Name: identification of kinesin-1 cargos using fluorescence microscopy
Uploaded: 2016-02-14T15:00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Roche's Publication Grant covered the Free Access publication and production of this article. The author also thanks E. Premkumar Reddy, Richard V. Mettus, Stephen C. Cosenza, Sau Ying Yip and Sol D. Gloria for their support and critical reading of the manuscript.

1. Kloning av tdTomato-merket Wild-type og motorless KIF5B Proteiner <ol><li> Amplifisere cDNA for human villtype og motorless KIF5B proteiner ved å bruke primerne i tabell 1, Taq DNA-polymerase (5 enheter for 100 ul), dNTP-blanding (2 mM for hver deoksynukleotid) og dens 10X buffer for 30 sykluser. Hver syklus består av et denatureringstrinn (95 ° C i 30 sek), et glødetrinn (45 ° C i 30 sek), og et forlengelsestrinn (72 ° C i 3 minutter). </li><li> Ekstraher det amplifiserte DNA-produkt med likt volum fenol / kloroform (1: 1). Merk: Fenol er brennbart og kan forårsake brannskader. Kloroform er farlig. Unngå direkte kontakt med dem og bruke dem under en kjemisk avtrekkshette. Alternativt kan PCR-produkter renses ved hjelp av forskjellige kits. <ol><li> Rotere ved 18 000 x g i en mikrosentrifuge ved romtemperatur i 1 min. Overfør den vandige løsning i et nytt rør og ekstrahere med et like stort volum kloroform. </li><li> Snurre rundtved 18.000 x g i en mikrosentrifuge ved romtemperatur i 0,5 min. Overfør den vandige løsning i et nytt rør. </li><li> Blande den vandige løsning med en tiendedel volum 3 M Na-acetat og to volumer absolutt etanol. </li><li> Rotere ved 18 000 x g i en mikrosentrifuge ved romtemperatur i 5 min. Kast den vandige oppløsning. </li><li> Vask den DNA-pelleten med to volum av 75% etanol. Kast den vandige løsning og lufttørker DNA-pelleten ved romtemperatur i 5 min. Resuspender pellet DNA i 34 pl vann. </li></ol></li><li> Fordøye amplifiserte produkter i et sluttvolum på 40 ul med restriksjonsenzymene Sall (10 enheter) og BamHI (10 enheter) og 4 pl av deres 10X buffer ved 37 ° C i to timer. Løse fordøyd produktene i en agarosegel (1,0% ved 100 V) inneholdende etidiumbromid (0,2 ug / ml). Merk: Etidiumbromid er en potent mutagen og kan tas opp gjennom huden. Derfor er det viktig å unngå direkte eller indirekte kontakt with etidiumbromid. </li><li> Kutt ut de riktige band for rensing av søyler. Veie agarosegel inneholdende DNA-fragmentet. Deretter oppløses den i oppløseliggjøring buffer (300 ul av 0,1 g) ved 37 ° C i ca 20 min. </li><li> Tilsett ført løsningen på en kolonne og spinn i en mikrosentrifuge ved romtemperatur i 5 sek. Kast gjennomstrømnings. </li><li> Vask kolonnen med 0,5 ml oppløsning buffer ved å gjenta trinn 1.5. Vask kolonnen på nytt med 0,75 ml vaskebuffer ved å gjenta trinn 1.5. Spinn kolonne for 2 min for å bli kvitt den gjenværende vaskebuffer. </li><li> Eluere DNA-fragmentet med 50 ul vann ved å gjenta trinn 1.5. Estimere konsentrasjonen av DNA-fragmentet ved å kjøre en alikvot av det mot en DNA-stige størrelse på en agarosegel (1,0% ved 100 V) inneholdende etidiumbromid (0,2 ug / ml). </li><li> Ligere de rensede produkt (ca. 100 ng) med den ptdTomato-C1-vektoren 17 (ca. 100 ng) på forhånd spaltet med the samme restriksjonsenzymene i 10 pl ved bruk av T4 DNA-ligase (2000 enheter) og 1 pl 10X ligeringsbuffer ved romtemperatur i 16 timer. Merk: villtype og mutant motorless inneholder aminosyrer fra 2 til 963 og 584-963, respektivt. Tidligere var en større motorless KIF5B mutanten anvendt for å identifisere dens funksjon ni. En mindre motorless KIF5B mutant ble anvendt for de foreliggende studier for å øke ekspresjonsnivåer. </li></ol> 2. immunfluorescens Mikroskopi <ol><li> For levende celle eller indirekte fluorescens avbildning med forstørrelse på eller under 40X, frø 0,2-0,3 millioner HeLa-celler i 1 ml fullstendig medium [Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) med 10% føtalt bovint serum (FBS)] i hver brønn av en seks-brønns plate. Vokse ved 37 ° C med 5% CO2. </li><li> For indirekte immunfluorescens studier med forstørrelser