Name: improving 2d and 3d skin in vitro models using macromolecular crowding
Uploaded: 2016-08-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding at JoVE.com

This work was supported by the Biomedical Research Council, Singapore through core support to the Institute of Medical Biology and grant SPF2013/005. M.R. was supported by a NUS Faculty Research Committee Grant (Engineering in Medicine) (M.R.) R-397-000-081-112, and the NUS Tissue Engineering Program (NUSTEP). The authors would like to thank Professor Irene Leigh for providing the collagen VII antibody. Electron microscopy work was carried out at the National University of Singapore Electron Microscopy Unit.

1. Macromolecular צפיפות תא תרבויות עור 2D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 50,000 תאים (פיברובלסטים ראשוניים או קרטינוציטים ראשוניים או שיתוף תרבות של פיברובלסטים ראשוני קרטינוציטים) לכל גם צלחת 24 באר. תאי זרע ב 1 מיליליטר של תקשורת צמיחת סוג התא המקבילה. </li>...

<ol>
	<li>Breitkreutz, D., Mirancea, N., Nischt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membranes+in+skin:+unique+structures+with+diverse+functions.">Basement membranes in skin: unique structures with diverse functions.</a> Histochem Cell Biol. 132 (1), 1-10 (2009).</li><li>Lane, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mutation+in+the+conserved+helix+termination+peptide+of+keratin+5+in+hereditary+skin+blistering.">mutation in the conserved helix termination peptide of keratin 5 in hereditary skin blistering.</a> Nature. 356 (6366), 244-246 (1992).</li><li>Fuchs, E., Raghavan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+under+the+skin+of+epidermal+morphogenesis.">Getting under the skin of epidermal morphogenesis.</a> Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).</li><li>Niessen, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junctions/adherens+junctions:+basic+structure+and+function.">Tight junctions/adherens junctions: basic structure and function.</a> J Invest Dermatol. 127 (11), 2525-2532 (2007).</li><li>Jarvelainen, H., Sainio, A., Koulu, M., Wight, T. N., Penttinen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+molecules:+potential+targets+in+pharmacotherapy.">Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy.</a> Pharmacol Rev. 61 (2), 198-223 (2009).</li><li>Schaefer, L., Schaefer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteoglycans:+from+structural+compounds+to+signaling+molecules.">Proteoglycans: from structural compounds to signaling molecules.</a> Cell Tissue Res. 339 (1), 237-246 (2010).</li><li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> J Cell Sci. 123 (Pt 24), 4195-4200 (2010).</li><li>Ghalbzouri, A., Jonkman, M., Dijkman, R., Ponec, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membrane+reconstruction+in+human+skin+equivalents+is+regulated+by+fibroblasts+and/or+exogenously+activated+keratinocytes.">Basement membrane reconstruction in human skin equivalents is regulated by fibroblasts and/or exogenously activated keratinocytes.</a> J Invest Dermatol. 124 (1), 79-86 (2005).</li><li>Lareu, R. R., Arsianti, I., Harve, K. S., Peng, Y. X., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Enhancement+of+Collagen+Matrix+Formation+and+Crosslinking+for+Applications+in+Tissue+Engineering--a+Preliminary+Study.">In Vitro Enhancement of Collagen Matrix Formation and Crosslinking for Applications in Tissue Engineering--a Preliminary Study.</a> Tiss Eng. 13 (2), 385-391 (2007).</li><li>Lareu, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+matrix+deposition+is+dramatically+enhanced+in+vitro+when+crowded+with+charged+macromolecules:+the+biological+relevance+of+the+excluded+volume+effect.">Collagen matrix deposition is dramatically enhanced in vitro when crowded with charged macromolecules: the biological relevance of the excluded volume effect.</a> FEBS Lett. 581 (14), 2709-2714 (2007).</li><li>Lareu, R. R., Harve, K. S., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emulating+a+crowded+intracellular+environment+in+vitro.+dramatically+improves+RT-PCR+performance.">Emulating a crowded intracellular environment in vitro. dramatically improves RT-PCR performance.</a> Biophys Biochem Res Comm. 363 (1), 171-177 (2007).</li><li>Harve, K. S., Ramakrishnan, V., Rajagopalan, R., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+crowding+in+vitro+as+means+of+emulating+cellular+interiors:+when+less+might+be+more.">Macromolecular crowding in vitro as means of emulating cellular interiors: when less might be more.</a> Proc Natl Acad USA Sci. 105 (51), E119 (2008).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Scar-in-a-Jar:+Studying+antifibrotic+lead+compounds+from+the+epigenetic+to+extracellular+level+in+a+single+well.">The Scar-in-a-Jar: Studying antifibrotic lead compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well.