Name: identification of kinesin-1 cargos using fluorescence microscopy
Uploaded: 2016-02-14T15:00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Roche's Publication Grant covered the Free Access publication and production of this article. The author also thanks E. Premkumar Reddy, Richard V. Mettus, Stephen C. Cosenza, Sau Ying Yip and Sol D. Gloria for their support and critical reading of the manuscript.

1. Kloning af tdTomato-mærkede vildtype og motorless KIF5B Proteiner <ol><li> Amplificere cDNA&#39;er for den humane vildtype- og motorless KIF5B proteiner under anvendelse af primerne i tabel 1, Taq-DNA-polymerase (5 enheder til 100 pi), dNTP-blanding (2 mM for hver deoxynukleotid) og dens 10X puffer i 30 cykler. Hver cyklus består af et denatureringstrin (95 ° C i 30 sek), et udglødningstrin (45 ° C i 30 sek) og en forlængelse trin (72 ° C i 3 minutter). </li><li> Ekstrahere det amplificerede DNA-produkt med tilsvarende volumen af ​​phenol / chloroform (1: 1). Bemærk: Phenol er brændbart og kan forårsage forbrændinger. Chloroform er farligt. Undgå direkte kontakt med dem og bruge dem under stinkskab. Alternativt kan PCR-produkter oprenses ved forskellige kits. <ol><li> Spin ved 18.000 xg i en mikrocentrifuge ved stuetemperatur i 1 min. Overfør den vandige opløsning til et nyt rør, og der ekstraheres med et tilsvarende volumen af ​​chloroform. </li><li> Spinved 18.000 x g i en mikrocentrifuge ved stuetemperatur i 0,5 min. Overfør den vandige opløsning til et nyt rør. </li><li> Bland den vandige opløsning med en tiendedel volumen 3 M Na-acetat og to volumener absolut ethanol. </li><li> Spin ved 18.000 xg i en mikrocentrifuge ved stuetemperatur i 5 min. Kassér den vandige opløsning. </li><li> Vask DNA-pelleten med to rumfang 75% ethanol. Kassér den vandige opløsning og lufttørre DNA pellet ved stuetemperatur i 5 min. Resuspender DNA pellet i 34 pi vand. </li></ol></li><li> Fordøje de amplificerede produkter i et endeligt volumen på 40 pi med restriktionsenzymerne Sall (10 enheder) og BamHI (10 enheder) og 4 pi deres 10X puffer ved 37 ° C i to timer. De nedbrudte produkter i en agarosegel (1,0% ved 100 V) indeholdende ethidiumbromid (0,2 ug / ml). Bemærk: Ethidiumbromid er en potent mutagen og kan optages gennem huden. Derfor er det vigtigt at undgå direkte eller indirekte kontakt wed ethidiumbromid. </li><li> Klip de korrekte bånd til rensning af søjler. Vej den agarosegel indeholdende DNA-fragmentet. Derefter opløses det i solubiliseringsbuffer (300 pi for 0,1 g) ved 37 ° C i omkring 20 min. </li><li> Tilsæt resulterende opløsning til en søjle og centrifugering i en mikrocentrifuge ved stuetemperatur i 5 sek. Kassér gennemløbet. </li><li> Kolonnen udvaskes med 0,5 ml solubiliseringsbuffer ved at gentage trin 1.5. Kolonnen udvaskes igen med 0,75 ml vaskepuffer ved at gentage trin 1.5. Spin søjlen i 2 min for at slippe af med resterende vaskebuffer. </li><li> Eluering af DNA-fragmentet med 50 pi vand ved at gentage trin 1.5. Bedømme koncentrationen af ​​DNA-fragmentet ved at køre en alikvot af den mod en DNA størrelse stigen på en agarosegel (1,0% ved 100 V) indeholdende ethidiumbromid (0,2 ug / ml). </li><li> Ligere de rensede produkter (ca. 100 ng) med ptdTomato-C1 vektor 17 (ca. 100 ng) tidligere fordøjet med the samme restriktionsenzymer i 10 pi ved anvendelse af T4 DNA-ligase (2.000 enheder) og 1 pi 10X ligeringsbuffer ved stuetemperatur i 16 timer. Bemærk: Den vildtype og motorless mutant indeholder aminosyrer fra 2 til 963 og 584 til 963 hhv. Tidligere blev en større motorless KIF5B mutant bruges til at identificere dens funktion 9. En mindre motorless KIF5B mutant blev brugt til de nuværende undersøgelser for at øge sin ekspressionsniveauerne. </li></ol> 2. immunfluorescensmikroskopi <ol><li> For levende-celle eller indirekte fluorescens billeddannelse med forstørrelse på eller under 40X, frø 0,2-0,3 millioner HeLa-celler i 1 ml komplet medium [Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) med 10% føtalt bovint serum (FBS)] i hver brønd på en seks-brønds plade. Vokse ved 37 ° C med 5% CO2. </li><li> For indirekte