Name: improving 2d and 3d skin in vitro models using macromolecular crowding
Uploaded: 2016-08-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding at JoVE.com

This work was supported by the Biomedical Research Council, Singapore through core support to the Institute of Medical Biology and grant SPF2013/005. M.R. was supported by a NUS Faculty Research Committee Grant (Engineering in Medicine) (M.R.) R-397-000-081-112, and the NUS Tissue Engineering Program (NUSTEP). The authors would like to thank Professor Irene Leigh for providing the collagen VII antibody. Electron microscopy work was carried out at the National University of Singapore Electron Microscopy Unit.

1. Macromolecular Crowding em 2D culturas de células da pele <ol><li> 50.000 células de sementeira (fibroblastos primários ou queratinócitos primários ou co-cultura de fibroblastos e queratinócitos primários) por poço de uma placa de 24 poços. Semear as células em 1 ml de meio de crescimento tipo de célula correspondente. </li><li> Permitir que as células a aderir durante a noite, numa incubadora a 37 ° C em 5% de CO 2. </li><li> Descartar a velha mídia e substituir com 1 ml de meio fresco con...

<ol>
	<li>Breitkreutz, D., Mirancea, N., Nischt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membranes+in+skin:+unique+structures+with+diverse+functions.">Basement membranes in skin: unique structures with diverse functions.</a> Histochem Cell Biol. 132 (1), 1-10 (2009).</li><li>Lane, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mutation+in+the+conserved+helix+termination+peptide+of+keratin+5+in+hereditary+skin+blistering.">mutation in the conserved helix termination peptide of keratin 5 in hereditary skin blistering.</a> Nature. 356 (6366), 244-246 (1992).</li><li>Fuchs, E., Raghavan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+under+the+skin+of+epidermal+morphogenesis.">Getting under the skin of epidermal morphogenesis.</a> Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).</li><li>Niessen, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junctions/adherens+junctions:+basic+structure+and+function.">Tight junctions/adherens junctions: basic structure and function.</a> J Invest Dermatol. 127 (11), 2525-2532 (2007).</li><li>Jarvelainen, H., Sainio, A., Koulu, M., Wight, T. N., Penttinen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+molecules:+potential+targets+in+pharmacotherapy.">Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy.</a> Pharmacol Rev. 61 (2), 198-223 (2009).</li><li>Schaefer, L., Schaefer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteoglycans:+from+structural+compounds+to+signaling+molecules.">Proteoglycans: from structural compounds to signaling molecules.</a> Cell Tissue Res. 339 (1), 237-246 (2010).</li><li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> J Cell Sci. 123 (Pt 24), 4195-4200 (2010).</li><li>Ghalbzouri, A., Jonkman, M., Dijkman, R., Ponec, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membrane+reconstruction+in+human+skin+equivalents+is+regulated+by+fibroblasts+and/or+exogenously+activated+keratinocytes.">Basement membrane reconstruction in human skin equivalents is regulated by fibroblasts and/or exogenously activated keratinocytes.</a> J Invest Dermatol. 124 (1), 79-86 (2005).</li><li>Lareu, R. R., Arsianti, I., Harve, K. S., Peng, Y. X., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Enhancement+of+Collagen+Matrix+Formation+and+Crosslinking+for+Applications+in+Tissue+Engineering--a+Preliminary+Study.">In Vitro Enhancement of Collagen Matrix Formation and Crosslinking for Applications in Tissue Engineering--a Preliminary Study.</a> Tiss Eng. 13 (2), 385-391 (2007).</li><li>Lareu, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+matrix+deposition+is+dramatically+enhanced+in+vitro+when+crowded+with+charged+macromolecules:+the+biological+relevance+of+the+excluded+volume+effect.">Collagen matrix deposition is dramatically enhanced in vitro when crowded with charged macromolecules: the biological relevance of the excluded volume effect.</a> FEBS Lett. 581 (14), 2709-2714 (2007).</li><li>Lareu, R. R., Harve, K. S., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emulating+a+crowded+intracellular+environment+in+vitro.+dramatically+improves+RT-PCR+performance.">Emulating a crowded intracellular environment in vitro. dramatically improves RT-PCR performance.</a> Biophys Biochem Res Comm. 363 (1), 171-177 (2007).</li><li>Harve, K. S., Ramakrishnan, V., Rajagopalan, R., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+crowding+in+vitro+as+means+of+emulating+cellular+interiors:+when+less+might+be+more.">Macromolecular crowding in vitro as means of emulating cellular interiors: when less might be more.