over 40X, vaske dekkglass (18 mm x 18 mm, 1,5 tykkelse) i absolutt etanol kort og luft-tørke dem ibrønnene i en seks-brønns plate, inne i et kabinett biosikkerhet for å unngå forurensning. <ol><li> Seed 0,2-0,3 millioner celler i 1 ml full DMEM-medium i hver brønn av en seks-brønns plate. </li></ol></li><li> Utarbeidelse av Transfeksjon Complex <ol><li> Den neste dag, inne i en biosikkerhet skap, fortynne 0,6 ug (totalt) av ekspresjonsplasmidet for tdTomato-merket villtype eller motorless KIF5B i nærvær eller fravær av et ekspresjonsplasmid for en last kandidat protein (pTagCFP-c-MYC 5 ) med 0,1 ml transfeksjon medium i et 1,6 ml mikrosentrifugerør. Merk: vektor pTagCFP-c-MYC uttrykker TagCFP-merket c-MYC. </li><li> Legg 1,8 mL av transfeksjon reagens til 0,1 ml transfeksjon medium i en annen 1,6 ml mikrosentrifugerør. Vanligvis forberede en mester blanding av fortynnet transfeksjon reagens nok for 12 prøver. </li><li> Inkuber i 5 min, ved romtemperatur. </li><li> Legg fortynnet 0,1 ml transfeksjon reagens utvannet 0,1 ml DNA. mix innholdet ved å snu rørene. Spinn rør i 5 sek i en mikro. </li><li> Inkuber i 45 min, ved romtemperatur. </li></ol></li><li> Vask av celler <ol><li> Vask seeded cellene tre ganger med fosfatbufret saltvann (PBS) under inkubasjonsperioden for dannelsen av komplekset transfeksjon. </li><li> Erstatte mediet av seeded cellene i hver brønn med 0,8 ml forvarmet medium transfeksjon. Gå tilbake platene til inkubatoren ved 37 ° C. </li></ol></li><li> Transfeksjon av celler <ol><li> Etter inkubering i 45 minutter, tilsett 0,2 ml av DNA / transfeksjon reagens-kompleks (fremstilt i trinn 2,3) tilsatt til hver brønn på platen. </li><li> Rock 6 brønners platen forsiktig i 5 sek, før de returneres til inkubatoren ved 37 ° C. </li><li> Etter 6-8 timer, erstatte mediet med komplett DMEM medium. </li></ol></li><li> For live-celle Fluorescens Imaging 18 <ol><li> Etter ytterligere 16 timer av inkubasjon ent 37 ° C, tilsett DNA-interkalerende flekken Hoechst 33342 til mediet til en sluttkonsentrasjon på 1 mM. Merk: Hoechst 33342 er en celle-permeabel, DNA-interkalerende fargestoff som farger cellekjerner. </li><li> Inkuber de transfekterte celler i 10 minutter i inkubator ved 37 ° C før undersøke dem for ekspresjon av fluorescerende proteiner ved fluorescerende mikroskopi ved hjelp av et 40X objektiv. Filtersett for DAPI, CFP, FITC og Cy3 er (Ex350 nm / Em460 nm), (Ex436 nm / Em480 nm), (Ex470 nm / Em525 nm) og (Ex545 nm / Em605 nm), henholdsvis. Merk: Hvis bakgrunnen er høy på grunn av auto-fluorescens av hele DMEM medium, er medium uten fenol rødt brukt. </li></ol></li></ol> 3. For indirekte immunfluorescens Studier <ol><li> Utarbeidelse av Paraformaldehyde Solution <ol><li> Vei Paraformaldehyde pulver (4 g per 100 ml PBS) og legge den til PBS. Merk: Paraformaldehyde er et brennbart fast stoff og en potensiell kreft Hazard. Det irriterer øynene, luftveiene og huden. Derfor er det viktig å unngå kontakt med eller innånding av paraformaldehyd. </li><li> Legg NaOH til løsningen (150 ul 10 N NaOH / 100 ml). </li><li> Hold oppløsningen ved 37 til 42 ° C i 2-3 timer med leilighetsvis rysting. </li><li> Juster pH til 7,0 ved tilsetning av iseddik til (ca. 75 mikroliter / 100 ml) oppløsningen etter at paraformaldehyd pulveret er oppløst. </li></ol></li><li> Target Proteiner Farging <ol><li> Etter ytterligere inkubering i 16 timer ved 37 ° C, vask de transfekterte cellene ved romtemperatur, en gang med PBS ved å svinge den seks-brønns plate i 5 sek. </li><li> Fest celler med 1 ml nylaget, 4% paraformaldehyde løsning per brønn. Inkuber ved romtemperatur i 30 min. </li><li> Vask cellene med PBS gang ved å svinge i 5 sek seks-brønns plate. Kast oppløsningen. </li><li> Cellene inkuberes med 1 ml 0,1% Triton-X-100 (i PBS) ved romtemperatur i 30 min. dETergent Triton-X-100 vil permeabilize cellemembranen for å tillate adgang av antistoffer til deres intracellulære mål. </li><li> Vask cellene med PBS fire ganger ved å svinge den seks-brønns plate i 5 sek hver gang. Kast oppløsningen