immunfluorescens undersøgelser med forstørrelser over 40X, vask dækglas (18 mm x 18 mm, 1,5 tykkelse) i absolut ethanol kortvarigt og air-tør dem ibrøndene i en seks-brønds plade, inde i en biosikkerhed kabinet for at undgå forurening. <ol><li> Seed 0,2-0,3 millioner celler i 1 ml komplet DMEM-medium i hver brønd på en seks-brønds plade. </li></ol></li><li> Fremstilling af transfektion Complex <ol><li> Den næste dag, inde i en biosikkerhed kabinet, fortyndes 0,6 ug (i alt) af ekspressionsplasmidet for tdTomato-mærkede vildtype eller motorless KIF5B i nærvær eller fravær af et ekspressionsplasmid til en last kandidat-protein (pTagCFP-c-MYC 5 ) med 0,1 ml transfektion medium i en 1,6 ml mikrocentrifugerør. Bemærk: Vektoren pTagCFP-c-myc udtrykker TagCFP-mærkede c-myc. </li><li> Tilføj 1,8 pi af transfektionsreagens til 0,1 ml transfektion medium i et andet 1,6 ml mikrocentrifugerør. Typisk forberede en master mix af fortyndet transfektionsreagens nok til 12 prøver. </li><li> Der inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur. </li><li> Tilsæt fortyndet 0,1 ml transfektionsreagens til de fortyndede 0,1 ml DNA&#39;er. mix indholdet ved at vende rørene. Spin rørene i 5 sek i en mikrocentrifuge. </li><li> Inkuber i 45 minutter ved stuetemperatur. </li></ol></li><li> Vask af celler <ol><li> Vask de podede celler tre gange med phosphatbufret saltvand (PBS) under inkubationsperioden for dannelsen af ​​transfektion kompleks. </li><li> Erstat mediet af de podede celler i hver brønd med 0,8 ml forvarmet transfektion medium. Retur pladerne til inkubatoren ved 37 ° C. </li></ol></li><li> Transfektion af celler <ol><li> Efter inkubering af 45 min, tilsæt 0,2 ml af DNA / transfektionsreagens kompleks (fremstillet i trin 2.3) dråbevis til hver brønd i pladen. </li><li> Rock 6 brønds plade forsigtigt i 5 sek, før de returneres til inkubatoren ved 37 ° C. </li><li> Efter 6-8 timer, erstatte mediet med det komplette DMEM-medium. </li></ol></li><li> Til Live-celle Fluorescens Imaging 18 <ol><li> Efter yderligere 16 timer inkubation at 37 ° C, tilsæt DNA interkalerende pletten Hoechst 33342 til mediet til en slutkoncentration på 1 uM. Bemærk: Hoechst 33342 er en celle-permeabelt, DNA indlejringsfarvestof at pletter cellekerner. </li><li> Inkuber de transficerede celler i 10 minutter i inkubatoren ved 37 ° C før undersøge dem til ekspression af fluorescerende proteiner ved fluorescensmikroskopi under anvendelse af et 40X objektiv. De filtersæt til DAPI, den fælles fiskeripolitik, FITC og Cy3 er (Ex350 nm / Em460 nm), (Ex436 nm / Em480 nm), (EX470 nm / Em525 nm) og (Ex545 nm / Em605 nm), hhv. Bemærk: Hvis baggrunden er høj på grund af autofluorescens af det komplette DMEM medium, medium uden phenolrødt anvendes. </li></ol></li></ol> 3. Ved indirekte immunofluorescens Studies <ol><li> Fremstilling af paraformaldehydopløsning <ol><li> Afvej paraformaldehyd pulver (4 g pr 100 ml PBS) og føje den til PBS. Bemærk: Paraformaldehyd er et brandfarligt fast stof og et potentielt kræft Hazard. Det irriterer øjnene, åndedrætsorganerne og huden. Derfor er det vigtigt at undgå kontakt med eller indånding af paraformaldehyd. </li><li> Tilføj NaOH til opløsningen (150 pi 10 N NaOH / 100 ml). </li><li> Opløsningen opbevares ved 37 til 42 ° C i 2-3 timer med lejlighedsvis omrystning. </li><li> Indstil pH til 7,0 ved tilsætning af iseddike til opløsningen (ca. 75 ul / 100 ml) efter paraformaldehyd pulveret er opløst. </li></ol></li><li> Targetproteiner Farvning <ol><li> Efter yderligere inkubation i 16 timer ved 37 ° C, vaskes de transficerede celler ved stuetemperatur en gang med PBS ved omrystning de seks-brønds plade i 5 sek. </li><li> Fikseres cellerne med 1 ml frisk fremstillet 4% paraformaldehyd-opløsning per brønd. Der inkuberes ved stuetemperatur i 30 min. </li><li> Vask cellerne med PBS gang ved omrystning i 5 sekunder den seks-brønds plade. Kassér løsningen. </li><li> Inkubér cellerne med 1 ml 0,1% Triton-X 100 (i PBS) ved stuetemperatur i 30 min. Den itergent Triton-X 100 vil permeabilize cellemembranen for at tillade adgang af antistoffer mod deres intracellulære