</a> Br J Pharmacol. 158 (5), 1196-1209 (2009).</li><li>Harve, K. S., Lareu, R., Rajagopalan, R., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+how+the+crowded+interior+of+cells+stabilizes+DNA/DNA+and+DNA/RNA+hybrids-in+silico+predictions+and+in+vitro+evidence.">Understanding how the crowded interior of cells stabilizes DNA/DNA and DNA/RNA hybrids-in silico predictions and in vitro evidence.</a> Nucleic Acids Res. 38 (1), 172-181 (2009).</li><li>Satyam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+crowding+meets+tissue+engineering+by+self-assembly:+A+paradigm+shift+in+regenerative+medicine.">Macromolecular crowding meets tissue engineering by self-assembly: A paradigm shift in regenerative medicine.</a> Adv Mat. 26 (19), 3024-3034 (2014).</li><li>Chen, C. Z. C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+macromolecular+crowding+to+enhance+extracellular+matrix+deposition+and+its+remodeling+in+vitro+for+tissue+engineering+and+cell-based+therapies.">Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies.</a> Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 277-290 (2011).</li><li>Rashid, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+use+for+Polyvinylpyrrolidone+as+a+Macromolecular+Crowder+for+Enhanced+Extracellular+Matrix+Deposition+and+Cell+Proliferation.">Novel use for Polyvinylpyrrolidone as a Macromolecular Crowder for Enhanced Extracellular Matrix Deposition and Cell Proliferation.</a> Tiss Eng C. , (2014).</li><li>Dewavrin, J. Y., Hamzavi, N., Shim, V. P. W., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+the+Architecture+of+3D+Collagen+Hydrogels+by+Physiological+Macromolecular+Crowding.">Tuning the Architecture of 3D Collagen Hydrogels by Physiological Macromolecular Crowding.</a> Acta Biomaterialia. 10 (10), 4351-4359 (2014).</li><li>Dewavrin, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+Rate+Boosting+of+Collagen+Fibrillogenesis+in+Heterogeneous+Mixtures+of+Crowding+Agents.">Synergistic Rate Boosting of Collagen Fibrillogenesis in Heterogeneous Mixtures of Crowding Agents.</a> J Phys Chem B. 119 (12), 4350-4358 (2015).</li><li>Auger, F. A., Berthod, F., Moulin, V., Pouliot, R., Germain, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineered+skin+substitutes:+from+in+vitro+constructs+to+in+vivo+applications.">Tissue engineered skin substitutes: from in vitro constructs to in vivo applications.</a> Biotechnol Appl Biochem. 39, 263 (2004).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+crowding+effect+on+cartilaginous+matrix+production:+a+comparison+of+two-dimensional+and+three-dimensional+models.">Macromolecular crowding effect on cartilaginous matrix production: a comparison of two-dimensional and three-dimensional models.</a> Tiss Eng Part C Methods. 19 (8), 586-595 (2013).</li><li>Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., van Vliet, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+crowding+directs+extracellular+matrix+organization+and+mesenchymal+stem+cell+behavior.">Macromolecular crowding directs extracellular matrix organization and mesenchymal stem cell behavior.</a> PLOS One. 7 (5), e37904 (2012).</li><li>Kumar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecularly+crowded+in+vitro+microenvironments+accelerate+the+production+of+extracellular+matrix-rich+supramolecular+assemblies.">Macromolecularly crowded in vitro microenvironments accelerate the production of extracellular matrix-rich supramolecular assemblies.</a> Scientific Reports. 5, 8729 (2015).</li><li>Ang, X. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+crowding+amplifies+adipogenesis+of+human+bone+marrow-derived+MSCs+by+enhancing+the+pro-adipogenic+microenvironment.">Macromolecular crowding amplifies adipogenesis of human bone marrow-derived MSCs by enhancing the pro-adipogenic microenvironment.</a> Tiss Eng Part A. 20 (5-6), 966-981 (2014).</li><li>Peng, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Fibroblast+Matrices+Bioassembled+Under+Macromolecular+Crowding+Support+Stable+Propagation+Of+Human+Embryonic+Stem+Cells.">Human Fibroblast Matrices Bioassembled Under Macromolecular Crowding Support Stable Propagation Of Human Embryonic Stem Cells.</a> J Tiss Eng Regen Med. 6 (10), e74-e84 (2012).</li><li>Benny, P., Badowski, C., Lane, E. B., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+More+Matrix:+Enhancing+the+deposition+of+dermal-epidermal+junction+components+in+vitro+and+accelerating+organotypic+skin+culture+development,+using+macromolecular+crowding.">Making More Matrix: Enhancing the deposition of dermal-epidermal junction components in vitro and accelerating organotypic skin culture development, using macromolecular crowding.</a> Tiss Eng A. 21 (1-2), 182-192 (2015).</li></ol>

