Name: ex vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices
Uploaded: 2016-04-05T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices at JoVE.com

We thank Cora H&#252;bner and Andrea Gall for help in acquiring some of the representative results. This work was supported by the Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience (CIN) at the University of Tuebingen, an Excellence Initiative funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) within the framework of the Excellence Initiative (EXC 307), and by funds from the Charitable Hertie Foundation.

declaração de ética: Todos os procedimentos experimentais foram de acordo com a directiva da UE sobre a utilização de animais em pesquisa e foram aprovados pelo Animal Care local e Comitê de Uso (Regierungspräsidium Tuebingen, estado de Baden-Württemberg, Alemanha), responsável pela Universidade de Tübingen. 1. Processo de injeção estereotáxica <ol><li> Preparar as ferramentas estéreis (tesouras, bisturis, pinças, perfuração, agulhas, material de sutura), utilizando um esterilizador. Providenc...

<ol>
	<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2,+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel.">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models.">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nat Rev Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).</li><li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+neural+systems.">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).</li><li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections.">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 663-668 (2007).</li><li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain.">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li><li>Huang, Z. J., Zeng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+approaches+to+neural+circuits+in+the+mouse.">Genetic approaches to neural circuits in the mouse.</a> Annu Rev Neurosci. 36, 183-215 (2013).</li><li>LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emotion+circuits+in+the+brain.">Emotion circuits in the brain.</a> Annu Rev Neurosci. 23, 155-184 (2000).</li><li>Pape, H. C., Pare, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastic+synaptic+networks+of+the+amygdala+for+the+acquisition,+expression,+and+extinction+of+conditioned+fear.">Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear.</a> Physiol Rev. 90 (2), 419-463 (2010).</li><li>Myers, K. M., Davis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+fear+extinction.">Mechanisms of fear extinction.</a> Mol Psychiatry. 12 (2), 120-150 (2007).</li><li>Quirk, G. J., Mueller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+mechanisms+of+extinction+learning+and+retrieval.">Neural mechanisms of extinction learning and retrieval.</a> Neuropsychopharmacology. 33 (1), 56-72 (2008).</li><li>Vidal-Gonzalez, I., Vidal-Gonzalez, B., Rauch, S. L., Quirk, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microstimulation+reveals+opposing+influences+of+prelimbic+and+infralimbic+cortex+on+the+expression+of+conditioned+fear.">Microstimulation reveals opposing influences of prelimbic and infralimbic cortex on the expression of conditioned fear.</a> Learn Mem. 13 (6), 728-733 (2006).</li><li>Sierra-Mercado, D., Padilla-Coreano, N., Quirk, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociable+roles+of+prelimbic+and+infralimbic+cortices,+ventral+hippocampus,+and+basolateral+amygdala+in+the+expression+and+extinction+of+conditioned+fear.">Dissociable roles of prelimbic and infralimbic cortices, ventral hippocampus, and basolateral amygdala in the expression and extinction of conditioned fear.</a> Neuropsychopharmacology. 36 (2), 529-538 (2011).</li><li>Cho, J. H., Deisseroth, K., Bolshakov, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+encoding+of+fear+extinction+in+mPFC-amygdala+circuits.">Synaptic encoding of fear extinction in mPFC-amygdala circuits.</a> Neuron. 80 (6), 1491-1507 (2013).</li><li>Arruda-Carvalho, M., Clem, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway-Selective+Adjustment+of+Prefrontal-Amygdala+Transmission+during+Fear+Encoding.">Pathway-Selective Adjustment of Prefrontal-Amygdala Transmission during Fear Encoding.</a> J Neurosci. 34 (47), 15601-15609 (2014).</li><li>Hubner, C., Bosch, D., Gall, A., Luthi, A., Ehrlich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+dissection+of+optogenetically+activated+mPFC+and+hippocampal+inputs+to+neurons+in+the+basolateral+amygdala:+implications+for+fear+and+emotional+memory.">Ex vivo dissection of optogenetically activated mPFC and hippocampal inputs to neurons in the basolateral amygdala: implications for fear and emotional memory.</a> Front Behav Neurosci. 8, 64 (2014).</li><li>Strobel, C., Marek, R., Gooch, H. M., Sullivan, R. K., Sah, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+and+Auditory+Input+to+Intercalated+Neurons+of+the+Amygdala.">Prefrontal and Auditory Input to Intercalated Neurons of the Amygdala.</a> Cell Rep. 10 (9), 1435-1442 (2015).</li><li>Sigurdsson, T., Doyere, V., Cain, C. K., LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+potentiation+in+the+amygdala:+a+cellular+mechanism+of+fear+learning.">Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning.</a> Neuropharmacology. 52 (1), 215-227 (2007).</li><li>Ehrlich, I., Humeau, Y., Grenier, F., Ciocchi, S., Herry, C., Luthi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amygdala+inhibitory+circuits+and+the+control+of+fear+memory.">Amygdala inhibitory circuits and the control of fear memory.</a> Neuron. 62 (6), 757-771 (2009).</li><li>Millhouse, O. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intercalated+cells+of+the+amygdala.">The intercalated cells of the amygdala.</a> J Comp Neurol. 247 (2), 246-271 (1986).</li><li>Busti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+fear+states+engage+distinct+networks+within+the+intercalated+cell+clusters+of+the+amygdala.">Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala.</a> J Neurosci. 31 (13), 5131-5144 (2011).</li><li>Palomares-Castillo, E., Hernandez-Perez, O. R., Perez-Carrera, D., Crespo-Ramirez, M., Fuxe, K., Perez de la Mora, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intercalated+paracapsular+islands+as+a+module+for+integration+of+signals+regulating+anxiety+in+the+amygdala.">The intercalated paracapsular islands as a module for integration of signals regulating anxiety in the amygdala.</a> Brain Res. 1476, 211-234 (2012).</li><li>Asede, D., Bosch, D., Luthi, A., Ferraguti, F., Ehrlich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+inputs+to+intercalated+cells+provide+fear-learning+modulated+inhibition+to+the+basolateral+amygdala.">Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala.</a> Neuron. 86 (2), 541-554 (2015).</li><li>Tamamaki, N., Yanagawa, Y., Tomioka, R., Miyazaki, J., Obata, K., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+expression+and+colocalization+with+calretinin,+parvalbumin,+and+somatostatin+in+the+GAD67-GFP+knock-in+mouse.">Green fluorescent protein expression and colocalization with calretinin, parvalbumin, and somatostatin in the GAD67-GFP knock-in mouse.</a> J Comp Neurol. 467 (1), 60-79 (2003).</li><li>Mar, L., Yang, F. C., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+marking+and+characterization+of+Tac2-expressing+neurons+in+the+central+and+peripheral+nervous+system.">Genetic marking and characterization of Tac2-expressing neurons in the central and peripheral nervous system.</a> Mol Brain. 5, (2012).</li><li>Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Achieving+high-frequency+optical+control+of+synaptic+transmission.">Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission.</a> J Neurosci. 34 (22), 7704-7714 (2014).</li><li>Li, H., Penzo, M. A., Taniguchi, H., Kopec, C. D., Huang, Z. J., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+modification+of+a+central+amygdala+fear+circuit.">Experience-dependent modification of a central amygdala fear circuit.</a> Nat Neurosci. 16 (3), 332-339 (2013).</li><li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections.">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).</li><li>Felix-Ortiz, A. C., Beyeler, A., Seo, C., Leppla, C. A., Wildes, C. P., Tye, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLA+to+vHPC+inputs+modulate+anxiety-related+behaviors.">BLA to vHPC inputs modulate anxiety-related behaviors.</a> Neuron. 79 (4), 658-664 (2013).</li><li>Chu, H. Y., Ito, W., Li, J., Morozov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-specific+suppression+of+GABA+release+from+parvalbumin+interneurons+in+the+basolateral+amygdala+by+dopamine.">Target-specific suppression of GABA release from parvalbumin interneurons in the basolateral amygdala by dopamine.</a> J Neurosci. 32 (42), 14815-14820 (2012).</li><li>Zhang, Y. P., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+induction+of+synaptic+plasticity+using+a+light-sensitive+channel.">Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel.</a> Nat Methods. 4 (2), 139-141 (2007).</li><li>Britt, J. P., Benaliouad, F., McDevitt, R. A., Stuber, G. D., Wise, R. A., Bonci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+and+behavioral+profile+of+multiple+glutamatergic+inputs+to+the+nucleus+accumbens.">Synaptic and behavioral profile of multiple glutamatergic inputs to the nucleus accumbens.</a> Neuron. 76 (4), 790-803 (2012).</li><li>Kohl, M. M., Shipton, O. A., Deacon, R. M., Rawlins, J. N., Deisseroth, K., Paulsen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemisphere-specific+optogenetic+stimulation+reveals+left-right+asymmetry+of+hippocampal+plasticity.">Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity.</a> Nat Neurosci. 14 (11), 1413-1415 (2011).</li><li>Morozov, A., Sukato, D., Ito, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+suppression+of+plasticity+in+amygdala+inputs+from+temporal+association+cortex+by+the+external+capsule.">Selective suppression of plasticity in amygdala inputs from temporal association cortex by the external capsule.</a> J Neurosci. 31 (1), 339-345 (2011).</li><li>Davidson, B. L., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+delivery+to+the+nervous+system.">Viral vectors for gene delivery to the nervous system.</a> Nat Rev Neurosci. 4 (5), 353-364 (2003).</li><li>Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+transduction+efficiency,+tropism+and+axonal+transport+of+AAV+serotypes+1,+2,+5,+6,+8,+and+9+in+the+mouse+brain.">Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8, and 9 in the mouse brain.</a> PLoS One. 8 (9), (2013).</li><li>Salegio, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+adeno-associated+viral+vectors+is+serotype-dependent.">Axonal transport of adeno-associated viral vectors is serotype-dependent.</a> Gene Ther. 20 (3), 348-352 (2013).</li><li>Holehonnur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+viral+serotypes+produce+differing+titers+and+differentially+transduce+neurons+within+the+rat+basal+and+lateral+amygdala.">Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala.</a> BMC Neurosci. 15, (2014).</li><li>McFarland, N. R., Lee, J. S., Hyman, B. T., McLean, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+transduction+efficiency+of+recombinant+AAV+serotypes+1,+2,+5,+and+8+in+the+rat+nigrostriatal+system.">Comparison of transduction efficiency of recombinant AAV serotypes 1, 2, 5, and 8 in the rat nigrostriatal system.</a> J Neurochem. 109 (3), 838-845 (2009).</li><li>Miyashita, T., Shao, Y. R., Chung, J., Pourzia, O., Feldman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+channelrhodopsin-2+(ChR2)+expression+can+induce+abnormal+axonal+morphology+and+targeting+in+cerebral+cortex.">Long-term channelrhodopsin-2 (ChR2) expression can induce abnormal axonal morphology and targeting in cerebral cortex.</a> Front Neural Circuits. 7, (2013).</li></ol>