mål. </li><li> Vask cellerne med PBS fire gange ved omrystning de seks-brønds plade i 5 sek hver gang. Kassér opløsningen efter hver vask. </li><li> Inkubér cellerne med 1 ml af primære antistoffer (c-MYC kanin-antistof eller p53 muse antistof; 0,1 ug / ml) i en 10% FBS i PBS-opløsning ved stuetemperatur ved vipning i 4 timer. </li><li> Vask med PBS fire gange ved omrystning de seks-brønds plade i 5 sek hver gang. Kassér opløsningen efter hver vask. </li><li> Inkuber med 1 ml fluorescerende farvestof-konjugeret sekundære antistoffer (Alexa Fluor 488-konjugeret anti-kanin eller anti-mus IgG antistof; 0,5 ug / ml) i 10% FBS i PBS ved stuetemperatur i mørke ved vipning i 2 timer. </li><li> Vask med PBS fire gange ved omrystning de seks-brønds plade i 5 sek hver gang. Kassér opløsningen efter hver vask. </li></ol></li><li> Nuklear Farvning og Montage <ol><li&gt; Inkubér cellerne med 1 ml DNA indlejringsfarvestof 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI; 0,5 ug / ml) i PBS ved stuetemperatur i mørke i 10 minutter. Fortsæt til trin 3.4, når ingen dækglas udnyttes. Bemærk: DAPI er en DNA indlejringsfarvestof at pletter cellekerner. </li><li> Påfør 10 pi monteringsløsning på hver objektglas. Monter hver dækglas over monteringsløsning på et objektglas. </li><li> Der inkuberes ved stuetemperatur i mørke natten over. </li><li> Seal kanter dækglasset med neglelak. Sted i mørke i et stinkskab natten over for at fjerne neglelak dampe. </li></ol></li><li> Fluorescens mikroskopi 19 <ol><li> Næste dag, undersøge cellerne ved fluorescensmikroskopi under anvendelse af et 40X objektiv. De filtersæt til DAPI, den fælles fiskeripolitik, FITC og Cy3 er (Ex350 nm / Em460 nm), (Ex436 nm / Em480 nm), (EX470 nm / Em525 nm) og (Ex545 nm / Em605 nm), hhv. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motors+in+neurons:+transport+mechanisms+and+roles+in+brain+function,+development,+and+disease.">Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease.</a> Neuron. 68, 610-638 (2010).</li><li>Yu, Y., Feng, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+kinesin+family+proteins+in+tumorigenesis+and+progression:+potential+biomarkers+and+molecular+targets+for+cancer+therapy.">The role of kinesin family proteins in tumorigenesis and progression: potential biomarkers and molecular targets for cancer therapy.</a> Cancer. 116, 5150-5160 (2010).</li><li>Verhey, K. J., Hammond, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+control:+regulation+of+kinesin+motors.">Traffic control: regulation of kinesin motors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 765-777 (2009).</li><li>Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+superfamily+motor+proteins+and+intracellular+transport.">Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 682-696 (2009).</li><li>Lee, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+c-MYC+by+Kinesin-1+for+proteasomal+degradation+in+the+cytoplasm.">Transport of c-MYC by Kinesin-1 for proteasomal degradation in the cytoplasm.</a> Biochim Biophys Acta. 1843, 2027-2036 (2014).</li><li>Bittins, C. M., Eichler, T. W., Hammer, J. A., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant-negative+myosin+Va+impairs+retrograde+but+not+anterograde+axonal+transport+of+large+dense+core+vesicles.">Dominant-negative myosin Va impairs retrograde but not anterograde axonal transport of large dense core vesicles.</a> Cell Mol Neurobiol. 30, 369-379 (2010).</li><li>Kimura, T., Watanabe, H., Iwamatsu, A., Kaibuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+and+CRMP-2+complex+is+transported+via+Kinesin-1.">Tubulin and CRMP-2 complex is transported via Kinesin-1.</a> J Neurochem. 93, 1371-1382 (2005).</li><li>Lindsay, A. J., McCaffrey, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Va+is+required+for+the+transport+of+fragile+X+mental+retardation+protein+(FMRP)+granules.">Myosin Va is required for the transport of fragile X mental retardation protein (FMRP) granules.</a> Biol Cell. 106, 57-71 (2014).</li><li>Rivera, J., Chu, P. J., Lewis, T. L., Arnold, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Kif5B+in+axonal+localization+of+Kv1+K(+)+channels.">The role of Kif5B in axonal localization of Kv1 K(+) channels.