Enhanced extracellular matrix is obtained upon introduction of macromolecular crowders to cell culture, owing to the excluded volume effect which increases the propeptide cleavage by proteinases. This results in extracellular matrix, in particular collagen, to be processed faster and deposited on the culture surface. While other groups have obtained thick fibroblast cell layers, it involved a culture time of several weeks20. In contrast, MMC described in this Protocol, dramatically shortens the culture time wh...

העור מהווה מחסום הגנה באמצעות מניעת אובדן מים וכניסה הפתוגן. הוא מורכב משלושה חלקים עיקריים; הדרמיס העשיר סטרומה 1, האפידרמיס מרובדת 2,3,4 על גבי זה, לבין צומת דרמו-אפידרמיס בין 5,6. הדרמיס מורכב ברובו קולגן וסיבים אלסטיים מאוכלס בדלילות עם 7 פיברובלסטים. לעומת זאת, האפידרמיס עשיר התא מורכב משכבות מרובות של קרטינוציטים. קרטינוציטים של השכבה הפנימית-ביותר הם שגשוג ולספק תאי הבזליים חדשים אשר לחדש ולהחליף סופני הבחנה קרטינוציטים כי כל זמן לנוע על השכבה הכי החיצונית של העור ואבדו הגרעינים שלהם וחומר cytoplasmic, וכתוצאה מכך שכבת cornified אשר עוברת קלוף. צומת עורי-אפידרמיס, סוג מסוים של קרום במרתף, הוא מבנה מורכב מורכב ממולקולות מטריקס מקשרות, אשר tetheRS האפידרמיס אל הדרמיס. סיבי קולגן I של הדרמיס לשזור עם VII קולגן עיגון סיבים מעוגנים אל Densa lamina העשיר קולגן IV. חוטים עיגון (laminin 5, י&quot;ז קולגן integrins) בתורו לחבר את Densa lamina עם hemidesmosomes של קרטינוציטים הבזליים. קרטינוציטים בסל (basale שכבה) יש את היכולת להתרבות ולחדש, כמו גם להבדיל לרבד כדי ליצור את שכבות suprabasal; השכבה spinosum, שכבת granulosum, ולבסוף השכבה קרנית, אשר מייצג את שטח המגע של העור עם הסביבה. מסלול צמוד משכבת ​​הבסיס לשכבת cornified, קרטינוציטים לעבור דפוסי ביטוי של cytokeratins ולבסוף עוברים אפופטוזיס ו לשים בארגז עצמם cornified מעטפות, קליפות של חלבונים ספציפיים crosslinked קוולנטית ידי פעילות transglutaminase. יצירה מחדש עור שכבותיו במבחנה, לרבות המבנים המורכבים של<html> עורי-אפידרמיס צומת מטריקס עורי, וכדי לחקות את תהליך cornification, יש ארוך מסוקרן מדענים ביו-מהנדסים כמו משימה מאתגרת. הייתה התקדמות משמעותית הנדסת רקמות עור, למשל, החילוץ המוצלח של תאי עור מפני ביופסיות חולות לבין הדור של תרבויות העור organotypic באמצעות תאי עור נגזרות חולים 8. עם זאת, בעיות לא פתורות להישאר הנוגעים הפרשת העניים של חלבונים תאי מטריקס ידי תאי העור עצמם וכתוצאה מכך מודלים העור תת אופטימלית. יתר על כן, את הזמן דרוש כדי ליצור עור 3D organotypic שיתוף תרבות תוך שימוש בפרוטוקולים נוכחיים נע בין ארבעה עד שמונה שבועות, פרק זמן אשר עלול להתקצר עם השילוב של crowders macromolecular. הפחתת זמן תרבות חוסך עלויות מגיב, מפחית את שכיחות הזדקנות התא ומפחית את זמן ההמתנה של החולה צריך המוצר לשמש במרפאה. t &quot;&gt; Macromolecular מצטופפים (MMC) כרוך החדרת מקרומולקולות ספציפי עד בינוני התרבות כדי ליצור אפקטים נפח נשלל. אלה להשפיע על שיעורי התגובה האנזימטית כולל מחשוף פרוטאוליטים של procollagen שהוא מפגר בתנאים תרבות מימית תקן 9-13. תחת MMC, תגובות אנזימטיות הם מהרו מבלי להגדיל את כמות ריאגנטים 14,15 וכתוצאה מכך, במקרה של מחשוף procollagen, בסכום של קולגן גדל לי מולקולות בתרבויות צפופות בהשוואה לקבוצת ביקורת צפופה 10. כפי ההמרה של procollagen לקולגן מאפשר ההיווצרות של קולגן מכלולים, פיברובלסטים תרבותיים עם MMC במשך 48 שעות ניב משמעותי יותר קולגן אני לעומת תרבויות פיברובלסטים צפופות במעקב במשך עד ארבעה שבועות 11,16,17. מלבד השפעות על פעילות אנזימטית המשפיעה על ההיווצרות, ייצוב ועיצוב מחדש של ECM, MMC גם הוכח כדי לשפר ולווסת ישירות קולגןהיווצרות סיבים 18,19. אנו מציגים כאן שיטה כדי לשפר את תאי מטריקס (ECM) הייצור על ידי תאי העור, בפרט, פיברובלסטים עורי קרטינוציטים אפידרמיס. בנוסף, אנו מראים כי ECM מועשר מיוצר תחת MMC בתרבויות בשכבה ניתן decellularized ושימש מטריקס תאים שמקורם טהור (CDM). אנו משתמשים בגישה בלתי קונבנציונלית כדי לחזות להעריך במלואה את ECM שהופקד על ידי תאי עור תרבותיים עם MMC. השתקפות מיקרוסקופיה הפרעות בדרך כלל משמשת ללימוד אינטראקציות מטריקס תא או תא אל זכוכית נקודות מגע. טכניקה זו נוצלה במערכת שלנו כדי להציג את הסכום הכולל של מטריקס שהופקד על משטח הזכוכית. השתקפות מיקרוסקופיה הפרעות לוותה immunostaining ניאון כדי להשיג תוצאות מקסימאליות כמות המידע מבחינת הרכב תאי מטריקס דפוס, בנוכחות והיעדר MMC. Organotypiג העור שיתוף תרבויות היא שיטה קלאסית מודל העור במבחנה בהקשר תלת ממדי. בעוד דו ממדי שיתוף תרבויות עשויות לספק מידע משמעותי, היא מוגבלת כאשר תרגום הנתונים הללו וליישם