etter hver vask. </li><li> Inkuber cellene med 1 ml av primære antistoffer (c-MYC kanin antistoff eller p53-mus antistoff; 0,1 ug / ml) i en 10% FBS i PBS-løsning ved romtemperatur med risting i 4 timer. </li><li> Vask med PBS fire ganger ved å svinge den seks-brønns plate i 5 sek hver gang. Kast oppløsningen etter hver vask. </li><li> Inkuber med 1 ml av fluorescerende fargestoff-konjugerte sekundære antistoffer (Alexa Fluor 488-konjugert anti-kanin eller anti-mus-IgG-antistoff; 0,5 ug / ml) i 10% FBS i PBS ved romtemperatur i mørket ved gynge i 2 timer. </li><li> Vask med PBS fire ganger ved å svinge den seks-brønns plate i 5 sek hver gang. Kast oppløsningen etter hver vask. </li></ol></li><li> Nuclear Farging og Montering <ol><li&gt; Inkuber cellene med 1 ml av DNA-interkalerende fargestoff 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI; 0,5 ug / ml) i PBS ved romtemperatur i mørke i 10 min. Gå videre til trinn 3.4 når ingen dekkglass blir utnyttet. Merk: DAPI er en DNA-interkalerende fargestoff som farger cellekjerner. </li><li> Påfør 10 mL av monteringsløsning på hver objektglass. Montere hver dekkglass over monteringsløsning på et objektglass. </li><li> Inkuber ved romtemperatur i mørket over natten. </li><li> Forsegle kantene på dekkglass med neglelakk. Sett i mørket inne i en avtrekkshette over natten for å fjerne neglelakk røyk. </li></ol></li><li> Fluorescensmikroskopi 19 <ol><li> Neste dag, undersøke cellene ved fluorescerende mikroskopi ved hjelp av en 40X objektiv. Filtersett for DAPI, CFP, FITC og Cy3 er (Ex350 nm / Em460 nm), (Ex436 nm / Em480 nm), (Ex470 nm / Em525 nm) og (Ex545 nm / Em605 nm), henholdsvis. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motors+in+neurons:+transport+mechanisms+and+roles+in+brain+function,+development,+and+disease.">Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease.</a> Neuron. 68, 610-638 (2010).</li><li>Yu, Y., Feng, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+kinesin+family+proteins+in+tumorigenesis+and+progression:+potential+biomarkers+and+molecular+targets+for+cancer+therapy.">The role of kinesin family proteins in tumorigenesis and progression: potential biomarkers and molecular targets for cancer therapy.</a> Cancer. 116, 5150-5160 (2010).</li><li>Verhey, K. J., Hammond, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+control:+regulation+of+kinesin+motors.">Traffic control: regulation of kinesin motors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 765-777 (2009).</li><li>Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+superfamily+motor+proteins+and+intracellular+transport.">Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 682-696 (2009).</li><li>Lee, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+c-MYC+by+Kinesin-1+for+proteasomal+degradation+in+the+cytoplasm.">Transport of c-MYC by Kinesin-1 for proteasomal degradation in the cytoplasm.</a> Biochim Biophys Acta. 1843, 2027-2036 (2014).</li><li>Bittins, C. M., Eichler, T. W., Hammer, J. A., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant-negative+myosin+Va+impairs+retrograde+but+not+anterograde+axonal+transport+of+large+dense+core+vesicles.">Dominant-negative myosin Va impairs retrograde but not anterograde axonal transport of large dense core vesicles.</a> Cell Mol Neurobiol. 30, 369-379 (2010).</li><li>Kimura, T., Watanabe, H., Iwamatsu, A., Kaibuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+and+CRMP-2+complex+is+transported+via+Kinesin-1.">Tubulin and CRMP-2 complex is transported via Kinesin-1.</a> J Neurochem. 93, 1371-1382 (2005).</li><li>Lindsay, A. J., McCaffrey, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Va+is+required+for+the+transport+of+fragile+X+mental+retardation+protein+(FMRP)+granules.">Myosin Va is required for the transport of fragile X mental retardation protein (FMRP) granules.</a> Biol Cell. 106, 57-71 (2014).</li><li>Rivera, J., Chu, P. J., Lewis, T. L., Arnold, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Kif5B+in+axonal+localization+of+Kv1+K(+)+channels.">The role of Kif5B in axonal localization of Kv1 K(+) channels.