</a> Proc Natl Acad USA Sci. 105 (51), E119 (2008).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Scar-in-a-Jar:+Studying+antifibrotic+lead+compounds+from+the+epigenetic+to+extracellular+level+in+a+single+well.">The Scar-in-a-Jar: Studying antifibrotic lead compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well.</a> Br J Pharmacol. 158 (5), 1196-1209 (2009).</li><li>Harve, K. S., Lareu, R., Rajagopalan, R., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+how+the+crowded+interior+of+cells+stabilizes+DNA/DNA+and+DNA/RNA+hybrids-in+silico+predictions+and+in+vitro+evidence.">Understanding how the crowded interior of cells stabilizes DNA/DNA and DNA/RNA hybrids-in silico predictions and in vitro evidence.</a> Nucleic Acids Res. 38 (1), 172-181 (2009).</li><li>Satyam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+crowding+meets+tissue+engineering+by+self-assembly:+A+paradigm+shift+in+regenerative+medicine.">Macromolecular crowding meets tissue engineering by self-assembly: A paradigm shift in regenerative medicine.</a> Adv Mat. 26 (19), 3024-3034 (2014).</li><li>Chen, C. Z. C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+macromolecular+crowding+to+enhance+extracellular+matrix+deposition+and+its+remodeling+in+vitro+for+tissue+engineering+and+cell-based+therapies.">Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies.</a> Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 277-290 (2011).</li><li>Rashid, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+use+for+Polyvinylpyrrolidone+as+a+Macromolecular+Crowder+for+Enhanced+Extracellular+Matrix+Deposition+and+Cell+Proliferation.">Novel use for Polyvinylpyrrolidone as a Macromolecular Crowder for Enhanced Extracellular Matrix Deposition and Cell Proliferation.</a> Tiss Eng C. , (2014).</li><li>Dewavrin, J. Y., Hamzavi, N., Shim, V. P. W., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+the+Architecture+of+3D+Collagen+Hydrogels+by+Physiological+Macromolecular+Crowding.">Tuning the Architecture of 3D Collagen Hydrogels by Physiological Macromolecular Crowding.</a> Acta Biomaterialia. 10 (10), 4351-4359 (2014).</li><li>Dewavrin, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+Rate+Boosting+of+Collagen+Fibrillogenesis+in+Heterogeneous+Mixtures+of+Crowding+Agents.">Synergistic Rate Boosting of Collagen Fibrillogenesis in Heterogeneous Mixtures of Crowding Agents.</a> J Phys Chem B. 119 (12), 4350-4358 (2015).</li><li>Auger, F. A., Berthod, F., Moulin, V., Pouliot, R., Germain, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineered+skin+substitutes:+from+in+vitro+constructs+to+in+vivo+applications.">Tissue engineered skin substitutes: from in vitro constructs to in vivo applications.</a> Biotechnol Appl Biochem. 39, 263 (2004).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+crowding+effect+on+cartilaginous+matrix+production:+a+comparison+of+two-dimensional+and+three-dimensional+models.">Macromolecular crowding effect on cartilaginous matrix production: a comparison of two-dimensional and three-dimensional models.</a> Tiss Eng Part C Methods. 19 (8), 586-595 (2013).</li><li>Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., van Vliet, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+crowding+directs+extracellular+matrix+organization+and+mesenchymal+stem+cell+behavior.">Macromolecular crowding directs extracellular matrix organization and mesenchymal stem cell behavior.</a> PLOS One. 7 (5), e37904 (2012).</li><li>Kumar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecularly+crowded+in+vitro+microenvironments+accelerate+the+production+of+extracellular+matrix-rich+supramolecular+assemblies.">Macromolecularly crowded in vitro microenvironments accelerate the production of extracellular matrix-rich supramolecular assemblies.</a> Scientific Reports. 5, 8729 (2015).</li><li>Ang, X. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+crowding+amplifies+adipogenesis+of+human+bone+marrow-derived+MSCs+by+enhancing+the+pro-adipogenic+microenvironment.">Macromolecular crowding amplifies adipogenesis of human bone marrow-derived MSCs by enhancing the pro-adipogenic microenvironment.</a> Tiss Eng Part A. 20 (5-6), 966-981 (2014).</li><li>Peng, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Fibroblast+Matrices+Bioassembled+Under+Macromolecular+Crowding+Support+Stable+Propagation+Of+Human+Embryonic+Stem+Cells.">Human Fibroblast Matrices Bioassembled Under Macromolecular Crowding Support Stable Propagation Of Human Embryonic Stem Cells.</a> J Tiss Eng Regen Med. 6 (10), e74-e84 (2012).</li><li>Benny, P., Badowski, C., Lane, E. B., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+More+Matrix:+Enhancing+the+deposition+of+dermal-epidermal+junction+components+in+vitro+and+accelerating+organotypic+skin+culture+development,+using+macromolecular+crowding.">Making More Matrix: Enhancing the deposition of dermal-epidermal junction components in vitro and accelerating organotypic skin culture development, using macromolecular crowding.</a> Tiss Eng A. 21 (1-2), 182-192 (2015).</li></ol>