אותו בחזרה לסביבה in vivo, שמטבעו אינו מבנה תלת-ממדי. קרטינוציטים עור, בפרט, הם מקוטבים ומכילים קטעי apical ואת הבסיס שחיוניים הומאוסטזיס ודבקות תא. בנוסף, ביטוי של חלבונים suprabasal טיפוסי קרטינוציטים מעל שכבת הבסיס, כגון קרטין 1, קרטין 10 ו filaggrin קיים רק במהלך ריבוד והבחנה הטרמינל של קרטינוציטים. כמו בידול הטרמינל כמעט בהווה בתרבויות בשכבה טיפוסית, ביטוי חלבון suprabasal הוא בדרך כלל לא מושג במערכת התרבות הזאת. לכן, תרבויות organotypic מתחילות שקועות בינוני תרבות, אבל אז הם הרימו על ידי יצירת ממשק אוויר נוזלי לנהוג keratinocytבידול דואר. התוצאה היא ביטוי של סמנים ריבוד, אפילו cornification ו השתקפות בדרך כלל גבוהה יותר של הפיזיולוגיה אפידרמיס. בעוד קבוצות אחרות בעבר יצרו שיתוף תרבויות עור organotypic בהצלחה, הקמת אזור צומת דרמו-אפידרמיס תפקודית כבר בעיה. כאן, אנו מציגים שיטה חדשה culturing עור organotypic שיתוף תרבויות עם קרום במרתף משופר, בתוך מסגרת זמן מרוכזת ללא התפשרות על הבגרות בין שני המושגים הללו. זה יספק mimetics העור עבור מודלים במבחנה, בחקר הביולוגיה העור וכן מבחר של מבחני המיון.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1154">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:181px;">Wako</td>
			<td style="width:175px;">013-12061</td>
			<td style="width:499px;">Cell culture media additive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture inserts&#160; (6-well format)</td>
			<td style="width:181px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:175px;">657610</td>
			<td>Organotypic cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Citrate solution</td>
			<td style="width:181px;">Dako</td>
			<td style="width:175px;">S2369</td>
			<td style="width:499px;">DakoCytomation Target Retrieval Solution Citrate, pH 6 (x10)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Collagen (rat tail)</td>
			<td style="width:181px;">Corning</td>
			<td style="width:175px;">354236</td>
			<td>Organotypic cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">CnT-57&#160;</td>
			<td style="width:181px;">CELLnTEC</td>
			<td style="width:175px;">CnT-57</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">DAB Substrate + chromogen kit</td>
			<td style="width:181px;">Dako</td>
			<td style="width:175px;">K3468</td>
			<td>Histology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Deep-well plate (6-well format)</td>
			<td style="width:181px;">Corning</td>
			<td style="width:175px;">355467</td>
			<td>Organotypic cultures</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">ECL detection reagent</td>
			<td style="width:181px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:175px;">RPN2106</td>
			<td>Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Electron microscope (TEM)</td>
			<td>&#160;JEOL&#160;</td>
			<td>&#160;JEM-1010 (100kV)</td>
			<td>Transmission electron microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Fibroblast media (FM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>High Glucose-DMEM + 10% Fetal Bovine Serum + 1% Penicillin Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Ficoll PM70</td>
			<td style="width:181px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:175px;">17-0310-05</td>
			<td>Macromolecular crowder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Ficoll PM400</td>
			<td style="width:181px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:175px;">17-0300-05</td>
			<td>Macromolecular crowder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Keratinocyte serum-free media (KSFM)</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:175px;">17005-042</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Lysis buffer</td>
			<td style="width:181px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">89900</td>
			<td style="width:499px;">Lysis buffer for protein extraction. A protease inhibitor (Roche, #11836170001) was added to this lysis buffer.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Microscope</td>
			<td style="width:181px;">Zeiss</td>
			<td style="width:175px;">LSM510</td>
			<td style="width:499px;">Red, green and blue channels to visualize AF594, AF488 and DAPI fluorescent immunostainings (40X mag).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Mounting media (Hydromount)</td>