</a> Eur J Neurosci. 25, 136-146 (2007).</li><li>Roland, J. T., Kenworthy, A. K., Peranen, J., Caplan, S., Goldenring, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Vb+interacts+with+Rab8a+on+a+tubular+network+containing+EHD1+and+EHD3.">Myosin Vb interacts with Rab8a on a tubular network containing EHD1 and EHD3.</a> Mol Biol Cell. 18, 2828-2837 (2007).</li><li>Uchida, A., Alami, N. H., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+functional+coupling+of+kinesin-1A+and+dynein+motors+in+the+bidirectional+transport+of+neurofilaments.">Tight functional coupling of kinesin-1A and dynein motors in the bidirectional transport of neurofilaments.</a> Mol Biol Cell. 20, 4997-5006 (2009).</li><li>Zadeh, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kif5b+is+an+essential+forward+trafficking+motor+for+the+Kv1.5+cardiac+potassium+channel.">Kif5b is an essential forward trafficking motor for the Kv1.5 cardiac potassium channel.</a> J Physiol. 587, 4565-4574 (2009).</li><li>Su, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIF5B+promotes+the+forward+transport+and+axonal+function+of+the+voltage-gated+sodium+channel+Nav1.8.">KIF5B promotes the forward transport and axonal function of the voltage-gated sodium channel Nav1.8.</a> J Neurosci. 33, 17884-17896 (2013).</li><li>Lalioti, V. S., Vergarajauregui, S., Tsuchiya, Y., Hernandez-Tiedra, S., Sandoval, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daxx+functions+as+a+scaffold+of+a+protein+assembly+constituted+by+GLUT4,+JNK1+and+KIF5B.">Daxx functions as a scaffold of a protein assembly constituted by GLUT4, JNK1 and KIF5B.</a> . J Cell Physiol. 218, 416-426 (2009).</li><li>Cho, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+the+kinesin-binding+domain+of+RanBP2+to+KIF5B+and+KIF5C+determines+mitochondria+localization+and+function.">Association of the kinesin-binding domain of RanBP2 to KIF5B and KIF5C determines mitochondria localization and function.</a> Traffic. 8, 1722-1735 (2007).</li><li>Diefenbach, R. J., Diefenbach, E., Douglas, M. W., Cunningham, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+receptor,+p180,+interacts+with+kinesin+heavy+chain,+KIF5B.">The ribosome receptor, p180, interacts with kinesin heavy chain, KIF5B.</a> Biochem Biophys Res Commun. 319, 987-992 (2004).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).</li><li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+fluorescence+imaging.">Live-cell fluorescence imaging.</a> Methods Cell Biol. 114, 125-150 (2013).</li><li>Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014, (2014).</li><li>Hopkins, S. C., Vale, R. D., Kuntz, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+kinesin+activity+from+structure-based+computer+screening.">Inhibitors of kinesin activity from structure-based computer screening.</a> Biochemistry. 39, 2805-2814 (2000).</li><li>Zhang, Y., Xiong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+p53+ubiquitination+and+nuclear+export+by+MDM2+and+ARF.">Control of p53 ubiquitination and nuclear export by MDM2 and ARF.</a> Cell Growth Differ. 12, 175-186 (2001).</li><li>Michael, D., Oren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p53-Mdm2+module+and+the+ubiquitin+system.">The p53-Mdm2 module and the ubiquitin system.</a> Semin Cancer Biol. 13, 49-58 (2003).</li><li>Kneussel, M., Wagner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+motors+at+neuronal+synapses:+drivers+of+membrane+transport+and+actin+dynamics.">Myosin motors at neuronal synapses: drivers of membrane transport and actin dynamics.</a> Nat Rev Neurosci. 14, 233-247 (2013).</li><li>Maravillas-Montero, J. L., Santos-Argumedo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myosin+family:+unconventional+roles+of+actin-dependent+molecular+motors+in+immune+cells.">The myosin family: unconventional roles of actin-dependent molecular motors in immune cells.</a> J Leukoc Biol. 91, 35-46 (2012).</li></ol>

Free Access publisering og produksjon av denne artikkelen er betalt av Roche.