Enhanced extracellular matrix is obtained upon introduction of macromolecular crowders to cell culture, owing to the excluded volume effect which increases the propeptide cleavage by proteinases. This results in extracellular matrix, in particular collagen, to be processed faster and deposited on the culture surface. While other groups have obtained thick fibroblast cell layers, it involved a culture time of several weeks20. In contrast, MMC described in this Protocol, dramatically shortens the culture time wh...

A pele constitui uma barreira de protecção, impedindo a perda de água e entrada de agentes patogénicos. Ele é constituído por três componentes principais; derme ricos do estroma 1, uma epiderme estratificada 2,3,4 em cima dela, e a junção dermo-epidérmica entre 5,6. A derme é composta em grande parte de colágeno e fibras elásticas e é pouco povoada com fibroblastos 7. Em contraste, a epiderme rica de células é constituída por várias camadas de queratinócitos. Os queratinócitos da camada mais interior são proliferativa e fornecer novas células basais que renovam e substituir os queratinócitos terminalmente diferenciados que movem-se constantemente para o mais exterior da camada da pele e perderam os seus núcleos e o material citoplasmático, resultando numa camada córnea que sofre descamação. A junção dérmico-epidérmica, um tipo específico de membrana basal, é uma estrutura complexa composta por moléculas que interligam matriz, que tethers da epiderme para a derme. fibras de colágeno I da derme entrelaçado com o colágeno VII fibrilas de ancoragem que são ancorados ao colágeno IV rica lâmina densa. filamentos de ancoragem (laminina 5, XVII colágeno e integrinas), por sua vez ligar a lâmina densa com hemidesmossomos de queratinócitos basais. Os queratinócitos basais (stratum basale) têm a capacidade de proliferar e renovar, bem como diferenciar e estratificar para formar as camadas suprabasais; estrato espinhoso, estrato granuloso, e, finalmente, o estrato córneo, que constitui a superfície de contacto da pele com o meio ambiente. No caminho a partir da camada basal até à camada córnea, queratinócitos mudar os padrões de citoqueratinas de expressão e, por fim, sofrem apoptose e encerram-se em cornificado envelopes, cascos de proteínas específicas que são covalentemente reticulados pela actividade da transglutaminase. Recriando pele e suas camadas, in vitro, incluindo as estruturas complexas do<html> junção dermo-epidérmica e dérmica matriz extracelular, e emular o processo de queratinização, tem cientistas longa intrigado e bioengenheiros como uma tarefa desafiadora. Tem havido avanços significativos na engenharia de tecido de pele, por exemplo, a extracção com êxito de células da pele de biópsias de pacientes e a geração de culturas organotípicas pele usando células da pele derivada de paciente 8. No entanto, permanecem por resolver problemas relativos à pobre secreção de proteínas da matriz extracelular pelas células da pele si e resultando em modelos de pele sub-óptimas. Além disso, o tempo necessário para gerar a co-cultura organotípica pele 3D utilizando protocolos correntes varia entre quatro a oito semanas, um período de tempo, que poderia, potencialmente, ser encurtado com a incorporação de Crowders macromoleculares. Reduzindo o tempo de cultura economiza custos reagente, reduz a incidência de senescência celular e reduz o tempo de espera do paciente o produto deve ser utilizado na prática clínica. t &quot;&gt; Macromoleculares aglomerando (MMC) envolve a introdução de macromoléculas específicas para o meio de cultura para gerar efeitos de volume excluído. Isto afecta as taxas de reacção enzimáticas, incluindo a clivagem proteolítica da pró-colagénio que é tardia sob condições de cultura padrão aquosas 9-13. De acordo com MMC, as reacções enzimáticas são apressou sem aumentar a quantidade de reagentes 14,15 resultantes em, no caso de clivagem de pró-colagénio, um aumento da quantidade de colagénio I moléculas em culturas cheio como comparado com os controlos sem aglomeração 10. à medida que a conversão de pró-colagénio de colagénio permite