			<td style="width:181px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:175px;">HS-106</td>
			<td>Fluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Mounting media (Cytoseal)</td>
			<td style="width:181px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">8310-16</td>
			<td>Histology (HRP)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">OCT compound (Tissue Tek)</td>
			<td style="width:181px;">Sakura</td>
			<td style="width:175px;">4583</td>
			<td>Embedding for cryotomy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Penicillin-streptomycin antibiotics</td>
			<td style="width:181px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">A5955</td>
			<td>Cell culture media additive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Primary antibodies</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-Collagen I antibody</td>
			<td style="width:181px;">Abcam</td>
			<td style="width:175px;">#ab6308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-Collagen Type IV</td>
			<td style="width:181px;">Novocastra</td>
			<td style="width:175px;">#NCL-COLL-IV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-collagen VII</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>LH7.2 (in house)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-Fibronectin antibody</td>
			<td style="width:181px;">Abcam</td>
			<td style="width:175px;">#ab2413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Reducing agent&#160;</td>
			<td style="width:181px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">NP0009</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Sample buffer</td>
			<td style="width:181px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">NP0008</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Secondary antibodies (Immunostaining)</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td style="width:181px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">#D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">AlexaFluor 594 goat-anti-rabbit</td>
			<td style="width:181px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">#A-11037&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">AlexaFluor 594 goat-anti-mouse</td>
			<td style="width:181px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">&#160;#A-11005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">AlexaFluor 488 chicken-anti-rabbit</td>
			<td style="width:181px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">#A-21441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">AlexaFluor 488 goat-anti-mouse</td>
			<td style="width:181px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">#A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:299px;">Secondary antibodies (HRP)</td>
			<td style="width:181px;">Dako</td>
			<td style="width:175px;">Envision + System - HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit and Anti-Mouse</td>
			<td>undiluted</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:181px;">Prodotti Chimicie Alimentari</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>Decellularization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Stratification media</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium&#160;</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Ham&#8217;s F12&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">10% fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">100U/mL penicillin and 100U/mL streptomycin&#160;&#160;</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">0.4mg/mL hydrocortisone&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">5mg/mL insulin</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">1.8&#183;10-4 M adenine&#160;&#160;</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">5mg/mL transferrin&#160;</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">2&#183;10- 11 M triiodothyronine&#160;</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Trypsin</td>
			<td style="width:181px;">Biopolis Shared Facilities</td>
			<td style="width:175px;">0.125% Trypsin/Versene&#160;&#160; pH 7.0 + 0.3&#160;</td>
			<td>Used to trypsinize cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving 2d and 3d skin in vitro models using macromolecular crowding

