e ectoderme. 14 do ectoderma saco vitelino enfrenta a clara e links com a membrana vitelina para cobrir suavemente o saco vitelino. As células epiteliais da endoderme são confrontados diretamente para a gema de ovo e servir como portais de utilização de nutrientes. 6 À medida que a ADM se expande, células epiteliais endodérmico (EECS) pode ser dividido por shape e funcionalidade em dois grupos, a área vitelínicas e vasculosa área. 7 vitelina área é composta por células da endoderme e está distante do embrião; vasculosa área é composta por células mesodérmicas e cobre EECS diferenciadas com vasos sanguíneos e tecidos conjuntivos. Por dia embrionário 5, a gema é totalmente coberta por ectoderma e endoderma de YSM ea área vascular tem crescido rapidamente. O YSM absorve, recompõe e liberta lípidos (como-gema derivado lipoproteína de muito baixa densidade) e proteínas no sistema circulatório embrionário. 9, 2 Assim, foi estabelecido um embrionário sistema de codorniz japonesa primária endodérmica epitelial de cultura de células, para estudar os mecanismos de lípido utilização em YSM durante o desenvolvimento embrionário aviária. Os lípidos tais como triglicerídeos, lecitina, de fosfolípidos e ésteres de colesterol (CE) são as fontes de energia primárias para embriões de aves. Nas fases iniciais de desenvolvimento, lípidos da gema são Composed de apenas 1,3% do CE e ele sobe para 10-15% a meio do período de desenvolvimento embrionário aviária 3, 11. éster de colesterol é sintetizado a partir do colesterol, esteróis O-aciltransferase 1 (SOAT1) em YSM embrião aviária. 4 A forma de armazenamento de colesterol é CE, CE é realizada nas lipoproteínas e lipoproteínas são transportados pela circulação para os tecidos. 13 Uma semana antes escotilha há um crescimento rápido dos embriões de aves. Aproximadamente 68% do conteúdo de lípidos restantes na gema são absorvidos durante esta fase. 10 O mecanismo pelo qual a gema de lípidos são utilizados pode ser clarificada por um modelo de pesquisa CEE. Um protocolo de cultura de frango CEE foi estabelecido para atingir este objectivo de pesquisa. 2, 9 No entanto, devido à baixa taxa de sucesso de explantes de tecidos, um processo de cultura de células CEE melhorada é necessária para estudar a função de certas enzimas e proteínas na mediação de a utilização de nutrientes pelos embriões de aves durante o desenvolvimento.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="845">
	<tbody>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:331px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:199px;">Gibco by Life technologies</td>
			<td style="width:148px;">12800-017 10 X 1 L</td>
			<td style="width:167px;">For wash the EECs pellets</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:331px;">D-MEM/F-12</td>
			<td style="width:199px;">Gibco by Life technologies</td>
			<td style="width:148px;">12400-024 10 X 1 L</td>
			<td>As the basal medium in culturing EECs</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:331px;">NBCS</td>
			<td style="width:199px;">Gibco by Life technologies</td>
			<td style="width:148px;">16010-159</td>
			<td>As the supplyment serum in culturing EECs</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:331px;">Pen-Strep Ampho. Solution</td>
			<td style="width:199px;">BI (Biological Industries)</td>
			<td style="width:148px;">03-033-1B 100ml</td>
			<td>For attenuating the possible infection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:331px;">Collagenase Type IV</td>
			<td style="width:199px;">Gibco by Life technologies</td>
			<td style="width:148px;">17104-019 1g</td>
			<td>&#160;Collagenase is a protease with specificity for the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-XGly-Pro. As the protease for dissociation of cells from primary tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:331px;">24 well plate</td>
			<td style="width:199px;">FALCON&#174;</td>
			<td style="width:148px;">REF-353047</td>
			<td>For EECs to attach and extension</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:331px;">50 ML PP centrifuge tubes</td>
			<td style="width:199px;">Corning&#174; CentriStarTM</td>
			<td style="width:148px;">430829</td>
			<td>For transportion of membranes and enzyme digestion</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">50ML Conical bottomed Tube with Cap</td>
			<td style="width:199px;">PRO TECH</td>
			<td>CT-50-PL-TW</td>
			<td>For transportion of membranes and enzyme digestion</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">Reciprocal shaking bath</td>
			<td>DEAGLE</td>
			<td style="width:148px;">SB302</td>
			<td>For better enzymatic digestion on membranes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary endodermal epithelial cell culture from the yolk sac membrane of japanese quail embryos

Nós estabelecemos um modelo de cultura de células epiteliais endodérmico (CEE) para estudar a função de certas enzimas e proteínas na mediação de utilização de nutrientes por embriões de aves durante o desenvolvimento. Fertilizados ovos de codorniz Japonesa foram incubadas a 37 ° C durante 5 dias e, em seguida, yolk sac membranas (YSM) foram recolhidas para se estabelecer o sistema de cultura de CEE. Isolamos a camada endoderma embrionário de YSM, e cortado da membrana em 2 - 3 mm pedaços e parcialmente digerido com colagenase antes de semear em placas de cultura de 24 poços. O EECS proliferam para fora do tecido e estão prontos para os estudos de cultura de células. Descobrimos que o EECS tinha características típicas de YSM in vivo, por exemplo, acúmulo de gotículas lipídicas, expressão de esteróis O-aciltransferase e lipoproteína lipase. O tratamento a digestão parcial aumentou significativamente a taxa de sucesso da cultura CEE. Utilizando o EECS, foi demonstrado que a expressão de SOAT1 foi regulado pelo AMPc dproteína quinase ependent Um caminho relacionado. Este sistema de cultura de codorna japonesa CEE primária é uma ferramenta útil para estudar o transporte de lipídios embrionário e para esclarecer o papel de genes envolvidos na mediação de utilização de nutrientes em YSM durante o desenvolvimento embrionário aviária.

A fim de alcançar o objetivo de estabelecer um modelo de celular consistente e útil, nós precisamos de alargar e estabilizar a taxa de proliferação e desempenho dos EECS aviária. Comparamos a incubação directa da endoderme sem digestão com enzima endoderme parcialmente digerido com enzimas proteolíticas, tais como colagenase ou colagenase mais 0,6 L de dispase. Dispase é um amino-endopeptidase que hidrolisa as ligações peptidicas N-terminais de resíduos de aminoácidos não...

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Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

To study the mechanism of lipid utilization in yolk sac membranes during the late stages of avian embryonic development, we established a primary Japanese quail embryonic endodermal epithelial cell culture system.

Primária endodérmico epitelial Cultura de Células da gema Sac Membrana de japoneses codorniz Embriões

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Transferência de Gene eficiente em retinas pintainho para célula primária Estudos de Cultura: An<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Eletroporação Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Biologia do Desenvolvimento

Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells

Cultivar células primárias Nasal epiteliais de Crianças e reprogramar em células-tronco pluripotentes induzidas

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolamento e caracterização de células individuais de embriões Zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Produção em larga escala de cardiomiócitos a partir de células-tronco pluripotentes humanas utilizando um altamente reprodutível pequeno-Based Molecule Protocolo de Diferenciação

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

Afinidade Detecção de Etiquetagem endógena Receptores de embriões Zebrafish

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

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