a formação de colagénio assembléias, fibroblastos cultivados com MMC durante 48 horas produziu significativamente mais colágeno I, em comparação com culturas de fibroblastos desertas monitorados por até quatro semanas 11,16,17. Além dos efeitos sobre as atividades enzimáticas que afetam a formação, estabilização e remodelação de ECM, MMC também foi mostrado para melhorar directamente e modulam colagénioformação de fibras 18,19. Apresentamos aqui um método para aumentar a produção de matriz extracelular (ECM) por células da pele, em particular, fibroblastos da derme e queratinocitos epidérmicos. Além disso, mostramos que a ECM enriquecido produzido sob MMC em culturas em monocamada pode ser descelularizados e usado como matriz derivada de células puro (MDL). Nós usamos uma abordagem não convencional para visualizar e apreciar plenamente a ECM depositado por células da pele cultivadas com MMC. microscopia de interferência de reflexão é tipicamente utilizada para estudar as interacções célula-matriz ou pontos de contacto célula-a-vidro. Esta técnica foi utilizada no nosso sistema para visualizar a quantidade total de matriz depositado na superfície do vidro. microscopia de interferência reflexão foi acoplado com imunocoloração fluorescente para obter a maior quantidade de informação em termos de composição da matriz extracelular e o padrão, na presença e ausência de MMC. Organotypic pele co-culturas é um método clássico para modelar a pele in vitro num contexto tridimensional. Enquanto bidimensionais co-culturas podem fornecer informação significativa, é limitado ao traduzir estes dados e aplicando-a de volta para um ambiente in vivo, o que é inerentemente uma estrutura tridimensional. queratinócitos da pele, em particular, são polarizados e contêm segmentos apicais e basais, que são essenciais para a homeostase e adesão celular. Além disso, a expressão de proteínas nos queratinócitos suprabasais típicos acima da camada basal, tais como queratina 1, queratina 10 e filagrina só está presente no decurso da estratificação e diferenciação terminal de queratinócitos. Como diferenciação terminal é dificilmente presente em culturas em monocamada típicos, a expressão da proteína suprabasal normalmente não é conseguido no presente sistema de cultura. Portanto, as culturas organotípicas de começar submerso em meio de cultura, mas são, então, levantada para uma interface ar-líquido para dirigir keratinocyte diferenciação. Isto resulta na expressão de marcadores de estratificação, mesmo cornificaï¿½o e geralmente melhor reflexão da fisiologia epidérmica. Enquanto outros grupos têm gerado anteriormente pele organotï¿½ica co-culturas com sucesso, o estabelecimento de uma zona de junção dermo-epidérmica funcional tem sido um problema. Aqui, apresentamos um novo método para a cultura de pele organotï¿½ica co-culturas com uma membrana basal melhorada, num período de tempo condensado e sem comprometer a maturidade dessas construções. Isso proporcionaria miméticos da pele para modelar in vitro, o estudo da biologia da pele e uma variedade de ensaios de rastreio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1154">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:181px;">Wako</td>
			<td style="width:175px;">013-12061</td>
			<td style="width:499px;">Cell culture media additive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture inserts&#160; (6-well format)</td>
			<td style="width:181px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:175px;">657610</td>
			<td>Organotypic cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Citrate solution</td>
			<td style="width:181px;">Dako</td>
			<td style="width:175px;">S2369</td>
			<td style="width:499px;">DakoCytomation Target Retrieval Solution Citrate, pH 6 (x10)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Collagen (rat tail)</td>
			<td style="width:181px;">Corning</td>
			<td style="width:175px;">354236</td>
			<td>Organotypic cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">CnT-57&#160;</td>
			<td style="width:181px;">CELLnTEC</td>
			<td style="width:175px;">CnT-57</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">DAB Substrate + chromogen kit</td>
			<td style="width:181px;">Dako</td>
			<td style="width:175px;">K3468</td>
			<td>Histology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Deep-well plate (6-well format)</td>
			<td style="width:181px;">Corning</td>
			<td style="width:175px;">355467</td>
			<td>Organotypic cultures</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">ECL detection reagent</td>
			<td style="width:181px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:175px;">RPN2106</td>