משפחת גליקופרוטאין של collagens מייצג את חלבונים מבניים העיקרי בגוף האדם, והם מרכיבים מרכזיים של חומרים ביולוגיים בשימוש בהנדסת רקמות המודרנית. צוואר בקבוק טכני הוא בתצהיר של קולגן במבחנה, כפי שהוא איטי לשמצה, וכתוצאה מכך ההיווצרות תת אופטימלי של רקמות חיבור ולכידות רקמות שלאחר מכן, במיוחד במודלי עור. כאן, אנו מתארים שיטה אשר תהיה כרוכה בתוספת-פולימרים שיתוף סוכרוז דיפרנציאלי בגודל לתרבויות העור לייצר macromolecular מצטופפים (MMC), שתוצאתה לשדרוג דרמטי של בתצהיר קולגן. במיוחד, פיברובלסטים העור שהופקדו כמות משמעותית של קולגן I / IV / VII ו- פיברונקטין תחת MMC בהשוואה לקבוצת ביקורת. הפרוטוקול גם מתואר שיטה decellularize שכבות תאים צפופות, חשיפת כמויות משמעותיות של תאי מטריקס (ECM) אשר נשמרו על פני שטח התרבות כפי שמעיד immunocytochemistry. דפוס המוני והפצת מטריקס סה&quot;כ נחקר באמצעות מיקרוסקופ הפרעת השתקפות. מעניין, פיברובלסטים, קרטינוציטים ושיתוף תרבויות המיוצר מטריצות תאים שמקורם (CDM) של משתנים הרכב ומורפולוגיה. CDM יכול לשמש &quot;ביו-פיגומים&quot; עבור זריעת תאים משנית, שבהם השימוש הנוכחי של ציפוי או פיגומים, בדרך כלל מן חי xenogenic, ניתן להימנע, ובכך לנוע לעבר יישומים קליניים רלוונטי יותר. בנוסף, פרוטוקול זה מתאר את היישום של MMC בשלב השקוע של מודל התרבות שיתוף עור 3D-organotypic שהיה מספיק כדי לשפר בתצהיר ECM בצומת דרמו-אפידרמיס (DEJ), בפרט, קולגן VII, המרכיב העיקרי עיגון סיבים. במיקרוסקופ אלקטרונים אישר את נוכחותו של עיגון הסיבים בתרבויות פותח עם MMC, בהשוואה לקבוצת הביקורת. זה משמעותי כמו סיבי עיגון לקשור הדרמיס לאפידרמיס, ומכאן,בעל DEJ הבוגר מראש יצר עשויה להועיל מקבלי שתל עור מבחינת יציבות שתל וריפוי פצע כולל. יתר על כן, זמן התרבות היה מרוכז מ -5 שבועות עד 3 שבועות כדי לקבל מבנה בוגר, בעת שימוש MMC, הפחתת עלויות.