Den metode som er beskrevet utnytter egenskapene til motorless KIF5B mutant som mangler evnen til å bevege seg langs mikrotubuli, men har beholdt evnen til å danne dimerer med vill-type KIF5B og derved tillate det tetramere protein til å samhandle med de samme cargoproteiner som villtype KIF5B. Motorless KIF5B derfor virker som en dominant negativ mutant og danner mislocalized aggregater med dets last. Denne metoden har vist seg å identifisere den kinesin-en last c-MYC (figur 1) 5. I denne artikkelen ble den samme motorless KIF5B mutant som brukes til å identifisere p53 som en annen potensiell last av kinesin-1 (figur 2). Dette viser at metoden er mulig å identifisere andre laster av kinesin-1. Videre blir spesifisiteten av mutant gitt ved mangel på virkning av mutanten på den negative kontroll proteinet c-Fos (figur 3). I denne protokollen, tdTomato-merket vill-type eller motorless KIF5B protein koekspresjon med en annen fluorescerende protein-merket kandidat last protein. I dette tilfelle blir levende celle fluorescens mikroskopi og avbildning utført. Dannelsen av aggregatene kan spores ved time-lapse imaging. Alternativt blir tdTomato-merkede protein uttrykt alene og kandidat lasten proteinet ved dets fysiologiske nivåer er anskueliggjort ved indirekte immunfluorescens-mikroskopi ved hjelp av spesifikke antistoffer. Den fluorescerende protein tdTomato er valgt for sin lysstyrke og fotostabilitet 17. Hvis bakgrunnen er høy på grunn av auto-fluorescens av hele DMEM medium, er medium uten fenol rødt brukt. Den motorless KIF5B mutant danner dimerer med villtype KIF5B støkiometrisk. Derfor er det viktig å uttrykke tilstrekkelig mengde av motorless KIF5B mutant for å danne dimerer med villtype-motstykke for å hemme dets funksjon og å danne aggregater. For å løse dette problemet, optimalisering av expression av motorless mutant er avgjørende. Det oppnås ved hjelp av en liten motorless-mutant inneholdende det dimeriseringen domene. I tillegg, optimalisering av det passende reagens transfeksjon og protokollen er også nødvendig. Varigheten av inkubasjon av HeLa-celler med DNA / transfeksjon reagens ble optimalisert i HeLa-celler for ekspresjon av eksogene proteiner og cellelevedyktighet. Inkubasjonen varighet kan måtte bli optimalisert for andre cellelinjer. For forstørrelser mellom 4X til 40X, ingen dekkglass nødvendig. Celler kan være direkte undersøkt i brønnene. Derfor, i dette tilfellet, er protokollen billig og praktisk. For forstørrelser over 40X, blir cellene dyrket på dekkglass i brønnene, og etter farging, er montert på objektglass for undersøkelse under olje-immersion mål. Observasjon av aggregater av motorless KIF5B proteinet er begrenset av størrelsen av cytoplasma. Det er lett å detektereaggregater i mange pattedyrceller. Imidlertid er det relativt vanskelig å observere aggregatene i neuronale celler når volumet av cytoplasma er liten rundt kjernene og i neuritter. Protokollen som anvendes for å vise sammenhengen mellom KIF5B og dens last i tillegg til in vivo gjær to-hybrid og biokjemiske pull-down-analyser 13-16. Alle disse analysene bestemme foreningen under ulike fysiske forhold og deres resultater kan utfylle hverandre. Videre er fordelen med denne fluorescens-analyse i forhold til andre analyser er at det kan vises til regulering av subcellulære lokalisering av last ved KIF5B (Figur 1 og 2). Protokollen er ikke begrenset til KIF5B og kan brukes til å identifisere laster med andre motorproteiner, så som noen andre kinesin motorer 3 og noen av myosin motorer 23,24 som brukes i intracellulær transport av last 3. Disse motor proteiner inneholder også motor domener for bevegelse langs mikrotubuli for kinesin motorer og microfilaments for myosin motorer og coiled-spole segmenter for oligomeriseringsprosessen. De fleste av dem danner homodimerer 3,23. Derfor kan en lignende strategi brukes på dem ved å lage sine motorless dominerende negative mutanter å identifisere sine laster.