			<td>Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Electron microscope (TEM)</td>
			<td>&#160;JEOL&#160;</td>
			<td>&#160;JEM-1010 (100kV)</td>
			<td>Transmission electron microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Fibroblast media (FM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>High Glucose-DMEM + 10% Fetal Bovine Serum + 1% Penicillin Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Ficoll PM70</td>
			<td style="width:181px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:175px;">17-0310-05</td>
			<td>Macromolecular crowder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Ficoll PM400</td>
			<td style="width:181px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:175px;">17-0300-05</td>
			<td>Macromolecular crowder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Keratinocyte serum-free media (KSFM)</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:175px;">17005-042</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Lysis buffer</td>
			<td style="width:181px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">89900</td>
			<td style="width:499px;">Lysis buffer for protein extraction. A protease inhibitor (Roche, #11836170001) was added to this lysis buffer.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Microscope</td>
			<td style="width:181px;">Zeiss</td>
			<td style="width:175px;">LSM510</td>
			<td style="width:499px;">Red, green and blue channels to visualize AF594, AF488 and DAPI fluorescent immunostainings (40X mag).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Mounting media (Hydromount)</td>
			<td style="width:181px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:175px;">HS-106</td>
			<td>Fluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Mounting media (Cytoseal)</td>
			<td style="width:181px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">8310-16</td>
			<td>Histology (HRP)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">OCT compound (Tissue Tek)</td>
			<td style="width:181px;">Sakura</td>
			<td style="width:175px;">4583</td>
			<td>Embedding for cryotomy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Penicillin-streptomycin antibiotics</td>
			<td style="width:181px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">A5955</td>
			<td>Cell culture media additive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Primary antibodies</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-Collagen I antibody</td>
			<td style="width:181px;">Abcam</td>
			<td style="width:175px;">#ab6308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-Collagen Type IV</td>
			<td style="width:181px;">Novocastra</td>
			<td style="width:175px;">#NCL-COLL-IV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-collagen VII</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>LH7.2 (in house)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-Fibronectin antibody</td>
			<td style="width:181px;">Abcam</td>
			<td style="width:175px;">#ab2413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Reducing agent&#160;</td>
			<td style="width:181px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">NP0009</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Sample buffer</td>
			<td style="width:181px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">NP0008</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Secondary antibodies (Immunostaining)</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td style="width:181px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">#D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">AlexaFluor 594 goat-anti-rabbit</td>
			<td style="width:181px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">#A-11037&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">AlexaFluor 594 goat-anti-mouse</td>
			<td style="width:181px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">&#160;#A-11005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">AlexaFluor 488 chicken-anti-rabbit</td>
			<td style="width:181px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">#A-21441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">AlexaFluor 488 goat-anti-mouse</td>
			<td style="width:181px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">#A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:299px;">Secondary antibodies (HRP)</td>
			<td style="width:181px;">Dako</td>
			<td style="width:175px;">Envision + System - HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit and Anti-Mouse</td>