</a> Eur J Neurosci. 25, 136-146 (2007).</li><li>Roland, J. T., Kenworthy, A. K., Peranen, J., Caplan, S., Goldenring, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Vb+interacts+with+Rab8a+on+a+tubular+network+containing+EHD1+and+EHD3.">Myosin Vb interacts with Rab8a on a tubular network containing EHD1 and EHD3.</a> Mol Biol Cell. 18, 2828-2837 (2007).</li><li>Uchida, A., Alami, N. H., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+functional+coupling+of+kinesin-1A+and+dynein+motors+in+the+bidirectional+transport+of+neurofilaments.">Tight functional coupling of kinesin-1A and dynein motors in the bidirectional transport of neurofilaments.</a> Mol Biol Cell. 20, 4997-5006 (2009).</li><li>Zadeh, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kif5b+is+an+essential+forward+trafficking+motor+for+the+Kv1.5+cardiac+potassium+channel.">Kif5b is an essential forward trafficking motor for the Kv1.5 cardiac potassium channel.</a> J Physiol. 587, 4565-4574 (2009).</li><li>Su, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIF5B+promotes+the+forward+transport+and+axonal+function+of+the+voltage-gated+sodium+channel+Nav1.8.">KIF5B promotes the forward transport and axonal function of the voltage-gated sodium channel Nav1.8.</a> J Neurosci. 33, 17884-17896 (2013).</li><li>Lalioti, V. S., Vergarajauregui, S., Tsuchiya, Y., Hernandez-Tiedra, S., Sandoval, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daxx+functions+as+a+scaffold+of+a+protein+assembly+constituted+by+GLUT4,+JNK1+and+KIF5B.">Daxx functions as a scaffold of a protein assembly constituted by GLUT4, JNK1 and KIF5B.</a> . J Cell Physiol. 218, 416-426 (2009).</li><li>Cho, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+the+kinesin-binding+domain+of+RanBP2+to+KIF5B+and+KIF5C+determines+mitochondria+localization+and+function.">Association of the kinesin-binding domain of RanBP2 to KIF5B and KIF5C determines mitochondria localization and function.</a> Traffic. 8, 1722-1735 (2007).</li><li>Diefenbach, R. J., Diefenbach, E., Douglas, M. W., Cunningham, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+receptor,+p180,+interacts+with+kinesin+heavy+chain,+KIF5B.">The ribosome receptor, p180, interacts with kinesin heavy chain, KIF5B.</a> Biochem Biophys Res Commun. 319, 987-992 (2004).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).</li><li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+fluorescence+imaging.">Live-cell fluorescence imaging.</a> Methods Cell Biol. 114, 125-150 (2013).</li><li>Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014, (2014).</li><li>Hopkins, S. C., Vale, R. D., Kuntz, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+kinesin+activity+from+structure-based+computer+screening.">Inhibitors of kinesin activity from structure-based computer screening.</a> Biochemistry. 39, 2805-2814 (2000).</li><li>Zhang, Y., Xiong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+p53+ubiquitination+and+nuclear+export+by+MDM2+and+ARF.">Control of p53 ubiquitination and nuclear export by MDM2 and ARF.</a> Cell Growth Differ. 12, 175-186 (2001).</li><li>Michael, D., Oren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p53-Mdm2+module+and+the+ubiquitin+system.">The p53-Mdm2 module and the ubiquitin system.</a> Semin Cancer Biol. 13, 49-58 (2003).</li><li>Kneussel, M., Wagner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+motors+at+neuronal+synapses:+drivers+of+membrane+transport+and+actin+dynamics.">Myosin motors at neuronal synapses: drivers of membrane transport and actin dynamics.</a> Nat Rev Neurosci. 14, 233-247 (2013).</li><li>Maravillas-Montero, J. L., Santos-Argumedo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myosin+family:+unconventional+roles+of+actin-dependent+molecular+motors+in+immune+cells.">The myosin family: unconventional roles of actin-dependent molecular motors in immune cells.</a> J Leukoc Biol. 91, 35-46 (2012).</li></ol>

Gratis adgang offentliggørelse og produktion af denne artikel er betalt af Roche.