Kinesin-1 er en motor protein som medierer antero transport av dens last 1,2. Det er en heterotetramer av de to subenheter av kinesin Lys Chain 1 (KLC1) og to subenheter av kinesin tunge kjeder (KHCs). KIF5B 1, en ​​KHC, inneholder en motor domene ved dets N-terminal, som hydrolyserer ATP og omdanner kjemisk energi til mekanisk energi for bevegelse langs mikrotubuli. Dens C-terminal regionen inneholder dimerization domene som samhandler med KLC1, som assosierer med last. Kinesin-1 transporterer last som blemmer, organeller og mRNA 3,4. Nylig KIF5B ble vist å transportere atomtranskripsjonsfaktor c-MYC for proteosomal nedbrytning i cytoplasma 5. Tre metoder (kjemisk inhibitor, siRNA / shRNA og dominant negativ mutant) ble anvendt for å hemme kinesin-1 funksjon. De induserte aggregasjon av c-myc i cytoplasma. For den siste metoden, ble c-MYC bare påvirket av den dominerende negative mutant av KIF5B, men ikke ved den annen beslektet KIF5A motor protein, noe som tyder på at det mutante ikke utøver generelle effekter på de intracellulære komponentene (som mikrotubul avbrudd) eller på proteinaggregering. Den dominant negativ mutant av KIF5B heller ikke påvirke en annen transkripsjonsfaktor, noe som tyder på at det ikke utøver generelle effekter for transkripsjonsfaktorer. Snarere tyder det på at den dominerende negative mutant utøver spesifikke effekter på sine laster. Bruken av dominerende negative mutanter som er vanlig på området motor proteiner. Lignende motorless mutanter av kinesins og myosins ble brukt tidligere. De ble i hovedsak brukt til å demonstrere effekten av mutanter på subcellulære lokaliseringer av sine laster eller om cellulære funksjoner 6-12. Mindre vekt ble lagt på romlige forholdet mellom mutanter og last påvirket av dem. Men i noen tilfeller, ble mutantene observert å co-lokalisere med sine cargos 6,10. Samspillet mellom KIF5B og dens tilknyttede proteiner som tidligere ble bekreftet ved in vivo-gjær to-hybrid-analyse og biokjemiske pull-down-analyser slik som co-immunoutfelling og in vitro-pull-down-analyser 13-16. I denne artikkelen er en visuell metode med fluorescens mikroskopi beskrevet å identifisere KIF5B cargoproteiner. Fremgangsmåten gjør bruk av en motorless KIF5B mutant som fungerer som en dominant negativ mutant. Den samler i cytoplasma og induserer aggregering av sine laster. Merking av villtype og motorless KIF5B mutant med fluorescerende protein tdTomato 17 gjør sin visualisering av fluorescens mikroskopi. De merkede KIF5B proteiner kan være co-uttrykkes med en kandidat protein smeltet til en annen fluorescerende protein med spektrale egenskaper passende skilt fra KIF5B tag. De merkede proteiner er observert direkte i levende cellerhenhold fluorescens mikroskopi. Induksjon av aggregering av kandidaten protein av motorless KIF5B mutant vil bekrefte at kandidaten protein er en in vivo last med KIF5B. Videre kan tdTomato-merkede KIF5B proteinene uttrykkes alene i cellene for å studere deres virkninger på de endogene cargoproteiner. Senere blir immunofluorescens-mikroskopi gjennomført hvor de transfekterte cellene blir fiksert og farget med et spesifikt antistoff mot endogene kandidatprotein, etterfulgt av et passende sekundært antistoff konjugert til et fluorescerende fargestoff. I dette tilfellet er den endogene kandidaten proteinet ved dens fysiologisk nivå studert. Lignende motorless mutanter av andre motorproteiner kan være forberedt på å identifisere sine laster.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="620">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">absolute ethanol (200 proof)</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:113px;">BP2818</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Opti-MEM-I (transfection medium)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td align="right">51985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">formaldehyde, para</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O4042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton-X100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">6365787001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Taq