			<td>undiluted</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:181px;">Prodotti Chimicie Alimentari</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>Decellularization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Stratification media</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium&#160;</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Ham&#8217;s F12&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">10% fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">100U/mL penicillin and 100U/mL streptomycin&#160;&#160;</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">0.4mg/mL hydrocortisone&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">5mg/mL insulin</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">1.8&#183;10-4 M adenine&#160;&#160;</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">5mg/mL transferrin&#160;</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">2&#183;10- 11 M triiodothyronine&#160;</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Trypsin</td>
			<td style="width:181px;">Biopolis Shared Facilities</td>
			<td style="width:175px;">0.125% Trypsin/Versene&#160;&#160; pH 7.0 + 0.3&#160;</td>
			<td>Used to trypsinize cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving 2d and 3d skin in vitro models using macromolecular crowding

A família das glicoproteínas de colágenos representa as principais proteínas estruturais do corpo humano, e são componentes essenciais de biomateriais utilizados em engenharia de tecidos modernos. Um gargalo técnica é a deposição de colagénio in vitro, como é notoriamente lenta, resultando numa sub-óptima formação de tecido conjuntivo e subsequente coesão tecido, particularmente em modelos de pele. Aqui, nós descrevemos um método que envolve a adição de co-polímeros de sacarose diferencialmente porte a culturas de pele para gerar macromolecular aglomerando (MMC), o que resulta num aumento dramático da deposição de colagénio. Particularmente, os fibroblastos dérmicos depositada uma quantidade significativa de colagénio I / IV / VII e fibronectina sob MMC em comparação com os controlos. O protocolo também descreve um método para decellularize camadas de células aglomeradas, expondo quantidades significativas de matriz extracelular (ECM), que foram retidas na superfície da cultura como evidenciado por immunocyimuno. Total de padrão de massa de matriz e distribuição foi estudada usando microscopia de interferência reflexão. matrizes Curiosamente, f ibroblastos, queratinócitos e co-culturas produzidas derivadas de células (CDM) de composição variada e morfologia. MDL podem ser usados ​​como &quot;bio-andaimes para&quot; semear célula secundária, em que a utilização actual de revestimentos ou andaimes, tipicamente a partir de fontes animais xenogénicas, pode ser evitado, movendo-se assim, para aplicações mais clinicamente relevante. Além disso, este protocolo descreve a aplicação de MMC durante a fase submersa de um modelo 3D-organotípicas pele de co-cultura que foi suficiente para aumentar a deposição de ECM na junção dermo-epidérmica (JDE), em particular, colagénio VII, o componente principal das fibrilas de ancoragem. A microscopia eletrônica confirmou a presença das fibrilas de ancoragem em culturas desenvolvidas com MMC, em comparação aos controles. Isto é significativo como fibrilas de ancoragem amarrar da derme para a epiderme, daí,tendo um pré-formado madura JDE podem beneficiar receptores de enxertos de pele em termos de estabilidade do enxerto e da cura de feridas em geral. Além disso, o tempo de cultura foi condensado a partir de 5 semanas a 3 semanas para obter uma construção madura, quando se utiliza MMC, reduzindo os custos.

Aglomeração macromolecular foi capaz de aumentar a deposição de ECM, em particular, fibroblastos depositado mais colagénio I, IV e fibronectina, em comparação com culturas de controlo (Figura 1, camada celular; 1A, colagénio I; 1B, colagénio IV; 1C, fibronectina). Após a descelularização, era evidente que os fibroblastos eram os principais depositantes de colagénio I, IV e fibronectina, em comparação com o...

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Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Apresenta-se um protocolo para obter matrizes derivadas de células ricas em proteínas da matriz extracelular, utilizando Crowders macromoleculares (MMC). Além disso, apresentamos um protocolo que incorpora MMC na geração de co-cultura de pele organotï¿½ica 3D, o que reduz o tempo de cultura, mantendo a maturidade da construção.

Melhorar 2D e 3D Pele<em&gt; In Vitro</em&gt; Models Usando Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

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