Este protocolo descreve um método para ex vivo investigação optogenetic dos circuitos neurais e conectividade local que pode ser facilmente implementados na maioria, se não todos, verticais fatia de gravação de patch-clamp setups, equipando-os com um ~ 470 LED no porto luz epifluorescência nm. Uma grande vantagem da estimulação optogenetic de projecções axonais em fatias é que ele permite a activação e a investigação das propriedades de ligações que não eram acessíveis com estimulação elé...

ferramentas precisas para visualização e ativação simultânea de conexões específicas entre áreas do cérebro e tipos específicos de neurônios estão se tornando mais importante para entender as conectividade funcional subjacentes função cerebral e doença estados saudáveis. Idealmente, isso implica investigação fisiológica das propriedades sinápticos precisos com que identificaram os neurônios se comunicam. Isto é particularmente verdadeiro para as ligações entre as áreas do cérebro que não podem ser conservados em uma única fatia cerebral aguda. No passado, isto foi largamente conseguido em experiências separadas. Por um lado, marcadores neurais injectados in vivo, foram empregues combinada com luz ou subsequente análise microscópica de electrões de parceiros de pré- e pós-sinápticos. Por outro lado, quando a partir de feixes de fibras da região de origem são preservados e acessíveis na preparação fatia, estimulação eléctrica tem sido utilizada para avaliar os mecanismos de comunicação com células sinápticas na região alvo. Com o advento de Optogenetics, a expressão específica de canais de catiões de luz fechado, tais como Channelrhodopsins (CHRS) fundida com proteínas fluorescentes, permite agora que a activação de neurónios e as suas trajectórias de axonais embora permitindo a sua visualização e post-hoc de análise anatómica 1- 4. Porque axônios ChR expressam pode ser estimulada mesmo quando separado do somata pai 5, é possível, em fatias de cérebro para: 1) avaliar entradas de regiões do cérebro que não eram acessíveis com estimulação elétrica convencional, porque tratos de fibras não são separáveis ​​ou a trajetória específica não é conhecida; 2) inequivocamente identificar a região de origem para entradas específicas que foram postuladas, mas incompletamente compreendida; e 3) investigar a conectividade funcional entre tipos celulares definidos, tanto a nível local e nas projeções de longo alcance. Devido a um certo número de vantagens, este mapeamento optogenetic de circuitos em fatias de cérebro tornou-se largamenteLY utilizado nos últimos anos e uma variedade de vectores virais para expressão de chrs marcadas com fluorescência estão prontamente disponíveis a partir de fornecedores comerciais. Algumas das principais vantagens da ativação optogenetic sobre estimulação elétrica convencional não são danos ao tecido devido à colocação de eletrodos de estimulação, a especificidade da estimulação da fibra, porque a estimulação elétrica pode também recrutar fibras de passagem ou outras células vizinhas, e um estímulo igualmente rápida e temporalmente preciso. Além disso, a injecção estereotáxica de vectores virais pode ser facilmente orientada para áreas específicas do cérebro 6 e expressão específica condicional ou tipo de célula pode ser conseguido usando expressão de Cre-dependente e / ou promotores específicos 7. Aqui, esta técnica é aplicada para o mapeamento de longo alcance e circuitos locais no sistema de medo. A amígdala é uma região-chave para a aquisição e expressão do medo, e armazenamento de medo e memórias emocionais 8,9. Além froestou a amígdala, o córtex pré-frontal medial (mPFC) e hipocampo (HC), estruturas que são mutuamente ligadas à amígdala, estão implicadas nos aspectos de aquisição, consolidação e recuperação de medo e extinção memórias 10,11. Actividade em subdivisões do mPFC parece desempenhar um papel duplo no controle de alta e baixa medo afirma 12,13. Isso pode em parte ser mediada por conexões diretas de mPFC para a amígdala que controlaria atividade da amígdala e saída. Por isso, nos últimos anos, vários estudos começaram em ex vivo experimentos fatia para investigar as interações sinápticas entre aferentes mPFC e células-alvo específicos na amígdala 14-17. Durante a aprendizagem medo, a informação sensorial sobre os estímulos condicionado e incondicionado atinge a amígdala através de projeções de regiões do tálamo e córtex específicos. Plasticidade destes insumos aos neurônios na parte lateral (LA) da basolamígdala ateral (BLA) é um importante mecanismo subjacente medo condicionado 9,18. Evidências crescentes sugerem que os processos de plástico paralelas na amígdala envolvem elementos inibitórios para controlar memória do medo 19. Um grupo de neurônios inibitórios em cluster são os GABAérgicos paracapsular intercalados células mediais (mpITCs), mas a sua conectividade e função precisa não é completamente compreendida 20-22. Aqui, o mapeamento do circuito optogenética é utilizado para avaliar aferentes e eferentes conectividade dessas células e seu impacto sobre os neurônios-alvo na amígdala, demonstrando que mpITCs recebe entrada sensorial direta de estações retransmissoras talâmicos e corticais 23. expressão específica do ChR em mpITCs ou neurônios BLA permite o mapeamento das interações locais, revelando que mpITCs inibir, mas também são mutuamente ativado por, BLA principais neurônios, colocando-os em circuitos inibitórios feed-forward e feedback novos que controlam eficazmente a atividade BLA23.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotactic frame</td>
			<td>Stoelting, USA</td>
			<td>51670</td>
			<td rowspan="2">can be replaced by other stereotactic frame for mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steretoxic frame mouse adaptor</td>
			<td>Stoelting, USA</td>
			<td>51625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas anesthesia mask for mice</td>
			<td>Stoelting, USA</td>
			<td>50264</td>
			<td>no longer available, replaced by item no. 51609M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure injection device, Toohey Spritzer</td>
			<td>Toohey Company, USA</td>
			<td>T25-2-900</td>
			<td>other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik Fill glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments, Germany</td>
			<td>1B150F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine, IsoFlo</td>
			<td>Eickemeyer, Germany</td>
			<td>213261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controler and heating pad</td>
			<td>FHC, USA</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal Micropipette Puller Model P-1000</td>
			<td>Sutter Instruments, USA</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75</td>
			<td>Melag, Germany</td>
			<td>08754200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9)</td>
			<td>Penn Vector Core, USA</td>