Den beskrevne fremgangsmåde anvender egenskaberne af motorless KIF5B mutant, som mangler evnen til at bevæge sig langs mikrotubuli, men bevarer evnen til at danne dimerer med vildtype KIF5B og derved tillade den tetramere protein til at interagere med de samme lastproteiner som vildtype KIF5B. Motorless KIF5B derfor virker som en dominerende negativ mutant og former mislocalized aggregater med sine laster. Denne metode har vist sig at identificere kinesin-1 fragt c-MYC (figur 1) 5. I denne artikel, blev den samme motorless KIF5B mutant bruges til at identificere p53 som en anden potentiel last af kinesin-1 (figur 2). Dette viser, at metoden er muligt at identificere andre laster af kinesin-1. Endvidere er specificiteten af mutanten tilvejebringes af manglende virkning af den mutante på den negative kontrol protein C-Fos (figur 3). I denne protokol, den tdTomato-mærkede vilde type eller motorless KIF5B protein co-udtrykkes med et andet fluorescerende protein-mærkede kandidat fragt protein. I dette tilfælde er live-cell fluorescensmikroskopi og billeddannelse udføres. Dannelsen af ​​aggregaterne kan spores ved time-lapse billeddannelse. Alternativt tdTomato-taggede protein udtrykt alene og kandidaten fragt protein ved dets fysiologiske niveauer visualiseres ved indirekte immunfluorescens mikroskopi under anvendelse af specifikke antistoffer. Den fluorescerende protein tdTomato er valgt for sin lysstyrke og fotostabilitet 17. Hvis baggrunden er høj på grund af autofluorescens af det komplette DMEM medium, medium uden phenolrødt anvendes. Den motorless KIF5B mutantformer dimerer med vildtype-KIF5B støkiometrisk. Derfor er det afgørende at udtrykke en tilstrækkelig mængde af motorless KIF5B mutant at danne dimerer med vildtype-modstykke til at inhibere dens funktion og til at danne aggregater. For at løse dette problem, optimering af expression af motorless mutanten er afgørende. Det opnås ved hjælp af en lille motorless mutant indeholdende dimeriseringsdomænet. Desuden optimering af den passende transfektionsreagens og protokollen er også nødvendig. Varigheden af ​​inkubationen af ​​HeLa-celler med DNA / transfektion reagens blev optimeret i HeLa-celler til ekspression af exogene proteiner og cellelevedygtighed. Inkubationen varighed kan være nødvendigt at være optimeret til andre cellelinjer. For forstørrelser mellem 4X til 40X, er der ingen dækning briller påkrævet. Celler kan direkte undersøges i brøndene. Derfor, i dette tilfælde protokollen er billig og praktisk. For forstørrelser over 40X dyrkes celler på dækglasset i brøndene, og efter farvning, er monteret på objektglas til undersøgelse under olie-nedsænkning mål. Observation af aggregater af den motorless KIF5B protein er begrænset af størrelsen af ​​cytoplasmaet. Det er let at detektereaggregater i mange pattedyrsceller. Imidlertid er det relativt svært at observere aggregater i neuronale celler, når salget af cytoplasmaet er lille omkring kernerne og i neuritter. Protokollen benyttes til at vise sammenhængen mellem KIF5B og dets last ud over den in vivo gær to-hybrid og biokemiske pull-down assays 13-16. Alle disse analyser bestemme foreningen under forskellige fysiske forhold og deres resultater kan supplere hinanden. Endvidere fordelen ved denne fluorescens assay i forhold til andre assays er, at det kan vise reguleringen af subcellulær lokalisering af laster ved KIF5B (figur 1 og 2). Protokollen er ikke begrænset til KIF5B og kan bruges til at identificere laster af andre motordrevne proteiner, såsom nogle andre kinesin motorer 3 og nogle af myosin motorerne 23,24 anvendt i intracellulær transport af laster 3. Disse motordrevne proteiner indeholder også motordrevne domæner bevægelse langs mikrotubuli til kinesin motorer og mikrofilamenter for myosin motorer og coiled-coil-segmenter til oligomerisering for. De fleste af dem danner homodimerer 3,23. Derfor kan en tilsvarende strategi anvendes på dem ved at skabe deres motorless dominerende negative mutanter for at identificere deres last.