DNA polymerase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td align="right">10342020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR Grade Nucleotide Mix (dNTP Mix)</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">12111424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-541A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GeneRuler 1 kb Plus DNA ladder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>SM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PureLink Quick Gel Extraction kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K210012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BamHI</td>
			<td>New England Biolab</td>
			<td>R0136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SalI</td>
			<td>New England Biolab</td>
			<td>R0138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA ligase&#160;</td>
			<td>New England Biolab</td>
			<td>M0202T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethidium bromide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td align="right">17898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">c-MYC rabbit antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td align="right">5606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">p53 mouse antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit IgG antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fluorescent microscope&#160;</td>
			<td colspan="2">Olympus IX71_Fluoview</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">computer software for imaging</td>
			<td>&#160;cellSens&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of kinesin-1 cargos using fluorescence microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

Eksogent uttrykte villtype KIF5B først homogent i cytoplasma, mens c-myc først hovedsakelig i kjernen (figur 1A). Men motorless KIF5B mutant dannet aggregater i cytoplasma (figur 1A). Aggregering av motorless KIF5B indusert aggregering av c-MYC. Prosentandelen av celler som uttrykker aggregert TagCFP-merket c-MYC i cellene som uttrykker vill-type KIF5B var lav. Det var imidlertid signifikant høyere når motorless KIF5B ble ko-uttrykt (figur 1A). Den observerte ko-lokalisering av mutant KIF5B med c-MYC (figur 1) antyder at KIF5B regulerer den subcellulære lokalisering av c-myc og c-MYC er en last på kinesin-1. Negative kontroller der konstruksjonene ble uttrykt alene er inkludert i den nedre platen i figur 1A. Resultatene viser at det var ingen signifikant utfallende gjennomgang av fluorescens emission. Den motorless KIF5B også indusert aggregering av endogent c-MYC (figur 1B) og transkripsjonsfaktor p53 (figur 2), som indikerer at c-MYC og p53 er begge de laster med kinesin-en og KIF5B regulerer subcellulære lokalisering av både endogene proteiner. Sammen med resultatene at kinesin-1 inhibitor rose bengal lakton (RBL) 20 induserer dannelsen av molekylvekt arter høye for både c-MYC og p53 5, er p53 trolig en last med kinesin-en. Det er interessant å merke seg at den kjernefysiske transkripsjonsfaktor p53, som c-MYC, er også eksportert fra kjernen til cytoplasma for proteasomal degradering 21,22. Bevegelsen av transkripsjonsfaktorer ved KIF5B synes å være spesifikk, fordi ekspresjon av motorless KIF5B mutanten ikke påvirke den subcellulære lokalisering c-Fos eller få den til å aggregere (figur 3). De ovenfor angitte data viser at method ansatt i denne publikasjonen gir mulighet for høy spesifisitet identifisering av kinesin-1 last. En lignende strategi kan anvendes på andre motor proteiner i tillegg. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig1.jpg" /> Figur 1: Ekspresjon av motorless KIF5B mutant induserer c-MYC aggregering i cytoplasma (A) HeLa-celler ble transfektert med tdTomato-merket villtype (WT) KIF5B (rød) og TagCFP-merket c-MYC (blå).. tdTomato-merket WT KIF5B dukket hovedsakelig i cytoplasma, mens TagCFP-merket c-MYC dukket hovedsakelig i kjernen. Men tdTomato-merket motorless KIF5B mutant (rød) dannet trådformede eller punctate aggregater i cytoplasma. Uttrykk for motorless KIF5B indusert aggregering av c-MYC. Mutant KIF5B og c-MYC samlokalisert sammen (rosa). Prosentvise celler (%) indikerer aggregater av CFP-c-MYC (%) er vist. Resultatene er vist sommiddelverdi ± SD (N = 3). Negative kontroller med ekspresjon av tdTomato-merkede KIF5B proteiner eller TagCFP-merket c-MYC sammen med tomme svektorer (V) er vist i det nedre panel. (B) Lignende resultater ble oppnådd med endogent c-MYC (grønn) når tdTomato-merket WT eller motorless KIF5B proteiner (rød) ble uttrykt. Den tdTomato-merket motorless KIF5B mutant dannet aggregater i cytoplasma og indusert aggregering av den endogene c-MYC. Begge typer tilslag samlokalisert sammen i cytoplasma (oransje). Kjernene ble farget med fargestoff Hoechst 33342 eller DAPI. Scale bar; 20 mikrometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53632/53632fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig2.jpg" /> Figur 2: Uttrykk for den motorless KIF5B mutant induserer endogen p53 aggregering than cytoplasma. I HeLa-celler, eksogent tdTomato-merket villtype (WT) KIF5B (rød) først hovedsakelig i cytoplasma, mens den endogen p53 (grønn) først hovedsakelig i kjernen. I motsetning til dette tdTomato-merkede motorless KIF5B mutant (rød) som dannes aggregater i cytoplasma. Ekspresjon av motorless KIF5B indusert aggregering av p53, som resulterer i den ko-lokalisering av KIF5B og p53 i cytoplasma (gul). Eksperimentet ble gjennomført tre ganger. Kjernene ble farget med fargestoff DAPI. Scale bar; 20 mikrometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53632/53632fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig3.jpg" /> Figur 3:. Uttrykk for den motorless KIF5B mutant induserer ikke aggregering av c-Fos i cytoplasma tdTomato-merket villtype (WT) KIF5B (rød) dukkethovedsakelig i cytoplasma av HeLa-celler, mens EGFP-c-Fos (grønn) først hovedsakelig i kjernen. Tvert imot, det tdTomato-merkede motorless KIF5B mutant (rød) som dannes aggregater i cytoplasma. Uttrykk for motorless KIF5B fremkalte ikke aggregering av c-Fos. Eksperimentet ble gjennomført fire ganger. Kjerner av cellene ble merket med fargestoff DAPI. Scale bar; 20 mikrometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53632/53632fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> felles revers primer </td><td> 5&#39;-AGAGGATCCTTACACTTGTTTGCCTCCTC-3 &#39; </td></tr><tr><td> villtype KIF5B fremover primer </td><td> 5&#39;- AGAGTCGACGCGGACCTGGCCGAGTGCAACATCAAAGT-3 &#39; </td></tr><tr><td> motorless KIF5B fremover primer </td><td> 5&#39;- AGAGTCGACGATGAAGAGTTCACTGTTGC-3 &#39; </td></tr></tbody></table>Tabell 1: Primer sekvenser for kloning av villtype og motorless KIF5B proteiner.

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Her blir en protokoll presentert for å identifisere kinesin-1 last. En motorless mutant av kinesin-en tung kjede (KIF5B) aggregater i cytoplasma og induserer aggregering av sine laster. Begge aggregatene blir oppdaget etter fluorescens mikroskopi. En lignende strategi kan bli anvendt for å identifisere laster med andre motor proteiner.

Identifisering av kinesin-en Cargos Bruke Fluorescensmikroskopi

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Kvantitative Live-Cell fluorescens-mikroskopi Analyse av Fission gjær

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Fluorescens-mikroskopi Screening og neste generasjons sekvensering: Nyttige verktøy for identifikasjon av gener involvert i Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Kvantitativ analyse av Autophagy med Avansert 3D fluorescens mikroskopi

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Rapid Analyse og Utforskning av fluorescens mikros Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analyse av Autophagy i<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Ved hjelp av Sult Pads i kombinasjon med Fluorescensmikroskopi

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Visualisering Stromule Frequency med Fluorescensmikroskopi

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

Funksjonell Imaging av Viral transkripsjon fabrikker bruker 3D fluorescens mikroskopi

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...