			<td>AV-9-26973P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9)&#160;</td>
			<td>Penn Vector Core, USA</td>
			<td>AV-9-20938M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1)&#160;</td>
			<td>Penn Vector Core, USA</td>
			<td>AV-1-20298P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fast green</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>0301.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml)</td>
			<td>CP Pharma, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antiseptic, Betadine (providone-iodine)</td>
			<td>Purdure Products, USA</td>
			<td>BSOL32</td>
			<td>can be replaced by other disinfectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam)</td>
			<td>Boehringer Ingelheim, Germany</td>
			<td></td>
			<td>can be replaced by other analgesics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bepanthen eye ointment</td>
			<td>Bayer, Germany</td>
			<td>0191</td>
			<td>can be replaced by other eye ointment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681)</td>
			<td>Nouvag, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutranox Suture Needle</td>
			<td>Fine Science Tools, Germany</td>
			<td>12050-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braided Silk Suture</td>
			<td>Fine Science Tools, Germany</td>
			<td>18020-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Recordings, light stimulation, and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>artificial cerebrospinal fluid (ACSF)</td>
			<td>for composition see references #16 and #23</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>internal patch solutions</td>
			<td>for composition see references #16 and #23</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagnesiumSulfate Heptahydrate</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>P027.1</td>
			<td>prepare 2M stock solution in purified water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slicer, Microm HM650V</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td>920120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling unit for tissue slicer, CU65</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td>770180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sapphire blade</td>
			<td>Delaware Diamond Knives</td>
			<td></td>
			<td>custom order, inquire with company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope, SZX2-RFA16</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492)</td>
			<td>Lumen Dynamics Group, Canada</td>
			<td>2012-12699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch microscope, BX51WI</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiclamp 700B patch amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitdata 1440A</td>
			<td>Molecular Devices, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PClamp software, Version 10</td>
			<td>Molecular Devices, USA</td>
			<td></td>
			<td>used to control data acquisition and stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath temperature controler, TC05</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann, Germany</td>
			<td>200-100 500 0145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three axis micromanipulator Mini 25</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann, Germany</td>
			<td>210-100 000 0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator controller SM7</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann, Germany</td>
			<td>200-100 900 7311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass capillaries for patch pipettes</td>
			<td>World Precision Instruments, Germany</td>
			<td>GB150F-8P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber&#160;</td>
			<td>Satorius Stedim Biotech, Germany</td>
			<td>13006--50----ACN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED unit, CoolLED pE</td>
			<td>CoolLED, UK</td>
			<td>244-1400</td>
			<td rowspan="4">CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolLED 100 Dual Adapt</td>
			<td>CoolLED, UK</td>
			<td>pE-ADAPTOR-50E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED unit, USL 70/470</td>
			<td>Rapp Optoelectronic</td>
			<td>L70-000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual port adapter</td>
			<td>Rapp Optoelectronic</td>
			<td>inquire with company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set red (excitation)</td>
			<td>AHF, Germany</td>
			<td>F49-560</td>
			<td rowspan="3">Filters can be bought as set F46-008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (beamsplitter)</td>
			<td>AHF, Germany</td>
			<td>F48-585</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (emission)</td>
			<td>AHF, Germany</td>
			<td>F47-630</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set green (excitation)</td>
			<td>AHF, Germany</td>
			<td>F39-472</td>
			<td rowspan="3">Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (beamsplitter)</td>
			<td>AHF, Germany</td>
			<td>F43-495W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (emission)</td>
			<td>AHF, Germany</td>
			<td>F76-490</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaserCheck, handheld power meter</td>
			<td>Coherent, USA</td>
			<td><a>1098293</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgorPro Software, Version 6</td>
			<td>Wavemetrics, USA</td>
			<td></td>
			<td rowspan="2">for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuromatic suite of macros for IgorPro</td>
			<td><a href="http://www.neuromatic.thinkrandom.com/">http://www.neuromatic.thinkrandom.com</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Post hoc analysis of injections and projections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde powder (PFA)</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>0335.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>N-21479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar-agar for embedding and resectioning</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>5210.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 x 10 mm petri dishes for embedding</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>alternatives can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides, Super Frost</td>
			<td>R. Langenbrinck, Germany</td>
			<td>61303802</td>
			<td>alternatives can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover slips</td>
			<td>R. Langenbrinck, Germany</td>
			<td>3000302</td>
			<td>alternatives can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vecta Shield mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories, USA</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>alternative mounting media can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation</td>
			<td>Satorius Stedim Biotech, Germany</td>
			<td>11406--25------N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices

optogenetic abordagens são agora amplamente utilizados para estudar a função de populações neurais e circuitos através da combinação de expressão de proteínas alvo activado por luz e subsequente manipulação da actividade neuronal pela luz. Channelrhodopsins (CHRS) são-canais de catiões de luz fechado e quando fundida com uma proteína fluorescente sua expressão permite a visualização e a activação simultânea de tipos específicos de células e as suas projecções axonais em áreas definidas do cérebro. Através de injecção estereotáxica de vectores virais, as proteínas de fusão CHR pode ser expresso constitutivamente ou condicionalmente em células específicas de uma região do cérebro definido, e as suas projecções axonais pode subsequentemente ser estudados anatomicamente e funcionalmente através da activação optogenetic ex vivo em fatias de cérebro. Isto é de particular importância quando se pretende entender propriedades sinápticas de ligações que não podem ser abordados com as abordagens de estimulação elétrica convencional, ou na identificação de romance affealuguel e conectividade eferente que anteriormente foi mal compreendida. Aqui, alguns exemplos ilustram como esta técnica pode ser aplicada para investigar estas perguntas para elucidar circuitos relacionados com o medo na amígdala. A amígdala é uma região-chave para a aquisição e expressão do medo, e armazenamento de medo e memórias emocionais. Muitas linhas de evidência sugerem que o córtex pré-frontal medial (mPFC) participa em diferentes aspectos da aquisição medo e extinção, mas a sua conectividade preciso com a amígdala está apenas começando a ser entendida. Em primeiro lugar, é mostrado como a activação ex vivo optogenetic pode ser usado para estudar os aspectos da comunicação sináptica entre os aferentes mPFC e células-alvo na amígdala basolateral (BLA). Além disso, está ilustrado que como esta abordagem ex vivo optogenetic podem ser aplicadas para avaliar novos padrões de conectividade utilizando um grupo de neurónios GABAérgicos na amígdala, o cluster paracapsular célula intercalada (mpITC), como um exemplo.