Kinesin-1 er en motor protein, der medierer anterograd transport af sine laster 1,2. Det er en heterotetramer af de to underenheder af kinesin Light Chain 1 (KLC1) og to underenheder af kinesin tunge kæder (KHCs). KIF5B 1, en ​​KHC, indeholder en motor domæne ved N-terminalen, der hydrolyserer ATP og omdanner kemisk energi til mekanisk energi bevægelse langs mikrotubuli til. Dens C-terminale region indeholder dimeriseringsdomænet der interagerer med KLC1, der associerer med laster. Kinesin-1 transporterer ladninger såsom vesikler, organeller og mRNA&#39;er 3,4. For nylig KIF5B blev vist at transportere den nukleare transkriptionsfaktor c-MYC for proteosomal nedbrydning i cytoplasmaet 5. Tre metoder (kemisk inhibitor, siRNA / shRNA og dominant negativ mutant) blev anvendt til at inhibere kinesin-1 funktion. De alle aggregering af c-MYC i cytoplasmaet. For den sidste metode blev c-myc kun påvirket af den dominerende negative mutant af KIF5B, men ikke ved en anden beslægtet KIF5A motor protein, hvilket antyder, at mutanten ikke udøver generelle virkninger på de intracellulære komponenter (som mikrotubulus forstyrrelser) eller på protein aggregation. Den dominante negative mutant af KIF5B også påvirkede ikke anden transskriptionsfaktor, hvilket antyder, at det ikke udøver generelle virkninger på transkriptionsfaktorer. Tværtimod foreslog, at den dominerende negative mutant udøver særlige virkninger for sine laster. Anvendelsen af ​​dominante negative mutanter er almindeligt på området for motordrevne proteiner. Lignende motorless mutanter af kinesiner og myosiner blev anvendt tidligere. De blev hovedsageligt anvendt til at demonstrere effekten af mutanterne på de subcellulære lokaliseringer af deres last eller på cellulære funktioner 6-12. blev lagt mindre vægt på det rumlige forhold mellem mutanter og er berørt af dem laster. Men i nogle forekomster blev mutanterne observeret at co-lokalisere med deres cargos 6,10. Samspillet mellem KIF5B og dens tilknyttede proteiner er tidligere blevet bekræftet ved in vivo gær to-hybrid assay og biokemiske pull-down assays, såsom co-immunopræcipitation og in vitro pull-down assays 13-16. I denne artikel er en ekstra visuel metode ved hjælp af fluorescens mikroskopi beskrevet at identificere KIF5B fragt proteiner. Fremgangsmåden gør brug af en motorless KIF5B mutant, der fungerer som en dominant negativ mutant. Det aggregater i cytoplasmaet og inducerer sammenlægning af sine laster. Tagging af vildtype og motorless KIF5B mutant med det fluorescerende protein tdTomato 17 muliggør deres visualisering ved fluorescensmikroskopi. De taggede KIF5B proteiner kan co-udtrykkes med en kandidat-protein fusioneret til et andet fluorescerende protein med spektrale egenskaber separeres hensigtsmæssigt fra KIF5B tag. De mærkede proteiner observeres direkte i levende cellerunder fluorescensmikroskopi. Induktion af sammenlægning af kandidat protein ved motorless KIF5B mutant bekræfter, at kandidaten protein er en in vivo last af KIF5B. Endvidere kan tdTomato-mærkede KIF5B proteiner udtrykkes alene i cellerne for at studere deres virkninger på de endogene fragt proteiner. Senere bliver immunfluorescensmikroskopi udført, hvorved de transficerede celler fikseret og farvet med et specifikt antistof mod det endogene kandidat-proteinet, efterfulgt af en passende sekundært antistof konjugeret med et fluorescerende farvestof. I dette tilfælde er det endogene kandidat protein ved dets fysiologiske niveau undersøgt. Lignende motorless mutanter af andre motoriske proteiner kan være parat til at identificere deres last.