הצפיפות Macromolecular הצליח לשפר בתצהיר ECM, בפרט, פיברובלסטים שהופקדו ככל שאני קולגן, IV ו- פיברונקטין לעומת לשלוט תרבויות (איור 1, שכבת התאים; 1A, קולגן אני; 1B, קולגן IV; 1C, פיברונקטין). עם decellularization, היה ברור כי פיברובלסטים הי...

Watch this Scientific Journal Video about Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding at JoVE.com

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

אנו מציגים פרוטוקול להשיג מטריצות תאים שמקורם עשירות בחלבונים תאים מטריקס, באמצעות crowders macromolecular (MMC). בנוסף, אנו מציגים פרוטוקול אשר משלב MMC בדור העור 3D organotypic שיתוף התרבות, אשר מקטין את זמן תרבות תוך שמירה לפדיון של מבנה.

עור 2D and 3D שיפור<em&gt; במבחנה</em&gt; מודלים שימוש להצטופפות מולקולארית

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

לדמיין חלבונים מכלולים Macromolecular על ידי א.מ. כתמים שליליות: החל הכנה רשת הרכישה תמונה

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

שדה חשמלי מבוקר בימוי הגירה של ובתאים עצביות בסביבות 2 ד ו 3D

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

דפוסי שיתוף תרבות נייד באמצעות מערכות מימיות שני שלבים

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

מדידת אורך של תאי מטריקס קשיחות במודלי גידול 3D באמצעות Microrheology מעקב חלקיקים

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

גירוי מבחן העין (EIT) לסיכוני זיהוי כימיקלים עיניים מעצבנים באמצעות אפיתל דגם רקמות כמו-קרנית משוחזר אדם (RHCE)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity

2D ו 3D מטריצות לחקר Invadosome לינארי גיבוש ופעילות

Cell adhesion, migration, and invasion are involved in many physiological and pathological processes. For example, during metastasis formation, tumor ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting של הסחוס, תחליפי רקמת העור ניצול פסיבים הרומן ערבוב טכניקה יחידה עבור Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

שיפור תרבויות הידרוג 3D של תאי גליה העיקרי עבור במבחנה דוגמנות של Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

במודל חוץ גופית של עורית האדם יפרטרופית צלקות באמצעות הצפיפות Macromolecular

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

דגמי כבד תלת-ממדיים מתקדמים לבדיקות גנוטוקסיות במבחנה בעקבות חשיפה ננו-חומרית לטווח ארוך

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...