Esta seção mostra o fluxo de trabalho de uma abordagem ex vivo optogenética e resultados representativos de diferentes estratégias experimentais para investigar as propriedades fisiológicas das projeções sensoriais e moduladores de longo alcance para BLA e neurônios mpITC bem como propriedades de conectividade local entre mpITC e BLA. Após a injecção estereotáxica de o vector viral seleccionado nas coorden...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices at JoVE.com

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo optogenética Dissection de Circuitos medo no cérebro Slices

abordagens optogenética são amplamente utilizados para manipular a atividade neural e avaliar as consequências para o funcionamento do cérebro. Aqui, uma técnica que é descrita por expressão in vivo do activador channelrodopsina óptico, permite a análise ex vivo de propriedades sinápticos de longo alcance específico e conexões neurais locais em circuitos relacionados com o medo.

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Neuroimagem Funcional Usando rompimento da barreira hemato-encefálica ultra-sônico e Manganês-RM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Neurociência

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Cérebro Fatia Biotinilação: Uma<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Abordagem medir Região específicas do tráfego de proteínas de membrana plasmática em adultos Neurônios

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic estimulação do sistema nervoso central de roedores

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultâneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Teste Funcional de Dois retinas por<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Eletrorretinograma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Prepara frescas fatias da retina de adultos do Zebrafish para Ex Vivo experimentos de imagem

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Optogenetic de arrastamento de Theta Hippocampal oscilações em comportar-se ratos

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Uma abordagem alternativa para estudar eventos primários na neurodegeneração usando fatias de cérebro de rato Ex Vivo

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice

Manipulação optogenetic de circuitos neural durante a monitoração sono/Estados do wakefulness nos ratos

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

In vivo intracerebral injeções Estereotaxicas para estimulação Optogenética de entradas de longo alcance em fatias de cérebro de rato

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Avaliação da indução de depressão em longo prazo em fatias Cerebelares adultas

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...