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="620">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">absolute ethanol (200 proof)</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:113px;">BP2818</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Opti-MEM-I (transfection medium)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td align="right">51985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">formaldehyde, para</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O4042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton-X100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">6365787001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Taq DNA polymerase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td align="right">10342020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR Grade Nucleotide Mix (dNTP Mix)</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">12111424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-541A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GeneRuler 1 kb Plus DNA ladder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>SM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PureLink Quick Gel Extraction kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K210012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BamHI</td>
			<td>New England Biolab</td>
			<td>R0136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SalI</td>
			<td>New England Biolab</td>
			<td>R0138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA ligase&#160;</td>
			<td>New England Biolab</td>
			<td>M0202T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethidium bromide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td align="right">17898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">c-MYC rabbit antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td align="right">5606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">p53 mouse antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit IgG antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fluorescent microscope&#160;</td>
			<td colspan="2">Olympus IX71_Fluoview</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">computer software for imaging</td>
			<td>&#160;cellSens&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of kinesin-1 cargos using fluorescence microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

Eksogent udtrykte vildtype KIF5B optrådte homogent i cytoplasmaet, medens c-MYC optrådte hovedsagelig i kernen (figur 1A). Men den motorless KIF5B mutanten dannet aggregater i cytoplasmaet (figur 1A). Sammenlægning af motorless KIF5B inducerede sammenlægning af c-myc. Procentdelen af ​​celler, der udtrykker aggregeret TagCFP-mærkede c-myc i cellerne, der udtrykker vildtype-KIF5B var lav. Det var imidlertid signifikant højere, når det motorless KIF5B blev co-udtrykt (figur 1A). Den observerede co-lokalisering af mutant KIF5B med c-MYC (figur 1) antyder, at KIF5B regulerer den subcellulære lokalisering af c-myc og c-myc er en last af kinesin-1. Negative kontroller, hvor konstruktionerne blev udtrykt alene er medtaget i det nederste panel af figur 1A. Resultaterne viser, at der ikke var nogen signifikant gennemblødning af fluorescens i Emissionsfaktorn. Den motorless KIF5B inducerede også aggregering af det endogene c-MYC (figur 1B) og transkriptionsfaktoren p53 (figur 2), hvilket indikerer, at c-myc og p53 er både de laster af kinesin-1 og KIF5B regulerer den subcellulære lokalisering af begge endogene proteiner. Sammen med resultaterne, at kinesin-1 hæmmer rose bengal lacton (RBL) 20 inducerer dannelse af højmolekylære arter både c-myc og p53 5, p53 sandsynligvis en last af kinesin-1. Det er interessant at bemærke, at den nukleare transkriptionsfaktor p53, som c-myc, er også eksporteres fra kernen til cytoplasmaet for proteasomalaktivitet nedbrydning 21,22. Bevægelsen af transkriptionsfaktorer ved KIF5B synes at være specifik, fordi udtryk for motorless KIF5B mutanten ikke påvirkede subcellulære lokalisering c-Fos eller få det til at aggregere (figur 3). Ovenstående data viser, at method ansat i denne publikation giver mulighed for høj specificitet identifikation af kinesin-1 ladninger. En lignende strategi kan anvendes på andre motordrevne proteiner samt. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig1.jpg" /> Figur 1: Ekspression af motorless KIF5B mutanten inducerer c-MYC aggregering i cytoplasmaet (A) HeLa-celler blev transficeret med tdTomato-mærkede vildtype (WT) KIF5B (rød) og TagCFP-mærkede c-MYC (blå).. tdTomato-mærkede WT KIF5B optrådte hovedsagelig i cytoplasmaet, medens TagCFP-mærkede c-MYC optrådte hovedsagelig i kernen. Imidlertid tdTomato-mærkede motorless KIF5B mutant (rød) dannet filamentøse eller punktformig aggregater i cytoplasmaet. Ekspression af motorless KIF5B inducerede sammenlægning af c-myc. Mutanten KIF5B og c-MYC co-lokaliseret sammen (lyserød). Procentdele af celler (%) med angivelse aggregater af FFP-c-MYC (%) er vist. Resultaterne er vist sommiddel ± SD (n = 3). Negative kontroller med ekspression af tdTomato-mærkede KIF5B proteiner eller TagCFP-mærkede c-MYC sammen med tomme vektorer (V) er vist i det nederste panel. (B) Lignende resultater blev opnået med det endogene c-MYC (grøn) når tdTomato-mærkede WT eller motorless KIF5B proteiner (rød) blev udtrykt. Den tdTomato-mærkede motorless KIF5B mutant dannet aggregater i cytoplasmaet og aggregering af det endogene c-myc. Begge typer af aggregater co-lokaliseret sammen i cytoplasmaet (orange). Kernerne blev farvet med farvestoffet Hoechst 33342 eller DAPI. Scale bar; 20 pm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53632/53632fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig2.jpg" /> Figur 2: Ekspression af motorless KIF5B mutant inducerer endogen p53 sammenlægning i than cytoplasmaet. I HeLa-celler, eksogene tdTomato-mærkede vildtype (WT) KIF5B (rød) syntes hovedsagelig i cytoplasmaet, medens det endogene p53 (grøn) syntes hovedsagelig i kernen. I modsætning hertil tdTomato-mærkede motorless KIF5B mutant (rød) dannet aggregater i cytoplasmaet. Ekspression af motorless KIF5B inducerede aggregering af p53, hvilket resulterer i co-lokalisering af KIF5B og p53 i cytoplasmaet (gul). Eksperimentet blev udført tre gange. Kernerne blev farvet med farvestoffet DAPI. Scale bar; 20 pm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53632/53632fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig3.jpg" /> Figur 3:. Ekspression af motorless KIF5B mutanten ikke inducerer aggregation af c-Fos i cytoplasmaet tdTomato-mærkede vildtype (WT) KIF5B (rød) optrådtehovedsagelig i cytoplasmaet i HeLa-celler, mens EGFP-c-Fos (grøn) syntes hovedsagelig i kernen. Tværtimod den tdTomato-mærkede motorless KIF5B mutant (rød) dannet aggregater i cytoplasmaet. Ekspression af motorless KIF5B inducerede ikke aggregeringen af ​​c-Fos. Eksperimentet blev udført fire gange. Kernerne i cellerne blev farvet med farvestoffet DAPI. Scale bar; 20 pm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53632/53632fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> fælles reverse primer </td><td> 5&#39;-AGAGGATCCTTACACTTGTTTGCCTCCTC-3 &#39; </td></tr><tr><td> vildtype KIF5B fremadrettet primer </td><td> 5&#39;- AGAGTCGACGCGGACCTGGCCGAGTGCAACATCAAAGT-3 &#39; </td></tr><tr><td> motorless KIF5B fremadrettet primer </td><td> 5&#39;- AGAGTCGACGATGAAGAGTTCACTGTTGC-3 &#39; </td></tr></tbody></table>Tabel 1: Primer sekvenser til kloning af vildtype og motorless KIF5B proteiner.

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Her er en protokol forelægges identificere kinesin-1 ladninger. En motorless mutant af kinesin-1 tung kæde (KIF5B) aggregater i cytoplasmaet og inducerer sammenlægning af sine laster. Begge aggregater opdages under fluorescensmikroskopi. En lignende strategi kan anvendes til at identificere laster af andre motordrevne proteiner.

Identifikation af kinesin-1 Cargos Brug Fluorescens Microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Kvantitative levende celler fluorescens-mikroskopi Analyse af Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Fluorescens-mikroskopi Screening og næste generation sekventering: Nyttige værktøjer til identifikation af gener involveret i organel Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Kvantitativ analyse af Autophagy hjælp Advanced 3D fluorescensmikroskopi

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Hurtig analyse og udforskningen af ​​fluorescensmikroskopi Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analyse af Autophagy i<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Ved hjælp Sult Pads i kombination med Fluorescence Microscopy

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Visualisere Stromule Frekvens med Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

Funktionel billeddannelse af Viral transskription fabrikker ved hjælp af 3D Fluorescens mikroskopi

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...